1 Большакова Л.С. 1 Милентьев В.Н. 2 Санников Д.П. 3 Казьмин В.М. 2

1 ФГБОУ ВПО «Орловский государственный институт экономики и торговли»

2 ФГБУ «Центр химизации и сельскохозяйственной радиологии «Орловский»

3 ФГБОУ ВПО «Государственный университет – учебно-научно-производственный комплекс»

Исследована возможность использования хемилюминесценции для оценки антиоксидантной активности пищевых веществ. Предлагаемый способ основан на хемилюминесценции люминола в щелочной среде, интенсивность которой зависит от количества пероксидов в хемилюминесцентной пробе. Хемилюминесценцию регистрировали с помощью разработанной установки, содержащей насос-дозатор, светонепроницаемую камеру, стеклянный вакуумный фотоумножитель, компьютерную систему. Для усиления хемилюминесценции к люминолу добавляли раствор железосинеродистого калия. Изменения интенсивности хемилюминесценции фиксировали в момент введения анализируемой пробы в раствор люминола. В качестве анализируемой пробы использовали экстракт одуванчика, полученный путем сухой низкотемпературной перегонки. В его состав входят фенольные соединения, известные своей высокой антиоксидантной активностью. Установлено, что метод хемилюминесценции может быть использован для определения антиоксидантных свойств различных пищевых соединений.

Библиографическая ссылка

Паничкин А.В., Большакова Л.С., Милентьев В.Н., Санников Д.П., Казьмин В.М. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ АНТИОКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ ПИЩЕВЫХ ВЕЩЕСТВ // Рациональное питание, пищевые добавки и биостимуляторы. – 2014. – № 6. – С. 36-37;
URL: http://journal-nutrition.ru/ru/article/view?id=283 (дата обращения: 17.12.2019). Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»

дипломная работа

1.4 Методы исследования антиоксидантов

антиоксидантной активности классифицируются: по способам регистрации проявляемой АОА (волюмометрические, фотометрические, хемилюминесцентные, флуоресцентные, электрохимические); по типу источника окисления; по типу окисляемого соединения; по способу измерения окисленного соединения.

Однако наиболее известными методами определения антиоксидантной активности являются:

1 TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity): метод основан на следующей реакции:

Метмиоглобин + Н 2 О 2 >Феррилглобин +ABTS>ABTS*+АО.

Метод определения эквивалентов Тролокса (TEAC) основан на способности антиоксидантов восстанавливать радикальные катионы 2,2-азинобиса (ABTS) и тем самым ингибировать поглощение в длинноволновой части спектра (600 нм). Существенным недостатком метода является двухступенчатая реакция получения радикала. Это удлиняет время проведения анализа и может увеличить разброс результатов, несмотря на то, что для анализа используют стандартизированный набор реактивов .

2 FRAP (ferric reducing antioxidant power): метод основан на следующей реакции:

Fe(III)-Трипиридитриазин+АО>Fe(II)-Трипиридилтриазин.

Железовосстанавливающая/антиоксидантная способность (FRAP). Здесь используется реакция восстановления Fe(III)-трипиридилтриазина до Fe(II)-трипиридилтриазина . Однако этим методом невозможно определение некоторых антиоксидантов, например глутатиона. Этот метод позволяет прямое определение низкомолекулярных антиоксидантов. При низких рН восстановление Fe(III)-трипиридилтриазинового комплекса в Fe(II)-комплекс сопровождается появлением интенсивно голубой окраски. Измерения основаны на способности антиоксидантов подавлять окислительный эффект реакционных частиц, генерируемых в реакционной смеси. Этот метод отличается простотой, быстротой и небольшими затратами при исполнении.

3 ORAC (oxygen radical absorbance capacity): метод основан на следующей реакции:

Fe(II)+H 2 O 2 >Fe(III) + OH*+AO>OH* + Люминол.

Определение способности абсорбировать кислородные радикалы (ORAC). В этом методе регистрируют флуоресценцию субстрата (фикоэритрина или флуоресцеина), которая возникает в результате его взаимодействия с АФК. Если в исследуемом образце есть антиоксиданты, то наблюдают уменьшение флуоресценции по сравнению с контрольным образцом . Первоначально этот метод был разработан доктором Гохуа Као в Национальном институте старения в 1992 г. В 1996 году доктор Као объединился с доктором Рональдом Прайером в совместную группу в Исследовательском центре старения USDA, где был создан полуавтоматический метод .

4 TRAP (total radical trapping antioxidant parameter) : метод основан на следующей реакции:

AAPH+AO>AAPH* + ФЛ (ФЭ).

В этом методе используют способность антиоксидантов взаимодействовать с пероксильным радикалом 2,2- азобис(2-амидинопропан) дигидрохлорид (ААРН). Модификации TRAP состоят в способах регистрации аналитического сигнала. Чаще всего на завершающей стадии анализа перокси-радикал ААРН взаимодействует с люминисцирующим (люминол), флуоресцирующим (дихлорфлюоресцин-диацетат, DCFH-DA) или другим оптически активным субстратом.

В качестве стандарта для методов TEAC, ORAC и TRAP используют водорастворимое производное витамина Е - Trolox (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбокси кислоту).

В последнее время для оценки антиоксидантной активности возрос интерес к применению электрохимических методов. Эти методы обладают высокой чувствительностью, быстротой анализа.

Оценку антиоксидантной активности некоторых пищевых продуктов проводят методом потенциометрии, основанном на использование свойства веществ-антиоксидантов участвовать в окислительно-восстановительных реакциях за счет енольных (-ОН) и сульфгидрильных (-SH) групп.

Определение антиоксидантных свойств растворов основано на химическом взаимодействии антиоксидантов с медиаторной системой, которое приводит к изменению ее окислительно-восстановительного потенциала. Электрохимическая ячейка представляет собой емкость, содержащую K-Na-фостфатный буферный раствор, медиаторную систему Fe(III)/Fe(II) и комплексный электрод до измерения окислительно-восстановительного потенциала. Антиоксидантную активность оценивают в г-экв/л.

Амперометрический метод определения антиоксидантной активности основан на измерении электрического тока, возникающего при окислении исследуемого вещества на поверхности рабочего электрода, находящегося под определенным потенциалом. Чувствительность амперометрического способа определяется как природой рабочего электрода, так и потенциалом, приложенном к нему. Предел обнаружения амперометрического детектора полифенолов, флавоноидов на уровне нано-пикограммов,при таких малых концентрациях меньшая вероятность взаимного влияния разных антиоксидантов при их совместном присутствии, в частности проявление явления синергизма. К недостаткам способа можно отнести его специфичность: в данных условиях не могут быть проанализированы антиоксиданты, которые сами окисляются или восстанавливаются в области потенциалов электровосстановления кислорода. К достоинствам способа можно отнести его экспрессность, простату и чувствительность .

Метод гальваностатической кулонометрии с помощью электрогенерированных окислителей - метод применим для анализа жирорастворимых антиоксидантов .

Разработаны различные способы определения аскорбиновой кислоты:

амперометрический способ с использованием алюминиевого электрода, модифицированного пленкой гексацианоферрата никеля (II), методом простого погружения в раствор;

способ твердофазно-спектрофотометрического и визуального тест-определения аскорбиновой кислоты с использованием в качестве индикаторного порошка ксерогеля кремниевой кислоты, модифицированного реактивом Вавеле и медью (II);

хемилюминесцентное определение аскорбиновой кислоты можно провести проточно-инжекционным методом по хемилюминесцентной реакции родамина В с церием (IV) в сернокислой среде .

определение аскорбиновой кислоты в диапазоне 10 -8 -10 -3 г/см 3 методом анодной вольтамперометрии в водных и водно-органических средах.

Наиболее распространенным является метод FRAP, так как он экспрессен, высокочувствителен. За последние несколько десятилетий было разработано большое количество разновидностей методик определения антиоксидантной активности методом FRAP(таблица 1).

Таблица 1 Развитие метода FRAP и его применение для определения антиоксидантной активности разных объектов

	Объекты анализа	Примечания
	Плазма крови	t=4мин. Изучены стехиометрия реакции и аддитивность.
	Чай, вино	Определение АОА, обусловленной полифенолами
		Сопоставлены значения АОА разных сортов чая
Pulido,Bravo,Saura-Calixto	Модель-ные растворы	t=30мин. Выявлено влияние неводного растворителя
	Растения
	Кровь, ткани	Метод ПИА. Проверено влияние посторонних веществ.
Firuzi,Lacanna, Petrucci e.a.	Модель-ные растворы	Изучена чувствительность определения разных АО как функция их структуры и редокс-потенциала.
Katalinic, Milos,	Разные вина
Темердашев, Цюпко и др.	Модель-ные смеси
Логинова, Коновалова	Лекарств. Препара-ты	Тест-метод
Темердашев, Цюпко и др.	Красные сухие вина	Корреляция АОА с другими показателями качества вин
Продолжение таблицы 1
	Модель-ные смеси	Изучена чувствительность определения разных АО
Вершинин, Власова, Цюпко	Модель-ные смеси	Выявлена неаддитивность сигнала при недостатке окислителя
Анисимович, Дейнека и др.	Модель-ные растворы	Предложены кинетические параметры оценки АОА.

Примечания: условно обозначено: ПИА-проточно-инжекционный анализ, TPTZ-трипиридилтриазин, DIP-2,2 , -дипиридил, PHEN-о-фенантролин, DPA-пиридиндикарбоновая кислота, FZ-феррозин, АК-аскорбиновая кислота, КТ-катехол, t-время экспозиции, мин.

Взаимодействие между белками и полиэлектролитами в водных растворах

Для характеристики белок-полиэлктролитных комплексов используют различные методы анализа. Инструментальные методы дают информацию по структурным и оптическим свойствам, а также определяют динамику и характер связывания ПЭК...

Влияние соединений d-металлов на скорость диссоциации молекулы воды в биполярной мембране

В процессе синтеза новых БПМ большое внимание должно быть уделено исследованию свойств полученных образцов для последующего выбора условий синтеза, обеспечивающих улучшение электрохимических характеристик синтезируемых мембран...

Дизайнерские наркотики и синтетические каннабиноиды

Обнаружение синтетических каннабиноидов в растительных смесях может быть осуществлено различными физико-химическими методами, такими как хромато-масс-спектрометрия, газовая, тонкослойная и высокоэффективная жидкостная хроматографии...

Разработка методики определения флавоноидов в лекарственном растительном сырье

Синтез и фармакологические свойства хинолинонов-2

Объект исследования: Хинолинон-2. Метод исследования: С помощью компьютерной программы «Marvin JS», была создана структура вещества. Далее она была отправлена сайт «http://www.way2drug.com/PASSOnline/predict.php» для дальнейшего исследования...

Термоспектральный метод исследования продуктов испарения эпоксидного полимера

Технология получения высокоочищенного хитозана из панцирей ракообразных

Определение молекулярной массы хитозана Молекулярную массу хитозана определяли вискозиметрически по стандартной методике. Растворы концентрации 0,05 и 0,5 г/дл готовили растворением навески порошка полимера в ацетатном буфере (0...

Физико-географическая характеристика территории природного парка

Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано при определении суммарной антиоксидантной активности. Способ осуществляют следующим образом: аналит взаимодействует с реагентом 0,006 М Fe(III) - 0,01 М о-фенантролин. Аскорбиновая кислота (АК) взаимодействует с таким же реагентом, который добавляют в соотношении 1:100. Далее инкубируют не менее 90 мин и фотометрируют при 510±20 нм. После этого устанавливают зависимость величины аналитического сигнала от количества вещества и расчитывают величину суммарной АОА. Представленный способ позволяет менее трудоемко и более достоверно определять суммарную антиоксидантную активность растительного сырья и пищевых продуктов на его основе. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 5 табл.

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано при определении суммарной антиоксидантной активности (АОА) растительного сырья и пищевых продуктов на его основе.

Известен кулонометрический способ определения суммарной АОА чая, основанный на взаимодействии водных экстрактов продукта с электрогенерируемыми соединениями брома (И.Ф.Абдулин, Е.Н.Турова, Г.К.Будников Кулонометрическая оценка антиоксидантной способности экстрактов чая электрогенерируемым бромом // Журн. аналит. химии. 2001. Т.56. № 6. С.627-629). Выбор в качестве титранта электрогенерированных соединений брома обусловлен их способностью вступать в различные реакции: радикальные, окислительно-восстановительные, электрофильного замещения и присоединения по кратным связям. Это позволяет охватить широкий круг биологически активных соединений чая, обладающих антиоксидантными свойствами. Недостатками способа являются возможность протекания реакции бромирования с веществами, не являющимися антиоксидантами, и выражение получаемой величины суммарной АОА в единицах количества электричества (кКл/100 г), что затрудняет оценку получаемых результатов.

Известен вольтамперометрический способ определения суммарной антиоксидантной активности по относительному изменению тока электровосстановления кислорода в интервале потенциалов от 0,0 до -0,6 В (отн. насыщ. х.с.э.) на ртутно-пленочном электроде (Пат. 2224997, Россия, МПК 7 G 01 N 33/01. Вольтамперометрический способ определения суммарной активности антиоксидантов / Короткова Е.И., Карбаинов Ю.А. - № 2002115232/12; заявл. 06.06.2002; опубл. 27.02.2004). Недостаток способа - в протекании побочных электрохимических реакций, в результате которых снижается эффективность определения антиоксидантов, что ведет к снижению достоверности результатов.

Известен способ контроля суммарной АОА профилактических и лечебных антиоксидантных средств по перекисному окислению липидов до малонового альдегида с спектрофотометрическим или хемилюминесцентным детектированием (Пат. 2182706, Россия, МПК 7 G 01 N 33/15, 33/52. Способ контроля антиокислительной активности профилактических и лечебных антиоксидантных средств / Павлюченко И.И., Басов А.А., Федосов С.Р. - № 2001101389/14; заявл. 15.01.2001; опубл. 20.05.2002). При этом антиоксидантная активность обратно пропорциональна уровню продуктов перекисного окисления липидов. Недостатком данного способа можно считать ограниченный круг анализируемых объектов, так как в данных условиях определяются антиоксиданты только одной группы - липиды.

Известен способ определения суммарной АОА экстракта растений, заключающийся в инкубации экстракта с линетолом и сульфатом железа (II), инициировании реакции окисления УФ-облучением и последующем взаимодействии с тиобарбитуровой кислотой в присутствии тритона Х-100 (Заявка 97111917/13, Россия, МПК 6 G 01 N 33/00. Способ определения общей антиокислительной активности / Рогожин В.В. - Заявл. 08.07.1997; опубл. 10.06.1999). При проведении спектрофотометрирования используется смесь этанола с хлороформом в соотношении 7:3. Значение АОА биологического материала определяют по отношению накопления продукта реакции - малонового диальдегида в пробе, содержащей экстракт, к пробе с прооксидантом. Недостаток способа заключается в возможности протекания побочных реакций при УФ-облучении, что снижает достоверность получаемых результатов анализа.

Перечисленные способы определения суммарной АОА имеют ряд недостатков: высокая трудоемкость, малая достоверность, измеренная величина суммарной АОА не отнесена и не сравнима с каким-либо общепринятым веществом.

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является способ определения суммарной АОА лекарственных растений измерением хемилюминесценции, возникающей при реакции с люминолом в присутствии окислителя пероксида водорода (М.Х.Навас, А.М.Химинец, А.Г.Асуэро Определение восстановительной способности настоек семени канарского канареечника методом хемилюминесценции // Журн. аналит. химии. 2004. Т.59. № 1. С.84-86). Для количественной оценки суммарной АОА сравнивали восстановительную способность экстракта лекарственного сырья и активность сильнодействующего антиоксиданта - аскорбиновой кислоты в количестве 25-110 мкг. По сравнению с перечисленными способами в прототипе в качестве окислителя применяют пероксид водорода, взаимодействующий с широким кругом антиоксидантов, и измеренная величина суммарной АОА объекта определяется и выражается относительно аскорбиновой кислоты, являющейся общепринятым антиоксидантом, что позволяет получать достоверные результаты при сохранении остальных недостатков. К недостаткам также следует отнести и сложность применяемого в способе оборудования.

Технической задачей заявленного изобретения является разработка менее трудоемкого и достоверного способа определения суммарной антиоксидантной активности растительного сырья и пищевых продуктов на его основе.

Для решения технической задачи предлагается взаимодействие аналита с реагентом 0,006 М Fe(III) - 0,01 М о-фенантролин, и аскорбиновой кислоты (АК) с таким же реагентом, который добавляют в соотношении 1:100, инкубируют не менее 90 мин, фотометрируют при 510±20 нм с последующим установлением зависимости величины аналитического сигнала от количества вещества и расчетом величины суммарной АОА. В частности, расчет можно осуществить по формуле (I), выведенной из уравнения количественного соответствия между исследуемым объектом и аскорбиновой кислотой:

где а, в - коэффициенты в уравнении регрессии для зависимости аналитического сигнала от количества АК;

а", в" - коэффициенты в уравнении регрессии для зависимости аналитического сигнала от количества исследуемого объекта;

х вос. - масса исследуемого восстановителя (образца), мг.

Использование предлагаемого реагента в указанных условиях позволило расширить линейный диапазон и снизить нижнюю границу определяемых количеств аскорбиновой кислоты. Предлагаемая совокупность существенных признаков позволяет определять суммарную АОА широкого круга растительного сырья и пищевых продуктов на его основе.

Уравнения количественного соответствия связывает зависимость аналитического сигнала от количества аскорбиновой кислоты и зависимость аналитического сигнала от количества исследуемого объекта при условии равной антиоксидантной активности.

После обработки результатов фотометрических измерений величины аналитического сигнала методом наименьших квадратов (К.Дерффель Статистика в аналитической химии. - М.: «Мир», 1994. С.164-169; А.К.Чарыков Математическая обработка результатов химического анализа - Л.: Химия, 1984. С.137-144) указанные зависимости были описаны линейной регрессионной функцией: y=ax+b, где а - коэффициент регрессии, b - свободный член. Коэффициент а в уравнении регрессии равен тангенсу угла наклона прямой к оси х; коэффициент b - расстоянию по оси у от начала координат (0,0) до первой точки (x 1 , y 1).

Коэффициенты а и b рассчитываются по формулам:

Уравнение регрессии для зависимости АС от количества аскорбиновой кислоты в данный момент времени имеет вид:

у АК =а·х АК (мг)+b,

уравнение регрессии для зависимости АС от количества исследуемого объекта (восстановителя):

у ВОСТ =а"·х ВОСТ (мг)+b",

где у АК, у ВОСТ - оптическая плотность фотометрируемого раствора;

х АК (мг), х ВОСТ (мг) - концентрация аскорбиновой кислоты (восстановителя) в растворе;

тогда, приравнивая значения функций, получаем формулу (I) для расчета антиоксидантной активности исследуемого объекта в единицах количества (мг) аскорбиновой кислоты.

На чертеже отражена зависимость аналитического сигнала от количества восстановителя.

Измерение оптической плотности анализируемых растворов проводили на фотоэлектроколориметре КФК-2МП.

Известно (Ф.Умланд, А.Ясин, Д.Тирик, Г.Вюнш Комплексные соединения в аналитической химии - М.: Мир, 1975. - 531 с.), что о-фенантролин образует с железом(II) растворимый в воде хелат красно-оранжевого цвета, который характеризуется максимумом поглощения при λ=512 нм. Поэтому в предлагаемом способе фотометрирование проводят при λ=510±20 нм.

Оптимизацию состава реагента и его количества, вводимого в реакцию, проводили на основании результатов многофакторного планирования эксперимента методом «Латинского квадрата», которое заключалось в изменении в каждом опыте всех изучаемых факторов, причем каждый уровень каждого фактора только один раз встречается с различными уровнями других факторов. Это позволяет выделить и оценить эффект, вызываемый каждым изучаемым фактором в отдельности.

В качестве факторов выступали: количества Fe(III), о-фенантролина и объем реагента, вводимого в реакцию. Совокупность факторов должна обеспечивать широкий диапазон линейности аналитического сигнала (АС) при достаточной чувствительности, с одной стороны, и устойчивости реагента во времени, с другой. Это позволило для каждого фактора выделить следующие уровни:

количество Fe(III): 0,003 М (A 1); 0,006 М (А 2); 0,009 М (А 3);

количество о-фенантролина: 0,01 M (B 1); 0,02 М (В 2); 0,03 М (В 3);

объем реагента: 0,5 мл (C 1); 1,0 мл (С 2); 2,0 мл (С 3) (таблица 1).

Для выбора оптимальной комбинации уровней факторов получали градуировочные зависимости АС от количества аскорбиновой кислоты в диапазоне от 10 до 150 мкг (что необходимо для подтверждения линейности функции), рассчитывали уравнение регрессии полученной зависимости, а затем величину АС при заданном количестве (120 мкг) аскорбиновой кислоты. Таким образом, для каждого состава реагента (факторы А, В) был подобран объем (фактор С), при котором значение АС максимально. Это позволило сократить число рассматриваемых комбинаций до девяти (таблица 2).

Сравнивая, суммарный АС для каждого уровня выделили суммы, имеющие максимальное значение: ΣA 2 (0,991); ΣB 1 (1,066); ΣC 2 (1,361). Это позволило заключить, что оптимальным является реагент состава: 0,006 М Fe(III) - 0,01 М о-фенантролина при его объеме, вводимом в реакцию, 1,0 мл на 100 мл раствора.

При оптимальной концентрации реагента изучили изменение зависимости АС от концентрации аскорбиновой кислоты и некоторых восстановителей, распространенных в природных объектах (танин, рутин, кверцетин), при различном времени инкубирования реакционной смеси (30, 60, 90, 120 мин). Было установлено, что для всех изучаемых восстановителей зависимость АС от их содержания линейна в диапазоне 10-150 мкг (см. чертеж) и величина АС зависит от времени инкубирования (таблица 3).

Из чертежа видно, что изменение АС под действием рутина незначительно, танина приближается, а кверцетина превосходит аналогичную зависимость для аскорбиновой кислоты. При рассмотрении изменения АС от времени инкубирования для всех изучаемых восстановителей (таблица 3) установлено, что стабилизация аналитического сигнала во времени наблюдается от 90 минут.

Таблица 3 Изменение АС восстановителей во времени
Исследуемое вещество	m вещества, мг/см 3	Аналитический сигнал
Исследуемое вещество	m вещества, мг/см 3	Время инкубирования реакционной смеси, мин
30	60	90	120
Аскорбиновая кислота	10	0,038	0,042	0,044	0,044
100	0,340	0,352	0,360	0,363
Танин	10	0,029	0,037	0,042	0,043
100	0,280	0,295	0,303	0,308
Рутин	10	0,013	0,016	0,019	0,019
100	0,150	0,166	0,172	0,175
Кверцетин	10	0,031	0,044	0,051	0,053
100	0,420	0,431	0,438	0,442

Для доказательства суммирующего характера определяемой величины АОА было изучено влияние реагента Fe (III) - о-фенантролин на модельные растворы, в состав которых входили восстановители: танин, рутин, кверцетин и аскорбиновая кислота в различных соотношениях. В таблице 4 представлены результаты анализа модельных смесей.

Таблица 4 Результаты анализа модельных смесей (Р=0,95; n=3)
Количество компонентов в смеси	Суммарная АОА, рассчитано, мкгАК	Суммарная АОА, найдено, мкгАК
введено	Суммарная АОА, рассчитано, мкгАК	Суммарная АОА, найдено, мкгАК	в пересчете на АК
АК	Танин	Рутин	Кверцетин	АК	Танин	Рутин	Кверцетин
-	20	20	20	-	16,77	9,56	32,73	59,06	57,08
-	10	10	10	-	8,35	4,77	16,41	29,53	26,95
-	50	10	10	-	42,02	4,77	16,41	63,20	55,04
-	10	50	10	-	8,35	23,93	16,41	48,69	50,06
-	10	10	50	-	8,35	4,77	81,70	94,82	91,61
-	30	10	10	-	25,19	4,77	16,41	46,37	39,24
-	10	30	30	-	8,35	14,35	49,06	71,76	73,47
20	20	20	20	20	16,77	9,56	32,73	79,06	96,29
50	10	10	10	50	8,35	4,77	16,41	87,95	93,07
10	50	10	10	10	42,02	4,77	16,41	73,20	78,15
10	10	50	10	10	8,35	23,93	16,41	58,69	78,74
10	10	10	50	10	8,35	4,77	81,70	104,82	121,45
30	30	10	10	30	25,19	4,77	16,41	76,37	84,59
10	10	30	30	10	8,35	14,35	49,06	81,76	103,31

Расчет теоретической величины суммарной АОА проводили по уравнениям количественного соответствия, характеризующим антиоксидантную способность исследуемого восстановителя по отношению к аскорбиновой кислоте, при условиях равной антиоксидантной активности: .

Величину экспериментальной (найденной) АОА рассчитывали по усредненному уравнению регрессии для зависимости АС от количества аскорбиновой кислоты. Из результатов, представленных в таблице 4, видно, что экспериментально полученные величины АОА удовлетворительно согласуются с теоретически рассчитанными.

Таким образом, определяемая величина АОА является суммарным показателем, а определение ее величины с использованием уравнений количественного соответствия является правильным.

Предлагаемый способ апробирован на реальных образцах. Для определения суммарной АОА реального образца или его экстракта получали градуировочные зависимости АС от количества аналита и аскорбиновой кислоты при времени инкубирования реакционной смеси не менее 90 минут. Расчет суммарной АОА проводили по формуле (I) и выражали в мг аскорбиновой кислоты на грамм исследуемого объекта (мгАК/г).

Для подтверждения правильности предлагаемого способа эти образцы испытывали по известным методикам, оценивая содержание аскорбиновой кислоты (ГОСТ 24556-89 Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения витамина С) и преобладающих восстановителей: в чае - танина (ГОСТ 19885-74 Чай. Методы определения содержания танина и кофеина), в плодах шиповника - сумму органических кислот (ГОСТ 1994-93 Плоды шиповника. Технические условия) (таблица 5).

АнтиОксиданты (АО) - вещества, препятствующие окислению. В живом организме ведущим фактором окисления является образование свободных радикалов, поэтому действие антиоксидантов в биологических системах рассматривается преимущественно с позиции предотвращения окисления органических веществ свободными радикалами.

В настоящее время существует большое количество различных методов определения антиоксидантов: фотометрические, химические, электрохимические и др. Однако, многие из них имеют существенные недостатки, затрудняющие понимание и дальнейшее использование результатов, полученных этими методами. К наиболее часто встречающимся недостаткам можно отнести следующие:

Используются искусственные или нехарактерные для биологических систем условия измерения антиоксидантного действия. Например, вместо биологических свободно-радикальных реакций используются чисто химические окислительно-восстановительные реакции или осуществляется измерение способности вещества отдавать/принимать электроны при воздействии электрическим током. Результаты измерений, полученные в таких условиях, не позволяют говорить о том, исследуемое вещество будет проявлять такое же "антиоксидантное" действие в организме.
Определение антиоксидантного действия осуществляется путем измерения количества накопленных продуктов окисления (маркеров окисления). Таким образом действительно можно определить количество антиоксиданта в исследуемом образце, но упускается весьма важная информация об активности антиоксиданта. Игнорирование активности антиоксиданта в свою очередь может приводить к существенным ошибкам в определении его количества, например, для "слабых" антиоксидантов, которые действуют медленно, но в течение длительного времени.

В целом в области определения антиоксидантов отсутствует стандартизация, позволяющая сравнивать между собой результаты, полученные разными методами.

Хемилюминесцентный метод является наиболее информативным методом исследования антиоксидантов и обладает рядом существенных преимуществ:

Прямое определение антиоксидантного действия - регистрируется непосредственное действие антиоксидантов на свободные радикалы. В хемилюминесцентном методе используется химическая система генерации свободных радикалов, которая дает контрольное хемилюминесцентное свечение. Затем к такой системе добавляется антиоксидант, который нейтрализует свободные радикалы, что приводит к подавлению контрольной хемилюминесценции.
Значительным достоинством такого подхода является возможность использования различных химических систем генерации свободных радикалов, что позволяет дополнительно определять специфичность антиоксидантов и локализацию их действия.
Измерение количественных и качественных характеристик антиоксидантов - хемилюминесцентный метод позволяет охарактеризовать любое соединение, обладающее антиоксидантным действием, двумя независимыми показателями:
- АнтиОксидантная Емкость (АОE) - общее количество свободных радикалов, которое может нейтрализовать соединение, содержащееся в пробе определенного объема.
- АнтиОксидантная Активность (АОА) - скорость нейтрализации свободных радикалов, т.е. количество радикалов, нейтрализуемых в единицу времени.

Хемилюминесцентный метод дает важное понимание того, что действие антиоксидантов обязательно должно оцениваться двумя показателями - количественным (AOE) и качественным (AOA).
Следующий рисунок демонстрирует это положение:

Влияние разных антиоксидантов на хемилюминесценцию
(цифрами возле графиков указана концентрация антиоксиданта):
слева – "сильный" антиоксидант, справа – "слабый" антиоксидант.

Антиоксиданты существенно отличаются своей активностью. Существуют "сильные" антиоксиданты, т.е. антиоксиданты с высокой активностью, которые ингибируют свободные радикалы с высокой скоростью и полностью подавляют хемилюминесценцию. Такие антиоксиданты оказывают максимальный эффект уже при малых концентрациях и быстро расходуются. С другой стороны существуют "слабые" антиоксиданты, т.е. антиоксиданты с низкой активностью, которые ингибируют свободные радикалы с низкой скоростью и подавляют хемилюминесценцию лишь частично. Значимый эффект такие антиоксиданты оказывают только в больших концентрациях, но при этом они медленно расходуются и действуют в течение длительного времени.

Хемилюминесцентный метод может применяться для определения антиоксидантных показателей:

биологических жидкостей (плазма, слюна, моча);
фармакологических препаратов и биологически активных добавок;
напитков и пищевых добавок;
косметических средств и средств для ухода;
и др.

Для реализации хемилюминесцентного метода определения антиоксидантов рекомендуется использовать следующее оборудование:

Хемилюминометр Lum-100 - обеспечивает термостатирование и регистрацию хемилюминесценции 1 пробы.
Хемилюминометр Lum-1200 - обеспечивает термостатирование и одновременную регистрацию хемилюминесценции до 12 проб.