Тема: Генетика микроорганизмов 1. Конъюгация, трансдукция, трансформация. 2. Изменчивость микроорганизмов. 3. Использование достижений генетики бактерий.
Наследственный аппарат бактерий имеет ряд особенностей: бактерии - гаплоидные организмы, т. е. они имеют 1 хромосому. В связи с этим при наследовании признаков отсутствует явление доминантности; бактерии обладают высокой скоростью размножения, в связи с чем за короткий промежуток времени (сутки) сменяется несколько десятков поколений бактерий. Это дает возможность изучать огромные по численности популяции и достаточно легко выявлять даже редкие по частоте мутации. Наследственный аппарат бактерий представлен хромосомой. У бактерий она одна. Хромосома бактерий - это молекула ДНК. Длина этой молекулы достигает 1, 0 мм и, чтобы "уместиться" в бактериальной клетке, она не линейная, как у эукариотов, а суперспирализована в петли и свернута в кольцо. Это кольцо в одной точке прикреплено к цитоплазматической мембране. На бактериальной хромосоме располагаются отдельные гены. У кишечной палочки, например, их более 2 тыс.
2. Функциональными единицами генома бактерий, кроме хромосомных генов, являются: IS-последовательности; транспозоны; плазмиды. IS-последовательности (англ. insertion - вставка, sequence - последовательность)- короткие фрагменты ДНК. Они не несут структурных (кодирующих тот или иной белок) генов, а содержат только гены, ответственные за транспозицию (способность IS-последовательностей перемещаться по хромосоме и встраиваться в различные ее участки). ISпоследовательности одинаковы у разных видов бактерий. Транспозоны - это молекулы ДНК, более крупные, чем IS последовательности. Помимо генов, ответственных за транспозицию, они содержат и структурный ген, кодирующий тот или иной признак. Транспозоны (Tn-элементы) состоят из 2000 -25 000 пар нуклеотидов, содержат фрагмент ДНК, несущий специфические гены, и два концевых ISэлемента. Каждый транспозон обычно содержит гены, привносящие важные для бактерии характеристики типа множественной устойчивости к антибактериальным агентам. В общем, для транспозонов характерны те же гены, что и для плазмид (гены устойчивости к антибиотикам, токсинообразования, дополнительных ферментов метаболизма). Транспозоны легко перемещаются по хромосоме. Их положение сказывается на экспрессии как их собственных структурных генов, так и соседних хромосомных. Транспозоны могут существовать и вне хромосомы,
Плазмиды - кольцевые суперспиралевидные молекулы ДНК. Их молекулярная масса колеблется в широких пределах и может быть в сотни раз больше, чем у транспозонов. Плазмиды содержат структурные гены, наделяющие бактериальную клетку разными, весьма важными для нее свойствами: R-плазмиды - лекарственной устойчивостью; Col-плазмиды - способностью синтезировать колицины; F-плазмиды - передавать генетическую информацию; Тох-плазмиды - синтезировать токсин; Плазмиды биодеградации - разрушать тот или иной субстрат и т. д. Плазмиды могут быть интегрированы в хромосому (в отличие от ISпоследовательностей и транспозонов, встраиваются в строго определенные участки), а могут существовать автономно. В этом случае они обладают способностью к автономной репликации, и именно поэтому в клетке может быть 2, 4, 8 копий такой плазмиды. Многие плазмиды имеют в своем составе гены трансмиссивности и способны передаваться от одной клетки к другой при конъюгации (обмене генетической информацией). Такие плазмиды называются трансмиссивными.
У бактерий различают 2 вида изменчивости - фенотипическую и генотипическую. Фенотипическая изменчивость - модификация - не затрагивает генотип, но затрагивает большинство особей популяции. Модификации не передаются по наследству и с течением времени затухают, т. е. возвращаются к исходному фенотипу через большее (длительные модификации) или меньшее (кратковре менные модификации) исло поколений. ч Генотипическая изменчивость затрагивает генотип. В ее основе лежат мутации и рекомбинации. Мутации бактерий принципиально не отличаются от мутаций эукариотических клеток. Особенностью мутаций у бактерий является относительная легкость их выявления, так как имеется возможность работать с большими по численности популяциями бактерий. По происхождению мутации могут быть: спонтанными; индуцированными. По протяженности: точечными; генными; хромосомными. По направленности: прямыми; - обратными.
Рекомбинации (обмен генетическим материалом) у бактерий отличаются от рекомбинаций у эукариот: у бактерий имеется несколько механизмов рекомбинаций; при рекомбинациях у бактерий образуется не зигота, как у эукариот, а мерозигота (несет полностью генетическую информацию реципиента и часть генетической информации донора в виде дополнения); у бактериальной клетки-рекомбината изменяется не только качество, но и количество генетической информации.
Конъюгация У бактерий - способ переноса генетического материала от одной бактериальной клетки к другой. При этом две бактерии соединяются тонким мостиком, через который из одной клетки (донора) в другую (реципиент) переходит отрезок нити дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Наследственные свойства реципиента изменяются в соответствии с количеством генетической информации, заключённой в переданном кусочке ДНК.
Конъюгация Конъюгация (от лат. conjugatio - соединение), парасексуальный процесс - однонаправленный перенос части генетического материала (плазмид, бактериальной хромосомы) при непосредственном контакте двух бактериальных клеток. Открыт в 1946 году Дж. Ледербергом и Э. Тайтемом. Имеет большое значение в природе, поскольку способствует обмену полезными признаками при отсутствии истинного полового процесса. Из всех процессов горизонтального переноса генов конъюгация позволяет передавать наибольшее количество генетической информации.
Конъюгация - обмен генетической информацией у бактерий путем передачи ее от донора к реципиенту при их прямом контакте. После образования между донором и реципиентом конъюгационного мостика одна нить ДНК-донора поступает по нему в клетку-реципиент. Чем дольше контакт, тем большая часть донорской ДНК может быть передана реципиенту. Основываясь на прерывании конъюгации через определенные промежутки времени, можно определить порядок расположения генов на хромосоме бактерий - построить хромосомные карты бактерий (произвести картирование бактерий). Донорской функцией обладают F+-клетки.
Трансдукция Эстер Ледерберг удалось выделить бактериофаг лямбда, ДНК вирус, из Escherichia coli K 12 в 1950 году. Собственно открытие трансдукции связано с именем Джошуа Ледерберга. В 1952 году они совместно с Нортоном Циндером обнаружили общую трансдукцию. В 1953 Ледербергом и др. было показано существование абортивной трансдукции, в 1956 - специфической.
Трансдукция- обмен генетической информацией у бактерий путем передачи ее от донора к реципиенту с помощью умеренных (трансдуцирующих) бактериофагов. Трансдуцирующие фаги могут переносить 1 или более генов (признаков). Трансдукиия бывает: специфической - переносится всегда один и тот же ген; неспецифической - передаются разные гены. Это связано с локализацией трансдуиируюших фагов в геноме донора: в случае специфической трансдукции они располагаются всегда в одном месте хромосомы; при неспецифической их локализация непостоянна.
Рис. 2. Трансдукция 1 - бактерия - донор (В+), 2 - фаг, 3 - размножение, 4 - адсорбция, 5 - бактерия - реципиент (В-), 6 - бактерия – реципиент с новым свойством.
Трансформация - это обмен генетической информацией у бактерий путем введения в бактериальную клетку реципиент готового препарата ДНК (специально приготовленного или непосредственно выделенного из клетки-донора). Чаще всего передача генетической информации происходит при культивировании реципиента на питательной среде, содержащей ДНК донора. Для восприятия донорской ДНК при трансформации клеткареципиент должна находиться в определенном физиологическом состоянии (компетентности), которое достигается специальными методами обработки бактериальной популяции или возникает спонтанно. При трансформации передаются единичные (чаще 1) признаки. Трансформация является самым объективным свидетельством связи ДНК или ее фрагментов с тем или иным фенотипическим признаком, поскольку в реципиентную клетку вводится чистый препарат ДНК.
Рис. 3. Трансформация капсульный штамм бактерии (1) при посеве дает рост (6). После кипячения этой культуры рост отсутствует (7). Аналогичен результат такого опыта с бескапсульным штаммом (4 -рост +, 8 -рост -). Объединение в одну емкость экстракта касульного (1) и живой культуры бескапсульного (3) штаммов с последующим высевом дает рост капсульного штамма (5).
Свойства клеток колоний S – и R- форм S-форма R-форма Колонии шероховатые, непрозрачные с неровными краями, часто морщинистые Жгутики часто отсутствуют Капсулы или слизистый слой отсутствует Биохимически менее активны Слабовирулентные или авирулентные Неполноценны в антигенном отношении Слабочувствительны к фагу Взвесь быстро оседает, осадок крошковидный, клетки полиморфные Колонии прозрачные, с гладкой блестящей поверхностью, круглые, с ровными краями, выпуклые Подвижные виды имеют жгутики У капсульных видов хорошо видна капсула или слизистый слой Биохимически более активны У патогенных видов выражены вирулентные свойства Полноценны в антигенном отношении Чувствительны к фагу Взвесь клеток в физиологическом растворе гомогенная, стойкая, клетки нормальных размеров
Трансформация - изменение наследственных свойств клетки в результате проникновения или искусственного привнесения в нее чужеродной ДНК. Природу трансформирующего фактора установили Эвери, Мак-Леод в 1944. Трансформировать удается только те бактерии, в клетки которых может проникнуть высокомолекулярная, двуХцепочечная (интактная) ДНК. Способность поглощать ДНК – компетенция, и зависит от физиологического состояния клетки. ДНК может поглощаться в определенную короткую фазу изменения клеточной поверхности. С помощью ДНК могут передаваться такие признаки как: капсулообразование, синтез в-в, ферментативная активность, устойчивость к ядам, антибиотикам.. Любая ДНК может проникнуть в компетентную клетку, но рекомбинация роисходит только ДНК родственного вида. Конъюгация - перенос генетического материала путем прямого контакта между 2 клетками. Исследовали Ледерберг и Татум в 1946 на мутантах Кишечной палочки. Один мутант уждался в аминокислотах А и В, но был способен синтезировать Си Д, второй был ему компетентен (А-В-С+Д+). Эти мутанты не росли и не образовывали колоний на минимальной, питательной среде, но если внести на нее суспензию обоих мутантов, то колонии появлялись. Клетки этих колоний обладали наследственной способностью синтезировать все аминокислоты (А+В+С+Д+).Здесь предпосылкой рекомбинации служит конъюгация. При исследовании бактерий выяснили, что способность клетки быть донором связана с наличием фактора F (F +клетки, не содержащие фактора – F- и может функционировать, как реципиент) – плазмида, кольцевая, двухцепочечная молекула ДНК. Т.о. клетки реципиенты в результате конъюгации становятся донорами, а хромосомные признаки не передаются. F-плазмида обуславливает образование на клетке половых фимбрий/ F-пили, которые служат для узнавания при контакте м/у клеткой донором и клеткой реципиентом и делают возможным образование мостика, по которому ДНК переходит в клетку. Конъюгация распространена у энтеробактерий, прокариот. Трансдукция - пассивный перенос бактериальных генов из одной клетки в другую частицами бактериофага, что приводит к изменению наследственных свойств клетки. Различают 2 вида трансдукции: а) Неспецифический - при котором может быть перенесен любой фрагмент ДНК хозяина (ДНК клетки хозяина включается в частицу фага/ к его собственному гену/ вместо него) ; б) Специфический – может быть перенесен строго определенный фрагмент ДНК некоторые гены фага заменяются генами хозяина). В обоих случаях фаги дефектны, т.е. теряют способность лизировать клетку.
38. Факторы резистентности(r-факторы). Свойства плазмидов. Транспозоны.
1. Резистентность – устойч.орг-мов к каким-либо антигенам. Бактерии устойч.к некотор.антаибиотикам были откр. В 50-е годы в Японии(возбудители дезинтерии. Отмеч.множ.уст-ть бакт.дезинтерии и это может перед.др.бакт. R-факторы содержат гены, которые делают клетку устойчивой к некоторым антибиотикам. Некоторые R-факторы обуславливают резистентность сразу к 8 антибиотикам, а др. R-ф. придают уст-ть к тяж.мет.(ртуть, никель, кадмий) R-плазмида несёт 2 гр.генов:1)ген отв.за передачу плазмиды путём коньюгации(гены tra) и они обр.так назыв.»факторы переноса устойчивости(RTF), 2)гены котор.обусл.собственно резист-ть и они сост. Сост.лишь небольш.часть плазмиды.
RTF включ.все гены,ответств.за перенос фактора R из клетки в клетку, котор.осущ.путём коньюгации. Т.е фактор R также как и фактор F- инфекционен. Возможен перенос R-фактора между несколькими разными родами бактерий, что способств.их дальнейшему распр. Фермитативн.хим.модиф.антибиотиков явл.осн.причиной уст.к ним,обусл.плазмидами. Например канамицин и неомицин подверг.фосфорелиров-ю, а пинпиц.инактивиро.пеницилиназой. поск. При налич. R-факторов возможна генетт.рекомбинация, то может.возн.нов.сочет-е генов,котор.придадут.дополн.св-ва уст-ти. R-факторы имеют больш.знач-е для химио-терапии.
2. Бактериоцины . Многие бакт.синтез.белки,Юкотор. Убив.родств.виды или штаммы или тормозят их рост. Эти белки назыв-ся бактериоцинами. Они кодир. Особ.плазмидами, котор.назыв.бактериоциногенными факторами. Бактериоцины были выделены из эшрихиа коли(колицины) и др.бакт. Назв-е бактериоцинам даётся по продуцир.форме бакт.,напр.стафилококи произв.стафилоцины. неорг.в-ва, убив.бакт.назыв.антисептиками.
3. Др.призн., опр.плазмидами. Плазмиды могут содерж.гены,котор.обусл.ряд специф.биол.св-в,котор.в опр.усл-ях созд.селективное преимущество. Гены ферментов,необх.для расщепл-я камыфоры,салиц.к-ты и др.необ.субстратов могут наход.в плазмидах. Перечень св-в, наслед.с плазмидами, значит-й и включает: азотфиксацию,обр-е клубеньков, погл-е сахаров, синтез гидрогеназы и др. Некотор.из этих св-в могут опр.генами бактер. Хромасомы (обмен генами м-ду хромосомой и плазмидой). Плазмиды сыграли важн.роль в эвол.прокариотов.
4. Несовместимость. Многие бакт.содерж.плазмиды разл.велич. Сосущ.разн.плазмидов в одной клетке говорит о том, что такие плазмиды совместимы между собой. Но 2 родств.плазмиды не могут сосущ.в одной клетке,они несовместимы. Все плазмиды подр.на гр.несов-ти: плазмиды,отн.к одной и тойже группе несовм.
Транспозоны – это послед-ти ДНК,котор.способны встр.во мног.уч-ки генома и могут «перепр.»с плазмиды на бакт.хромосому,на др.плазмиду. Транспазоны содержат гены,котор.опр.внешнерасп.признаки,а именно уст-ть к таким антибиотикам как пиниц.,тетрациклин и др. В с вязи с этим их легче обнар., чем IS – Эл-ты (чужеродн.ДНК,предст.собой инсерцион.посл-ти встреч в бакт.хромосомах и плазмидах.). По обе стороны от генов уст-ти, котор.нах.внутри транспозона распол 2 одинаков посл-ти,котор.могут идти в одном и томже или противопол.напр-ях. Эти повт.посл-ти оснований ДНК частично идентичны с IS – Эл-тами.
41. Эволюция м/оов.
Кл-ки всего живого от примитивных форм до высоко организованных состоят из одних и тех же структурных элементов и исп одни и теже механизмы для получения энергии и роста. В этом заключается биохимическое единство всех живых организмов. В процессе эволюции происходило становление и формирование различных форм живого. Для процесса эволюции жизни необходимо предст какие условия были на Земле, в кот оказалось возможным самозарождение жизни. В послед после формирования Земли период на ней происх активные биологич процессы, кот меняли ее облик и приводили к формированию земной коры, гидросферы и атмосферы. Когда органич в-ва на Земле накопились в большом количестве=>возникли условия, при котором мог совершиться переход от химич эволюции к возникновению первых самовоспроизводящихся живых существ. Для клет жизни характерно, что она всегда предст в виде опред структур, кот пространственно обособленны от внешней среды, но постоянно взаимод с ней по типу отк систем. Предполаг, что след этапом эволюции на пути возникн жизни было формирование определенной структурной организации – абиогенносинтезированных органических соединений. Они имели сферическую форму, диаметр 0,5-7мкм, напоминали кокковидные формы бактерий, содержали протеиноиды, кот обладали определенной стабильностью. При окрашивании по грамму было обнаружено, что микросферы, образованные из кислых протеиноидов - гр-, а основными протеиноидами – гр+. Этот этап переходный этап от химической к биологической эволюции и возникшая закономерность может быть определена как предбиологический естественный отбор. В дальнейшем предпол, что первыми прокариотами, кот могли появиться в водоемах, где было много органич в-ва были организмы, кот сущ за счет брожения и обладавшими основными функциями анаэробного обмена. Если предположить, что в водоемах имелись тогда и сульфаты, то след этапом эволюц явл эффективный транспорт электронов с созданием протонного потенциала как источника энергии для регенерации АТФ. Кроме того, было экспериментально показано, что на начальн этапе эволюц прокариоты могли воспроизводиться и передавать информацию потомству без участия нуклеиновых кислот. Для дальнейшей эволюции прокариот было необходимо создание специального аппарата, кот бы обеспечивал точное воспр полипептидов. Это привело к формированию нового механизма синтеза – матричного синтеза, в основе которого лежит использование свойств полинуклеотидов. Свойством полинуклеиновых молекул является способность к точному воспроизведению, основанное на принципе структурной комплиментарности.
Главное событие в эволюции: переход от первичной восстанавливающей атмосферы к атмосфере, содержащей кислород. У бактерий появился новый тип метаболизма – аэробное дыхание, что стало возможно в результате превр цитохромов в терминальные оксидазы, используя молекулы О 2 в качестве акцептора электронов. Предполагают, что 2 млрд лет назад уже сущ все фототрофные прокариоты, кот изв и сейчас. Прокариоты первично занимали много различ экологич ниш, кот затем постепенно уступили эукариотам. Выработка разнообразных типов метаболизма у прокариот была обусловлена простой структурной клеткой, высокоразвитой системой регуляции, быстрым ростом, наличием неск механизмов переноса генов.
42.ПАТОГЕН МИКРООРГ И ИММУНИТЕТ.
Иммунитет защищает нас от инфекционных агентов: бактерий, вирусов и простейших, т. е. защищает организм от всего чужеродного.
Инфекция – сложный биологический процесс, возникающий в результате проникновения патогенных микробов в организм и нарушения постоянства его внутренней среды.
Патогенность – это способность микроба определенного вида при соответствующих условиях вызывать характерное для него инфекционное заболевание. Следовательно, патогенность есть видовой признак.
В природной среде встречаются биологические загрязнители, вызывающие у человека различные заболевания. Это болезнетворные микроорганизмы, вирусы, гельминты, простейшие. Они могут находиться в атмосфере, воде, почве, в теле других живых организмов, в том числе и в самом человеке.
Наиболее опасны возбудители инфекционных заболеваний. Они имеют различную устойчивость в окружающей среде. Одни способны жить вне организма человека всего несколько часов; находясь в воздухе, в воде, на разных предметах, они быстро погибают. Другие могут жить в окружающей среде от нескольких дней до нескольких лет. Для третьих окружающая среда является естественным местом обитания. Для четвертых - другие организмы, например дикие животные, являются местом сохранения и размножения.
Часто источником инфекции является почва, в которой постоянно обитают возбудители столбняка, ботулизма, газовой гангрены, некоторых грибковых заболеваний. В организм человека они могут попасть при повреждении кожных покровов, с немытыми продуктами питания, при нарушении правил гигиены.
|
Типичные антибиотики |
Продуценты |
На кого действует |
Механизм действии |
Трудности терапевтического применения |
|
Пенициллины, це-фалоспорины |
Грибы родов Ре nicillium , Cephalosporum |
Грамположитель-ные и грамотрицательные бактерии |
Нарушение синтеза клеточной стенки |
Аллергические реакции |
|
Стрептомицин, гентамицин, канамицин, тобрамицин, амикацин |
Актиномицеты рода Streptomyces , бактерии родов Micromonospora . Bacil lus |
Необратимое подавление синтеза белка |
Токсическое действие на слуховой нерв и почки |
|
|
Одноименные антибиотики |
Актиномицеты рода Streptomyces |
Грамположительные и грамотрицательные бактерии, риккетсии, хламидии, простейшие |
Обратимое подавление синтеза белка |
Распространение устойчивых штаммов |
|
Антибактериальные: эритромицин Противогрибковые и антипротозойные: полиены |
Актиномицеты рода Streptomyces То же |
Грамположительные бактерии Грибы, некоторые простейшие |
Нарушение плазматической мембраны |
Токсичность |
|
Полимиксины, грамицидины, бацитрацины |
Различные микро-организмы |
В основном грамотрицательные бактерии |
Механизм действия различен |
Высокая токсичность |
Генетические рекомбинации – перераспределение генетического материала родителей в потомстве, обусловливающее комбинативную изменчивость организмов. Они происходят при участии ферментов в пределах отдельных генов.
Конъюгация – перенос генетического материала из клетки-донора в клетку реципиента при тесном контакте. Донорами генетического материала являются клетки, несущие F-плазмиду. Бактериальные клетки, не имеющие F-плазмиды, являются реципиентами.
Первым этапом конъюгации является прикрепление клетки донора к реципиенту с помощью половых ворсинок. Между клетками образуется конъюгационный мостик, через который из клетки-донора в клетку-реципиент передается F-плазмида.
Если F-плазмида встроена в хромосому бактерии, происходит разрыв одной нити ДНК при участии эндонуклеазы. Проксимальный конец ДНК через конъюгационный мостик проникает в клетку-реципиент и сразу же достраивается до двунитевой структуры. Оставшаяся в клетке донора нить является матрицей для синтеза второй нити.
Трансформация – непосредственная передача генетического материала донора реципиентной клетке. Трансформация эффективно происходит только между бактериями одного вида, имеющими разный генотип.
Клетки, способные принимать донорскую ДНК, называются компетентными. Состояние компетентности возникает в период роста клетки и совпадает с концом логарифмической фазы.
Трансформирующей активностью обладают двунитевые фрагменты ДНК с молекулярной массой не менее 0,5-1х10 6
Процесс трансформации состоит из фаз:
1) адсорбция ДНК донора на клетке-реципиенте,
2) проникновение ДНК внутрь клетки-реципиента с последующей деспирализацией,
3) соединение одной нити ДНК с гомологичным участком хромосомы реципиента.
Трансдукция – передача генетического материала от одной бактерии к другой при помощи фагов. Различают:
1) неспецифическую трансдукцию – когда в клетку–реципиент вместе с фаговой ДНК переносится любой ген донора. Перенесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора способен включаться в гомологичную область ДНК клетки-реципиента путем рекомбинации. Трансдуцирующий фаг является только переносчиком генетического материала от одних бактерий к другим, а сама фаговая ДНК не участвует в образовании рекомбинантов,
2) специфическую трансдукцию – фаг переносит специфические гены от бактерии-донора к бактерии-реципиенту. При взаимодействии трансдуцирующих фагов с клетками реципиентного штамма происходит включение гена бактерии-донора вместе с ДНК дефектного фага в хромосому бактерии-реципиента.
3) абортивную – когда принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора не включается в хромосому бактерии-реципиента, а располагается в ее цитоплазме и может в таком виде функционировать. Во время деления бактериальной клетки-рекомбинанта принесенный фрагмент ДНК донора передается только одной из дочерних клеток и со временем исчезает.
Тема 6: Учение об инфекции. Химиотерапевтические препараты. Антибиотики.
Вопросы для самоподготовки :
1. Инфекция. Условия возникновения и пути передачи возбудителя.
2. Формы инфекции и их характеристика.
3. Периоды инфекционной болезни.
4. Характеристика бактериальных токсинов.
5. Антибиотики: классификация, применение, осложнения при приеме антибиотиков.
6. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.
7. Важнейшие группы химиотерапевтических препаратов и механизмы их действия.
Теоретический материал для самоподготовки :
Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 888 | Нарушение авторских прав
| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 21 | | | | | | | | | | | |
микроб пищеварение инфекция
Рекомбинация -- процесс обмена генетическим материалом путем разрыва и соединения разных молекул. Рекомбинация происходит при репарации двунитевых разрывов в ДНК и для продолжения репликации в случае остановки репликационной вилки у эукариот, бактерий и архей. У вирусов возможна рекомбинация между молекулами РНК их геномов.
Рекомбинация у эукариот обычно происходит в ходе кроссинговера в процессе мейоза, в частности, при формировании сперматозоидов и яйцеклеток у животных. Рекомбинация, наряду с репликацией ДНК, транскрипцией РНК и трансляцией белков, относится к фундаментальным, раноГомологичная рекомбинация
Гомологичная рекомбинация
Классификация типов гомологичной рекомбинации: аллельная, эктопическая и гомеологичная; реципрокная (кроссинговер) и нереципрокная (генная конверсия).
Реципрокная рекомбинация. Ранние представления о природе кроссинговера: гипотезы “разрыв и соединение” и “выборочное копирование”. Опыты Мезелсона по доказательству механизма “разрыв и соединение”. Разработка методических подходов к изучению молекулярных механизмов рекомбинации. Два этапа формирования рекомбинантной ДНК: “состыкованная” (joint) и первичная рекомбинантная молекулы.
Генетический контроль гомологичной рекомбинации у бактериофагов. Система Red у бактериофага l. Экзонуклеаза l. Система Orf. Бактериофаг Т4: роль генов 30, 32, 43, 46, 47, 49 и uvsX. Энзимология рекомбинационных реакций: эндо- и экзонуклеазы, ДНК-полимераза, ДНК-лигаза, белок UvsX, белок SSB и другие белки. Процессы “вытеснения нити”, образования D-петли, “миграции ветвления”, коррекции гетеродуплекса. Основные стадии кроссинговера: пресинапсис, синапсис и постсинапсис. Схемы кроссинговера у бактериофагов. Общность процессов рекомбинации и репарации ДНК.
Основные модели гомологичной рекомбинации. Модель Холлидея. Предпосылки модели, сущность, значение. Развитие модели в последующих исследованиях, ее современное состояние. Модель Мезелсона-Рэдинга. Модель репарации двунитевых разрывов (ДНР) ДНК у дрожжей (Жостак и др.) применительно к кроссинговеру и конверсии.
Рекомбинация при трансформации хромосомной ДНК у бактерий. Параметры рекомбинации. Размеры интегрируемых фрагментов донорной ДНК. Кинетика и эффективность трансформации. Доказательства интеграции однонитевых фрагментов донорной ДНК. Генетический контроль и основные этапы процесса трансформации у Bacillus subtilis и Streptococcus pneumoniae. Донорно-реципиентный комплекс. Генетический контроль и механизм рекомбинации при трансформации у Haemophilus influenzae. Трансформосома.
Рекомбинация при конъюгации у Escherichia coli. Характеристика конъюгационного переноса ДНК. Механизмы интеграции донорной ДНК в хромосому реципиентной клетки.
Генетический контроль гомологичной рекомбинации у E.coli. Гены, участвующие в пресинапсисе: recA, recB, recC, recD, recE, recJ и др. Плейотропный эффект мутаций recB и recC. АТФ-зависимая RecBCD-нуклеаза, ее актвности, механизмы действия и роли в различных генетических процессах. Chi-сайт как горячая точка рекомбинации. Универсальность АТФ-зависимых нуклеаз для бактерий. Гены, контролирующие процесс синапсиса: recA, recF, recO, recR, ssb и др. Свойства recA-мутантов. Белок RecA, его характеристика. Реакции, катализируемые белком RecA, его ключевая роль в первых этапах процесса кроссинговера: пресинапсисе и синапсисе. Природа синапсиса при гомологичной рекомбинации. RecA-ДНК-филаменты, их структура и функции в рекомбинации. Схема кроссинговера у E.coli с участием RecBCD-нуклеазы и белка RecA. RecA-гомологи у других прокариотических и эукариотических организмов. Роль белка SSB. Гены постсинапсиса: ruvA, ruvB, ruvC, recG и их продукты. Pоль в осуществлении миграции полухиазмы Холлидея и в ее разрешении.
Супрессорные мутации sbcA, sbcB, sbcC и sbcD. Экзонуклеазы I и VIII. SbcCD-нуклеаза. Три пути рекомбинации хромосомной ДНК у E.coli K-12 по Кларку: RecBCD, RecF и RecE, их характеристика. Роль путей RecF и RecE в гомологичной рекомбинации плазмид.
Особенности процесса кроссинговера у эукариот. Мейотический кроссинговер. Роль синаптонемного комплекса. Генетический контроль мейотической рекомбинации. Разнообразие RecA-подобных белков (рекомбиназ) у эукариот.
Митотический кроссинговер: соотношение между реципрокной и нереципрокной рекомбинацией. Кроссинговер в G1-клетках. Различия в генетическом контроле мейотического и митотического кроссинговера у дрожжей-сахаромицетов.
Горячие точки рекомбинации у эукариот. Роль ДНР ДНК в инициации мейотического и митотического кроссинговера.
Рекомбинационная репарация ДНР в хромосомной и плазмидной ДНК у дрожжей. Генетический контроль и разнообразие механизмов: модель Жостака и др. и ее модификации, механизмы “разрыв и копирование”, “отжиг комплементарных цепей ДНК” (“single-strand annealing”), “гомолог-зовисимое лигирование”.
Эктопическая рекомбинация, ее генетический контроль, молекулярные механизмы и биологическое значение.
Конверсия гена (коррекция рекомбинационного гетеродуплекса). Нереципрокность внутригенной рекомбинации. Гипотеза коррекции неспаренных оснований (Холлидей). Генетический контроль и пути коррекции гетеродуплексов у E.coli. Системы репарации неспаренных оснований с образованием и застройкой протяженных брешей в гетеродуплексе. Система Mut HLSU, ее характеристика. Молекулярная модель коррекции гетеродуплекса с участием системы MutHLSU. Эволюционный консерватизм белков MutL и MutS. Роль белков MutL и MutS в процессах коррекции неспаренных оснований и в регуляции гомеологичной рекомбинации. Системы коррекции неспаренных оснований у E.coli с формированием и застройкой коротких брешей. Коррекция гетеродуплексов при бактериальной трансформации, ее генетический контроль (система Hex), влияние на результаты генетического картирования. Коррекция и высокая отрицательная интерференция.
Конверсия гена у эукариот. Тетрадный анализ межаллельных скрещиваний. Типы тетрад. Полярность конверсии, ее причины. Коконверсия. Протяженность участка конверсии. Вопрос о связи мейотической конверсии с реципрокной рекомбинацией фланговых маркеров. Митотическая аллельная генная конверсия. Эктопическая мейотическая и митотическая конверсия. Переключение локусов MAT у гомоталличных дрожжей. Генетический контроль конверсии гена у экариот на примерах дрожжей и человека. Эукариотические гомологи бактериальных белков MutL и MutS - семейства белков PMS, MHL, MHS и др., их функции в рекомбинации и других клеточных процессах. Сложность систем коррекции неспаренных оснований у эукариот, основанная на участии разнообразных гомологов батериальных белков MutL и MutS.
Роли конверсии в эволюции и в онтогенезе. Соотношение между процессами кроссинговера и конверсии в различных генетических системах. Конверсионные процессы, осуществляющиеся независимо от кроссинговера.
Рекомбинационные процессы, не нуждающиеся в гомологии для синапсиса
Сайт-специфическая рекомбинация. Распространение сайт-специфических рекомбинационных систем у прокариот и эукариот, их функции. Сайт-специфические топоизомеразы типа I как ключевые белки сайт-специфической рекомбинации у бактериофагов, бактерий и дрожжей. Два семейства сайт-специфических топоизомераз I - интегразы и резолвазы.
Сайт-специфическая рекомбинация при интеграции и эксцизии фага l. Схема Кемпбела. Различия между генетическими картами вегетативного фага и профага. Структура сайтов attP и attB. Система Int. Int-белок как представитель семейства интеграз. Белок IHF E.coli. Интасома. Молекулярная модель интеграции и эксцизии фага l. Антипараллельное выстраивание att-сайтов при синапсисе. Природа синапсиса при сайт-специфической рекомбинации.
Сайт-специфические инверсии ДНК у бактериофагов и бактерий (система Din) и у дрожжей. Ключевые белки рекомбинации - инвертазы как представители семейства резолваз. Рекомбинационные энхансеры для сайт-специфических инверсий. Белок Fis E.coli. Инвертасома. Молекулярная модель рекомбинации, осуществляемой резолвазами. Роль сайт-специфических инверсий в регуляции экспрессии генов.
Транспозиции подвижных генетических элементов. Транспозиции у прокариот. Подвижные генетические элементы: IS-элементы, транспозоны (Tn), фаг Мu. Структура подвижных элементов. Функции, контролируемые различными подвижными элементами. Транспозаза. Участие белков клетки-хозяина в транспозиции. Вопрос о специфичности интеграции подвижного элемента в ДНК-мишень. Общность реакций, составляющих процессы транспозиции у разных типов подвижных элементов прокариот и эукариот.
Генетическая организация простых транспозонов семейства Tn3. Гены tnpA и tnpR, их продукты. Репликативная транспозиция, два этапа процесса. Молекулярная модель Шапиро. Генетический контроль и молекулярный механизм нерепликативной транспозиции у сложных транспозонов Tn5, Tn9 и Tn10. Генетический контроль и механизмы транспозиции у фага Mu. Транспозосома.
Конъюгативные транспозоны грамположительных и грамотрицательных бактерий, их классификация. Генетический контроль и механизмы транспозиции. Биологическое значение.
Подвижные генетические элементы эукариот (дрожжи, растения, дрозофила, млекопитающие). Классификация эукариотических подвижных элементов. Элементы со структурой прокариотического типа. Ретротранспозоны типа I у дрожжей, растений и животных, их структура, генетический контроль и механизм транспозиции, классификация. Ретротранспозоны типа II: особенности строения, распространение, механизм транспозиции.
Генетические эффекты, вызываемые подвижными элементами у прокариот и эукариот: изменения экспрессии генов, генные мутации, хромосомные перестройки, гибридный дисгенезиз. Участие подвижных элементов в организации структуры хромосом. Роль в онтогенезе живых организмов и в эволюции генетического материала. Подвижные элементы как инструмент генетических исследований.
Незаконная рекомбинация. Круг явлений, относимых к незаконной рекомбинации. Негомологичная рекомбинация у бактерий, катализируемая ДНК-гиразой. Молекулярная модель (Икеда). Негомологичная рекомбинации с участием ДНК-зависимой протеинкиназы у позвоночных. Роль в репарации двунитевых разрывов, интеграции экзогенной ДНК в хромосомы и в перестройках иммуноглобулиновых последовательностей ДНК.
Запрограммированные рекомбинационные перестройки генетического материала в онтогенезе
Состыковка разобщенных частей генов с помощью сайт-специфической рекомбинации в процессе споруляции у Bacillus subtilis и при формировании гетероцист у нитчатых цианобактерий. Перестройка генетического материала при образовании макронуклеуса у ресничных инфузорий. Диминуция хроматина у ряда представителей беспозвоночных.
Сайт-специфическая рекомбинация у позвоночных, участвующая в перестройках иммуноглобулиновых последовательностей ДНК. Структура молекул иммуноглобулинов. Организация и структура последовательностей ДНК, участвующих в формировании генов, кодирующих иммуноглобулины. Роль продуктов генов RAG1 и RAG2. Механизм сайт-специфической рекомбинации при состыковке кодирующих сегментов генов иммуноглобулинов. Участие других генетических процесов в формировании генов иммуноглобулинов: гомологичная рекомбинация (эктопический митотический кроссинговер, эктопическая митотическая конверсия), незаконная рекомбинация, гипермутагенез, альтернативный сплайсинг. Приуроченность этих процессов к определенным стадиям дифференцировки B-лимфоцитов.
Трансформация -- процесс поглощения клеткой организма свободной молекулы ДНК из среды и встраивания её в геном, что приводит к появлению у такой клетки новых для неё наследуемых признаков, характерных для организма-донора ДНК. Иногда под трансформацией понимают любые процессы горизонтального переноса генов, в том числе трансдукцию, конъюгацию и т. д.
Трансформация прокариот
В любой популяции лишь часть бактерий способна к поглощению из среды молекул ДНК. Состояние клеток, при котором это возможно, называют состоянием компетентности. Обычно максимальное число компетентных клеток наблюдается в конце фазы логарифмического роста.
В состоянии компетентности бактерии вырабатывают особый низкомолекулярный белок (фактор компетентности), активизирующий синтез аутолизина, эндонуклеазы I и ДНК-связывающего белка. Аутолизин частично разрушает клеточную стенку, что позволяет ДНК пройти через неё, а также снижает устойчивость бактерий к осмотическому шоку. В состоянии компетентности также снижается общая интенсивность метаболизма. Возможно искусственное приведение клеток в состояние компетентности. Для этого применяют среды с высоким содержанием ионов кальция, цезия, рубидия, электропорацию или заменяют клетки реципиента протопластами без клеточных стенок.
Эффективность трансформации определяется количеством колоний, выросших на чашке Петри после добавления к клеткам 1 мкг суперскрученной плазмидной ДНК и рассева клеток на питательную среду. Современные методы позволяют добиваться эффективности 106--109.
Поглощаемая ДНК должна быть двухнитевой (эффективность трансформации однонитевой ДНК на порядки ниже, однако несколько возрастает в кислой среде), её длина -- не менее 450 пар оснований. Оптимальное pH для прохождения процесса -- около 7. Для некоторых бактерий (Neisseria gonorrhoeae, Hemophilus) поглощаемая ДНК должна содержать определённые последовательности.
ДНК необратимо адсорбируются на ДНК-связывающем белке, после чего одна из нитей разрезается эндонуклеазой на фрагменты длиной 2--4 тыс. пар оснований и проникает в клетку, вторая полностью разрушается. В случае, если эти фрагменты имеют высокую степень гомологии с какими-либо участками бактериальной хромосомы, возможна замена этих участков на них. Поэтому эффективность трансформации зависит от эволюционного расстояния между донором и реципиентом. Общее время процесса не превышает нескольких минут. Впоследствии, при делении, в одну дочернюю клетку попадает ДНК, построенная на основе исходной нити ДНК, в другую -- на основе нити с включённым чужеродным фрагментом (выщепление)
Трансформация эукариотических клеток с использованием синтетических полимерных катионов
Доставка чужеродных нуклеиновых кислот внутрь интактных клеток, или трансформация, лежит в основе многих методов генной инженерии. Транспортировка функциональных генов в ткани может сделать возможной коррекцию генной недостаточности и мутаций, следствием которых являются тяжелые наследственные патологии или раковые опухоли. В настоящее время разработан целый ряд приемов для введения ДНК в клетки, среди которых наиболее распространены преципитация фосфатом кальция или диэтиламиноэтил-декстраном (ДЕАЕ-декстраном), электропорация, микроинъекция, встраивание ДНК в реконструированную оболочку вирусов или липосомы (искусственные мембранные липидные везикулы).
Несмотря на разнообразие этих методов, поиск новых путей трансформации про- и эукариотических клеток продолжается. С одной стороны, это вызвано необходимостью повышения эффективности трансформации, с другой - перечисленные выше методы применимы лишь для ограниченного числа клеточных линий и неэффективны при попытках введения в клетки РНК. Наконец, большинство этих подходов не может быть использовано для генетической трансформации in vivo.
В качестве переносчиков ДНК используются ретровирусные векторы, векторы на основе ДНК-содержащих вирусов и ВИЧ, липосомы на основе катионных липидов, полимерные ДНК-связывающие катионы. Использование синтетических полимеров в качестве переносчиков ДНК имеет ряд преимуществ: удобство хранения и очистки, простота тестирования токсичности и безопасности и, что особенно важно для генной терапии, снижение риска патогенетических и иммунологических осложнений.
При смешивании растворов линейных поликатионов и ДНК формируются интерполиэлектролитные комплексы (ИПЭК) за счет образования кооперативной системы межцепных электростатических связей. При этом поликатионные цепи окружают молекулу ДНК, образуя сферы или тороиды, в зависимости от типа полимера. Включение в ИПЭК приводит к компактизации ДНК, повышению ее устойчивости к действию нуклеаз, способствует усилению ее взаимодействия с клеточной мембраной и повышению трансформирующей активности по отношению как к прокариотическим, так и эукариотическим клеткам. Соединяя молекулы поликатиона с лигандами, способными к специфическому связыванию с клеточной мембраной, можно обеспечить проникновение ИПЭК в клетку по рецепторному пути, а в организме - адресную доставку к клеткам-мишеням.
Системы доставки ДНК для применения в генной терапии должны обеспечивать проникновение ДНК в нужный орган, ткань, или в конкретную группу клеток, а затем - в клеточное ядро. Антисмысловые олигонуклеотиды, а именно они чаще всего используются в генной терапии, должны найти ту мРНК или участок хромосомной ДНК, против которой они направлены. Введенный ген должен войти в состав конструкции, способной его экспрессировать.
Однако это довольно сложная проблема. При введении нуклеиновой кислоты или олигонуклеотида в организм они не попадут преимущественно к нужной ткани или нужному органу, а та их часть, которая окажется в нужном месте, лишь в незначительной мере сможет пройти сквозь гидрофобную клеточную мембрану. Кроме того, в ходе эволюции были выработаны механизмы защиты клеток организма от вторжения факторов внешней среды, в том числе и чужеродной ДНК. Оказавшись внутри клетки, чужеродная ДНК может локализоваться не там, где это необходимо и, более того, может оказаться в лизосомах, где будет разрушена под действием нуклеаз.
Проникновение в клетку и внутриклеточный транспорт ИПЭК происходит, возможно, за счет образования и последовательного разрушения эндосом. На каждом из этапов этого процесса существенная часть материала теряется. Скудное высвобождение векторов из эндосом в цитоплазму и неэффективный перенос их в ядро приводят к низкой эффективности трансгенной экспрессии.
Рестрикционная карта плазмиды pBR 322:
цифрами указана нумерация нуклеотидов;
тонкие черточки - единичные сайты, узнаваемые рестриктазами;
толстые серые стрелки сверху - направление транскрипции;
Pbla - промотор гена Ampr - устойчивость к ампициллину;
Ptet- промотор гена Tetr- устойчивость к тетрациклину;
TТ1 - Rho-независимый терминатор транскрипции (положение 3140-3160); ТТ2 - положение 3080-3110; ROP - белок, способствующий образованию дуплексов между РНК 1 и РНК 2 (негативный регулятор копийности); РНК 1 - контрольная РНК (контролирует копийность плазмиды); РНК 2 - «праймерная» РНК (служит затравкой для репликации); толстые черные стрелки - направление транскрипции РНК 1 и РНК 2
Векторы на основе фага М13
Можно выделить три пути повышения эффективности переноса ДНК в эукариотические клетки с помощью синтетических поликатионов. Во-первых, это повышение специфичности трансфекции за счет лигандов, соединенных с молекулой поликатиона и обеспечивающих избирательное взаимодействие комплексов с клетками определенного фенотипа. Во-вторых - повышение эффективности трансформации за счет подбора генов или олигонуклеотидов, внедряемых в клетку. В-третьих - повышение частоты трансфекции, которое достигается за счет применения лигандов, более эффективно взаимодействующих с клеточной мембраной, и веществ, дестабилизирующих мембрану. Кроме того, возможен синтез новых поликатионов.
В лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии НИИ гриппа РАМН в Санкт-Петербурге проводится изучение средств доставки ДНК и вирусных частиц в клетки. В этой работе используется набор полимерных носителей, синтезированный сотрудниками Института высокомолекулярных соединений РАН. В качестве экспрессионных векторов использовались плазмиды: pUC 18, содержащая цитомегаловирусный промотор и ген b-галактозидазы, и pBR 322, содержащая цитомегаловирусный промотор и ген зеленого флуоресцирующего белка водорослей.
В результате проведенных исследований было выяснено, что наибольшую трансфекционную активность имеют ИПЭК поли-(2-(диметиламино)этил)метакрилата (PDMAEMA) с низкими молекулярными массами. Дальнейшие исследования позволят разработать новые подходы к решению актуальных проблем в вирусологии, молекулярной и клеточной биологии, генной инженерии, генной терапии.
Трансдукция (от лат. transductio -- перемещение) -- процесс переноса бактериальной ДНК из одной клетки в другую бактериофагом. Общая трансдукция используется в генетике бактерий для картирования генома и конструирования штаммов. К трансдукции способны как умеренные фаги, так и вирулентные, последние, однако, уничтожают популяцию бактерий, поэтому трансдукция с их помощью не имеет большого значения ни в природе, ни при проведении исследований.
Общая (неспецифическая) трансдукция
Осуществляется фагом P1, существующим в бактериальной клетке в виде плазмиды, фагами P22 и Mu, встраивающимися в любой участок бактериальной хромосомы. После индуцирования профага с вероятностью в 10?5 на одну клетку возможна ошибочная упаковка фрагмента ДНК бактерии в капсид фага, ДНК самого фага в нём в этом случае нет. Длина этого фрагмента равна длине нормальной фаговой ДНК, его происхождение может быть любым: случайный участок хромосомы, плазмида, другие умеренные фаги.
Попадая в другую бактериальную клетку, фрагмент ДНК может включаться в её геном, обычно путём гомологичной рекомбинации. Перенесённые фагом плазмиды способны замыкаться в кольцо и реплицироваться уже в новой клетке. В ряде случае фрагмент ДНК не встраивается в хромосому реципиента, не реплицируется, но сохраняется в клетке и транскрибируется. Это явление носит название абортивной трансдукции.
Специфическая трансдукция
Наиболее хорошо изучена специфическая трансдукция на примере фага л. Этот фаг встраивается только в один участок (att-сайт) хромосомы E. coli с определённой последовательностью нуклеотидов (гомологичной att-участку в ДНК фага). Во время индукции его исключение может пройти с ошибкой (вероятность 10?3--10?5 на клетку): вырезается фрагмент тех же размеров что и ДНК фага, но с началом не в том месте. При этом часть генов фага теряется, а часть генов E. coli захватывается им. Вероятность переноса гена в этом случае падает при увеличении расстояния от него до att-сайта.
Для каждого специфически встраивающегося в хромосому умеренного фага характерен свой att-сайт и, соответственно, расположенные рядом с ним гены, которые он способен передавать. Ряд фагов может встраиваться в любое место на хромосоме и переносить любые гены по механизму специфической трансдукции. Кроме того, в хромосоме обычно есть последовательности, частично гомологичные att-участку ДНК фага. При повреждении полностью гомологичного att-сайта можно добиться включения фага в хромосому по этим последовательностям и передачу в ходе специфической трансдукции генов, соседних уже с ними.
Когда умеренный фаг, несущий бактериальные гены, встраивается в хромосому новой бактерии-хозяина, она содержит уже два одинаковых гена -- собственный и принесённый извне. Поскольку фаг лишён части собственных генов, часто он не может индуцироваться и размножиться. Однако при заражении этой же клетки «вспомогательным» фагом того же вида, индуцирование дефектного фага становится возможным. Из хромосомы выходят и реплицируются как ДНК нормального «вспомогательного» фага, так и ДНК дефектного, вместе с переносимыми им бактериальными генами. Поэтому около 50% образующихся фаговых частиц несут бактериальную ДНК. Это явление носит название трансдукции с высокой частотой (HFT от англ. high frequency transduction).
Конъюгамция (от лат. conjugatio -- соединение), парасексуальный процесс -- однонаправленный перенос части генетического материала (плазмид, бактериальной хромосомы) при непосредственном контакте двух бактериальных клеток. Открыт в 1946 году Дж. Ледербергом и Э. Тайтемом. Имеет большое значение в природе, поскольку способствует обмену полезными признаками при отсутствии истинного полового процесса. Из всех процессов горизонтального переноса генов конъюгация позволяет передавать наибольшее количество генетической информации.
Механизм
Для успешного установления контакта двух клеток в клетке-доноре должна присутствовать конъюгативная (половая, трансмиссивная) плазмида. Первой из них была открыта F-плазмида: эписома (способная встраиваться в бактериальную хромосому), длиной около 100 тыс. пар оснований. Плазмида несёт гены, кодирующие ряд функций. Одна из них -- образование половых пилей, отвечающих за приклепление к клетке-реципиенту.
Конъюгативные плазмиды также кодируют белки, противодействующие прикреплению пилей других бактерий к клеточной стенке данной. Поэтому клетки, уже содержащие трансмиссивные плазмиды, на несколько порядков реже выступают в роли реципиентов при конъюгации.
Плазмидой кодируется эндонуклеаза, разрезающая одну из нитей её ДНК в определённой точке (oriT). Затем разрезанная цепь раскручивается и 5"-концом переносится в клетку-реципиент. Выдвигалось предположение, что ДНК передаётся по каналам в половых пилях, но к настоящему времени показано, что перенос идёт через поры в клеточной стенке. В первом сегменте поступающей в клетку реципиента нити ДНК расположены антирестрикционные гены. Эти гены должны транскрибироваться в реципиенте сразу же после своего поступления туда, чтобы обеспечить накопление белков, блокирующих процесс разрушения ДНК рестриктазами. Наконец, переданная цепь замыкается в кольцо и на её основе восстанавливается двунитевая структура ДНК плазмиды. Весь процесс длится несколько минут.
Конъюгативная плазмида может встраиваться в хромосому путём гомологичной рекомбинации с участием IS-элементов. Конъюгация при этом идёт по тому же механизу, однако реципиенту передаётся не только плазмида, но и хромосомный материала донора. В этом случае процесс затягивается на часы, часто происходит разрыв передаваемой нити ДНК. Путём искусственного прекращения передачи ДНК в разное время и наблюдения за тем, какие гены были при этом переданы, была получена карта хромосомы кишечной палочки (E. coli) и показано её кольцевое строение.
При выщеплении из хромосомы плазмида может захватывать её фрагмент и переносить его с собой в другую клетку (аналогия с трансдукцией). Данный процесс носит название сексдукции.
Некоторые мелкие плазмиды, называемые мобилизуемыми, могут быть перенесены при конъюгации с помощью аппарата переноса «хелперной» трансмиссивной плазмиды. Для этого они должны содержать последовательности, аналогичные oriT конъюгативной плазмиды и распознаваемые её эндонуклеазами.
Loading...