Procesul de formare a genomilor care conțin material genetic din două forme parentale. În bacterii se realizează ca urmare a conjugării, transformării, transducției.
Recombinările sunt împărțite în legale și ilegale. Recombinarea legitimă necesită prezența unor întinderi extinse și complementare de ADN în moleculele de recombinare. Apare numai între specii de microorganisme strâns înrudite.
Recombinarea nelegitimă nu necesită prezența unor regiuni ADN complementare extinse.
Transformare- procesul de absorbție de către o celulă a unui organism a unei molecule de ADN liber din mediu și integrarea acesteia în genom, ceea ce duce la apariția într-o astfel de celulă a unor noi caracteristici ereditare caracteristice organismului donator de ADN. Celule capabile să accepte un donator
ADN-ul se numește competent. Starea de competență nu durează mult. Are loc într-o anumită perioadă de creștere a unei culturi bacteriene. Aparent, acest lucru se datorează faptului că fragmentul de ADN transformat se leagă de proteină, formând un transformazom, în care este transferat în celula bacteriană. Proces de transformare:
1).Adsorbția ADN-ului donor pe celula primitoare.
2) pătrunderea ADN-ului în celula primitoare;
3) Conexiune ADN cu o regiune omoloagă a cromozomului receptor, urmată de recombinare.
După pătrunderea în celulă, ADN-ul în transformare despira. Apoi, oricare dintre cele două catene ale ADN-ului donatorului este încorporată fizic în genomul primitorului.
Transducția- procesul de transfer a ADN-ului bacterian de la o celulă la alta de către un bacteriofag.
Nespecific: fagii transductori sunt doar un purtător de material genetic de la o bacterie la alta, deoarece ADN-ul fag în sine nu este implicat în formarea recombinantelor.
Specific: caracterizat prin capacitatea unui fag de a transfera anumite gene de la o bacterie donatoare la o bacterie -
către destinatar.
Avortiv: fragmentul de ADN al bacteriei donatoare adus de fag nu este inclus în cromozomul bacteriei primitoare, ci este localizat în citoplasmă.
Conjugare- transferul unidirecţional al unei părţi din materialul genetic prin contactul direct a două celule bacteriene.
Prima etapă este atașarea celulei donatoare la celula primitoare folosind vilozitățile sexuale. Apoi, se formează o punte de conjugare între ambele celule prin care factorul F și alte plasmide situate în citoplasma bacteriei donatoare în stare autonomă. fi transferat de la celula donatoare la celula primitoare.
Transpunerea- deplasarea anumitor elemente genetice dintr-un loc pe un cromozom în altul.
infecție de digestie microbiană
Recombinarea este procesul de schimb de material genetic prin ruperea și unirea diferitelor molecule. Recombinarea are loc pentru a repara rupturile duble catenare ale ADN-ului și pentru a continua replicarea atunci când furculița de replicare se blochează în eucariote, bacterii și arhei. Virușii se pot recombina între moleculele de ARN ale genomului lor.
Recombinarea la eucariote are loc de obicei în timpul încrucișării în timpul procesului de meioză, în special în timpul formării spermatozoizilor și a ovulelor la animale. Recombinarea, împreună cu replicarea ADN-ului, transcripția ARN și translatarea proteinelor, este una dintre recombinările omoloage fundamentale, timpurii.
Recombinare omologa
Clasificarea tipurilor de recombinare omoloagă: alelecă, ectopică și homeologă; reciprocă (încrucișare) și non-reciprocă (conversie genetică).
Recombinare reciprocă. Ideile timpurii despre natura crossing over: ipotezele „break and join” și „copiere selectivă”. Experimentele lui Meselson pentru a demonstra mecanismul „break and join”. Dezvoltarea abordărilor metodologice pentru studiul mecanismelor moleculare de recombinare. Două etape ale formării ADN-ului recombinant: „articulație” și molecule recombinate primare.
Controlul genetic al recombinării omoloage la bacteriofagi. Sistemul roșu în bacteriofag l. Exonucleaza l. Sistemul Orf. Bacteriofagul T4: rolul genelor 30, 32, 43, 46, 47, 49 și uvsX. Enzimologia reacțiilor de recombinare: endo- și exonucleaze, ADN polimerază, ADN ligază, proteină UvsX, proteină SSB și alte proteine. Procese de „deplasare a firelor”, formarea buclei D, „migrarea ramurilor”, corecția heteroduplex. Principalele etape ale crossing over sunt: presinapsia, sinapsa și postsinapsia. Modele de încrucișare la bacteriofagi. Caracterul comun al proceselor de recombinare și reparare a ADN-ului.
Modele de bază ale recombinării omoloage. Model de vacanta. Condiții preliminare ale modelului, esența, sensul. Dezvoltarea modelului în studiile ulterioare, sa starea actuală. Modelul Meselson-Reading. Model de reparare a ruperii duble-catenari a ADN-ului (DSB) în drojdie (Zhostak și colab.) în ceea ce privește încrucișarea și conversia.
Recombinarea în timpul transformării ADN-ului cromozomial în bacterii. Parametrii de recombinare. Dimensiunile fragmentelor de ADN donator integrat. Cinetica și eficiența transformării. Dovezi de integrare a fragmentelor monocatenar de ADN donor. Controlul genetic și principalele etape ale procesului de transformare la Bacillus subtilis și Streptococcus pneumoniae. Complex donator-recipient. Control genetic și mecanism de recombinare în timpul transformării în Haemophilus influenzae. Transformosom.
Recombinarea în timpul conjugării Escherichia coli. Caracteristicile transferului de ADN conjugativ. Mecanisme de integrare a ADN-ului donor în cromozomul celulei primitoare.
Controlul genetic al recombinării omoloage la E. coli. Gene implicate în presinapsie: recA, recB, recC, recD, recE, recJ etc. Efectul pleiotrop al mutațiilor recB și recC. Nucleaza RecBCD dependentă de ATP, activitățile sale, mecanismele de acțiune și rolurile în diferite procese genetice. Site-ul Chi ca punct fierbinte de recombinare. Versatilitatea nucleazelor dependente de ATP pentru bacterii. Gene care controlează procesul de sinapsă: recA, recF, recO, recR, ssb etc. Proprietăți ale mutanților recA. Proteina RecA, caracteristicile sale. Reacții catalizate de proteina RecA, rolul ei cheie în primele etape ale procesului de crossing over: presinapsis și sinapsis. Natura sinapselor în timpul recombinării omoloage. Filamentele de ADN RecA, structura și funcțiile lor în recombinare. Schema de încrucișare în E. coli cu participarea nucleazei RecBCD și a proteinei RecA. Omologi RecA în alte organisme procariote și eucariote. Rolul proteinei SSB. Gene post-synapsis: ruvA, ruvB, ruvC, recG și produsele lor. Rolul în migrarea hemichiasmei Holliday și rezoluția acesteia.
Mutații supresoare sbcA, sbcB, sbcC și sbcD. Exonucleazele I și VIII. nucleaza SbcCD. Trei căi de recombinare a ADN-ului cromozomial în E. coli K-12 conform Clark: RecBCD, RecF și RecE, caracteristicile lor. Rolul căilor RecF și RecE în recombinarea omoloagă a plasmidelor.
Caracteristicile procesului de încrucișare la eucariote. Trecerea meiotică. Rolul complexului sinaptonemal. Controlul genetic al recombinării meiotice. Diversitatea proteinelor asemănătoare RecA (recombinaze) la eucariote.
Încrucișarea mitotică: relația dintre recombinarea reciprocă și non-reciprocă. Încrucișarea în celulele G1. Diferențele în controlul genetic al încrucișării meiotice și mitotice în drojdia Saccharomyces.
Puncte fierbinți de recombinare la eucariote. Rolul ADN-ului DNR în inițierea încrucișării meiotice și mitotice.
Repararea prin recombinare a DNR-urilor în ADN-ul cromozomial și plasmidic din drojdie. Controlul genetic și diversitatea mecanismelor: modelul lui Zhostak și colab. și modificările acestuia, mecanisme de „ruptură și copiere”, „recoacerea catenelor complementare” („recoacerea monocatenară”), „ligatura dependentă de omolog”.
Recombinarea ectopică, controlul său genetic, mecanismele moleculare și semnificația biologică.
Conversia genelor (corecția heteroduplex de recombinare). Nereciprocitatea recombinării intragenice. Ipoteza corecției bazei nepereche (Halliday). Control genetic și căi de corecție pentru heteroduplexuri în E.coli. Sisteme pentru repararea bazelor nepereche cu formarea și construcția de goluri extinse în heteroduplex. Sistemul Mut HLSU, caracteristicile sale. Model molecular de corecție heteroduplex care implică sistemul MutHLSU. Conservarea evolutivă a proteinelor MutL și MutS. Rolul proteinelor MutL și MutS în procesele de corecție a bazelor nepereche și în reglarea recombinării homeologe. Sisteme de corectare a bazelor nepereche la E.coli cu formarea și construcția de goluri scurte. Corectarea heteroduplexurilor în timpul transformării bacteriene, controlul său genetic (sistemul Hex), influența asupra rezultatelor cartografierii genetice. Corecție și interferență negativă ridicată.
Conversia genelor la eucariote. Analiza tetradă a încrucișărilor interalelice. Tipuri de caiete. Polaritatea conversiei, motivele acesteia. Coconversie. Lungimea secțiunii de conversie. Problema conexiunii dintre conversia meiotică și recombinarea reciprocă a markerilor de flancare. Conversia genei alelice mitotice. Conversie ectopică meiotică și mitotică. Schimbarea loci MAT în drojdia homotalică. Controlul genetic al conversiei genelor la ecariote folosind exemple de drojdie și oameni. Omologi eucariote ai proteinelor bacteriene MutL și MutS - familii de proteine PMS, MHL, MHS etc., funcțiile lor în recombinare și altele procesele celulare. Complexitatea sistemelor de corecție a nepotrivirii la eucariote, bazată pe participarea diverșilor omologi ai proteinelor bacteriene MutL și MutS.
Rolul conversiei în evoluție și ontogeneză. Relația dintre procesele de încrucișare și conversie în diferite sisteme genetice. Procese de conversie care au loc independent de crossover.
Procese de recombinare care nu necesită omologie pentru sinapsă
Recombinare specifică site-ului. Distribuția sistemelor de recombinare specifică locului în procariote și eucariote, funcțiile acestora. Topoizomerazele specifice locului de tip I ca proteine cheie ale recombinării specifice locului în bacteriofagi, bacterii și drojdii. Două familii de topoizomeraze I site-specifice sunt integraze și rezolvaze.
Recombinarea specifică locului în timpul integrării și exciziei fagului l. Schema lui Campbell. Diferențele dintre hărțile genetice ale fagului vegetativ și ale profagului. Structura site-urilor attP și attB. Sistem int. Proteina int ca reprezentant al familiei integrazelor. Proteina IHF de E. coli. Intasoma. Modelul molecular de integrare și excizie a fagului l. Alinierea antiparalelă a locurilor att în timpul sinapsei. Natura sinapsei în timpul recombinării specifice locului.
Inversări ale ADN-ului specifice locului în bacteriofagi și bacterii (sistem Din) și în drojdie. Proteinele cheie de recombinare sunt invertazele ca reprezentanți ai familiei rezolvazelor. Amplificatori de recombinare pentru inversiuni specifice site-ului. Proteina E. coli Fis. Invertazomul. Model molecular de recombinare realizat de rezolvaze. Rolul inversiilor specifice site-ului în reglarea expresiei genelor.
Transpunerea elementelor genetice mobile. Transpoziții la procariote. Elemente genetice mobile: elemente IS, transpozoni (Tn), fagi Mu. Structura elementelor în mișcare. Funcții controlate de diferite elemente în mișcare. Transpoziza. Participarea proteinelor celulei gazdă la transpunere. Problema specificității integrării elementului mobil în ADN-ul țintă. Comunitatea reacțiilor care alcătuiesc procesele de transpunere în diferite tipuri elemente mobile ale procariotelor și eucariotelor.
Organizarea genetică a transpozonilor simpli din familia Tn3. Genele tnpA și tnpR, produsele lor. Transpunerea replicativă, două etape ale procesului. Modelul molecular al lui Shapiro. Controlul genetic și mecanismul molecular al transpoziției nereplicative în transpozonii complecși Tn5, Tn9 și Tn10. Control genetic și mecanisme de transpunere în fagul Mu. Transpozozom.
Transpozonii conjugativi ai bacteriilor gram-pozitive și gram-negative, clasificarea lor. Control genetic și mecanisme de transpunere. Semnificație biologică.
Elemente genetice mobile ale eucariotelor (drojdie, plante, Drosophila, mamifere). Clasificarea elementelor mobile eucariote. Elemente cu structură de tip procariot. Retrotranspozoni de tip I în drojdii, plante și animale, structura acestora, controlul genetic și mecanismul de transpunere, clasificare. Retrotranspozonii de tip II: caracteristici structurale, distribuție, mecanism de transpunere.
Efecte genetice cauzate de elementele transpozabile la procariote și eucariote: modificări ale expresiei genelor, mutații genetice, rearanjamente cromozomiale, disgeneza hibridă. Participarea elementelor mobile la organizarea structurii cromozomilor. Rol în ontogeneza organismelor vii și în evoluția materialului genetic. Elemente mobile ca instrument de cercetare genetică.
Recombinare ilegală. Gama de fenomene atribuite recombinării ilegale. Recombinare neomoloagă în bacterii catalizate de ADN-girază. Model molecular (Ikeda). Recombinare neomoloagă care implică protein kinaza dependentă de ADN la vertebrate. Rol în repararea rupurilor dublu-catenar, integrarea ADN-ului exogen în cromozomi și rearanjarea secvențelor de ADN imunoglobuline.
Rearanjamente programate de recombinare a materialului genetic în ontogeneză
Unirea părților deconectate ale genelor folosind recombinarea specifică locului în timpul sporulării în Bacillus subtilis și în timpul formării heterochisturilor în cianobacteriile filamentoase. Rearanjarea materialului genetic în timpul formării unui macronucleu în ciliați ciliați. Diminuarea cromatinei la un număr de reprezentanți a nevertebratelor.
Recombinarea specifică locului la vertebrate implicate în rearanjarea secvențelor de ADN imunoglobulinei. Structura moleculelor de imunoglobuline. Organizarea și structura secvențelor de ADN implicate în formarea genelor care codifică imunoglobuline. Rolul produselor genelor RAG1 și RAG2. Mecanismul recombinării specifice locului în timpul unirii segmentelor codificatoare ale genelor imunoglobulinei. Participarea altor procese genetice la formarea genelor de imunoglobuline: recombinare omoloagă (încrucișare mitotică ectopică, conversie mitotică ectopică), recombinare ilegală, hipermutageneză, splicing alternativ. Asocierea acestor procese cu anumite etape de diferențiere a limfocitelor B.
Transformarea este procesul de absorbție de către o celulă a unui organism a unei molecule de ADN liber din mediu și integrarea acesteia în genom, ceea ce duce la apariția într-o astfel de celulă a unor noi caracteristici ereditare caracteristice organismului donator de ADN. Uneori, transformarea este înțeleasă ca orice proces de transfer orizontal al genelor, inclusiv transducția, conjugarea etc.
Transformarea procariotelor
În orice populație, doar o parte din bacterii sunt capabile să absoarbă moleculele de ADN din mediu. Starea celulelor în care acest lucru este posibil se numește stare de competență. De obicei, numărul maxim de celule competente este observat la sfârșitul fazei de creștere logaritmică.
Într-o stare de competență, bacteriile produc o proteină specială cu un nivel molecular scăzut (factor de competență) care activează sinteza autolizinei, a endonucleazei I și a proteinei de legare a ADN-ului. Autolizina distruge parțial peretele celular, ceea ce permite ADN-ului să treacă prin el și, de asemenea, reduce rezistența bacteriilor la șocul osmotic. Într-o stare de competență scade și rata metabolică globală. Este posibilă aducerea artificială a celulelor într-o stare de competență. Pentru a face acest lucru, utilizați medii cu un conținut ridicat de calciu, cesiu, ioni de rubidiu, electroporare sau înlocuiți celulele primitoare cu protoplaste fără pereți celulari.
Eficiența transformării este determinată de numărul de colonii crescute pe o placă Petri după adăugarea a 1 μg de ADN plasmid supercoiled la celule și însămânțarea celulelor pe un mediu nutritiv. Metode moderne permit realizarea eficientei 106--109.
ADN-ul absorbit trebuie să fie dublu catenar (eficiența transformării ADN-ului monocatenar este cu ordine de mărime mai mică, dar crește ușor în mediu acid), lungimea sa este de cel puțin 450 de perechi de baze. pH-ul optim pentru proces este de aproximativ 7. Pentru unele bacterii (Neisseria gonorrhoeae, Hemophilus), ADN-ul absorbit trebuie să conțină anumite secvențe.
ADN-ul este adsorbit ireversibil pe o proteină de legare a ADN-ului, după care una dintre fire este tăiată de endonuclează în fragmente lungi de 2-4 mii de perechi de baze și pătrunde în celulă, a doua este complet distrusă. Dacă aceste fragmente au un grad ridicat de omologie cu orice secțiuni ale cromozomului bacterian, este posibil să înlocuiți aceste secțiuni cu ele. Prin urmare, eficiența transformării depinde de distanța evolutivă dintre donator și primitor. Timp total procesul nu depășește câteva minute. Ulterior, în timpul diviziunii, ADN-ul construit pe baza catenei originale de ADN intră într-o celulă fiică, iar ADN-ul construit pe baza unei catene cu un fragment străin inclus (clivaj) intră într-o altă celulă fiică.
Transformarea celulelor eucariote folosind cationi polimeri sintetici
Livrarea acizilor nucleici străini în celulele intacte sau transformarea stă la baza multor metode inginerie genetică. Transportul genelor funcționale în țesuturi poate face posibilă corectare deficiență genetică și mutații, care au ca rezultat patologii ereditare severe sau tumori canceroase. Dezvoltat în prezent o serie intreaga tehnici de introducere a ADN-ului în celule, dintre care cele mai frecvente sunt precipitarea cu fosfat de calciu sau dietilaminoetil-dextran (DEAE-dextran), electroporarea, microinjectarea, încorporarea ADN-ului în învelișul reconstruit al virusurilor sau lipozomilor (vezicule lipidice cu membrană artificială).
În ciuda diversității acestor metode, căutarea unor noi modalități de transformare a celulelor pro- și eucariote continuă. Pe de o parte, acest lucru este cauzat de necesitatea de a crește eficiența transformării, pe de altă parte, metodele enumerate mai sus sunt aplicabile doar unui număr limitat de linii celulare și sunt ineficiente atunci când se încearcă introducerea ARN-ului în celule. În cele din urmă, majoritatea acestor abordări nu pot fi utilizate pentru transformarea genetică in vivo.
Ca purtători de ADN sunt utilizați vectori retrovirali, vectori bazați pe virusuri care conțin ADN și HIV, lipozomi pe bază de lipide cationice și cationi polimerici de legare la ADN. Utilizarea polimerilor sintetici ca purtători de ADN are o serie de avantaje: ușurință de depozitare și purificare, ușurință de testare pentru toxicitate și siguranță și, cel mai important, pentru terapia genică, reducând riscul de complicații patogenetice și imunologice.
Când se amestecă soluții de policationi liniari și ADN, se formează complexe interpolielectrolitice (IPEC) datorită formării unui sistem cooperant de legături electrostatice între lanțuri. În acest caz, lanțurile policationice înconjoară molecula de ADN, formând sfere sau toroidi, în funcție de tipul de polimer. Includerea în IPEC duce la compactarea ADN-ului, crește rezistența acestuia la acțiunea nucleazelor, îmbunătățește interacțiunea cu membrana celulară și crește activitatea de transformare în raport cu celulele procariote și eucariote. Prin combinarea moleculelor de polication cu liganzi capabili de legarea specifică la membrana celulară, este posibil să se asigure pătrunderea IPEC în celulă prin calea receptorului și în organism - livrarea țintită către celulele țintă.
Sistemele de livrare a ADN-ului pentru utilizare în terapia genică trebuie să asigure pătrunderea ADN-ului în organul, țesutul sau grupul specific de celule dorit și apoi în nucleul celulei. Oligonucleotidele antisens, care sunt cele mai des folosite în terapia genică, trebuie să găsească ARNm sau regiunea ADN-ului cromozomial împotriva căreia sunt îndreptate. Gena introdusă trebuie să facă parte dintr-un construct capabil să o exprime.
Cu toate acestea, aceasta este o problemă destul de complexă. Când este introdus acid nucleic sau oligonucleotide în organism, acestea nu vor ajunge predominant la țesutul sau organul dorit, iar partea dintre ele care ajunge în locul potrivit va putea trece prin membrana celulară hidrofobă doar într-o mică măsură. În plus, în timpul evoluției, s-au dezvoltat mecanisme pentru a proteja celulele corpului de factorii invadatori. mediu extern, inclusiv ADN străin. Odată intrat în celulă, ADN-ul străin poate să nu fie localizat acolo unde este necesar și, în plus, poate ajunge în lizozomi, unde va fi distrus de nucleaze.
Penetrarea în celulă și transportul intracelular al IPEC are loc, posibil, datorită formării și distrugerii secvențiale a endozomilor. În fiecare etapă a acestui proces, o parte semnificativă a materialului se pierde. Eliberarea slabă a vectorilor din endozomi în citoplasmă și transportul lor ineficient în nucleu duc la o eficiență scăzută a expresiei transgenelor.
Harta de restricție a plasmidei pBR 322:
numerele indică numerotarea nucleotidelor;
linii subțiri - situsuri unice recunoscute de enzimele de restricție;
săgeți groase gri deasupra - direcția transcripției;
Pbla - promotor al genei Ampr - rezistență la ampicilină;
Ptet - promotor al genei Tetr - rezistență la tetraciclină;
TT1 - Terminator de transcripţie Rho-independent (poziţia 3140-3160); TT2 - pozitia 3080-3110; ROP este o proteină care favorizează formarea de duplexuri între ARN 1 și ARN 2 (regulator negativ al numărului de copii); ARN 1 - control ARN (controlează numărul de copii ale plasmidei); ARN 2 - ARN „primer” (servește ca primer pentru replicare); săgeți negre groase - direcția transcripției ARN 1 și ARN 2
Vectori bazați pe fagul M13
Există trei moduri de a crește eficiența transferului de ADN în celulele eucariote folosind policationi sintetici. În primul rând, crește specificitatea transfecției datorită liganzilor conectați la o moleculă de polication și asigurând interacțiunea selectivă a complexelor cu celulele unui anumit fenotip. În al doilea rând, creșterea eficienței transformării datorită selecției genelor sau oligonucleotidelor introduse în celulă. În al treilea rând, o creștere a frecvenței de transfecție, care se realizează prin utilizarea liganzilor care interacționează mai eficient cu membrana celulară și a substanțelor care destabilizează membrana. În plus, sinteza de noi policationi este posibilă.
Laboratorul de Virologie Moleculară și Inginerie Genetică al Institutului de Cercetare a Gripei al Academiei Ruse de Științe Medicale din Sankt Petersburg studiază mijloacele de livrare a ADN-ului și a particulelor virale în celule. Această lucrare folosește un set de suporturi polimerice sintetizate de angajații Institutului de Compuși Macromoleculari al Academiei Ruse de Științe. Următoarele plasmide au fost utilizate ca vectori de expresie: pUC 18, care conține promotorul citomegalovirusului și gena b-galactozidazei și pBR 322, care conține promotorul citomegalovirusului și gena proteinei fluorescente verde algă.
Ca rezultat al studiilor, s-a descoperit că IPEC-urile poli-(2-(dimetilamino)etil) metacrilat (PDMAEMA) cu greutăți moleculare scăzute au cea mai mare activitate de transfecție. Cercetările ulterioare ne vor permite să dezvoltăm noi abordări de rezolvare problemele actualeîn virologie, moleculară și biologie celulară, inginerie genetică, terapie genetică.
Transducția (din latină transductio - mișcare) este procesul de transfer a ADN-ului bacterian de la o celulă la alta de către un bacteriofag. Transducția generală este utilizată în genetica bacteriană pentru cartografierea genomului și ingineria tulpinilor. Atât fagii temperați, cât și cei virulenți sunt capabili de transducție, cei din urmă distrug însă populația bacteriană, așa că transducția cu ajutorul lor nu are o importanță deosebită nici în natură, nici în cercetare.
Transducție generală (nespecifică).
Este realizat de fagul P1, care există în celula bacteriană sub formă de plasmidă, și de fagii P22 și Mu, care se integrează în orice parte a cromozomului bacterian. După inducția profagului, cu o probabilitate de 10-5 per celulă, este posibilă ambalarea eronată a unui fragment de ADN bacterian în capsidul fagului, în acest caz, nu există ADN fag în acesta; Lungimea acestui fragment este egală cu lungimea ADN-ului fag normal, originea sa poate fi orice: o parte aleatorie a cromozomului, o plasmidă, alți fagi temperați.
Odată ajuns într-o altă celulă bacteriană, un fragment de ADN poate fi încorporat în genomul său, de obicei prin recombinare omoloagă. Plasmidele transferate de fag sunt capabile să se închidă într-un inel și să se reproducă deja în interior cușcă nouă. În unele cazuri, un fragment de ADN nu este integrat în cromozomul receptor și nu este replicat, ci este stocat în celulă și transcris. Acest fenomen se numește transducție abortivă.
Transducția specifică
Transducția specifică a fost studiată cel mai bine folosind exemplul fagului L. Acest fag este integrat într-o singură regiune (sit-at) a cromozomului E. coli cu o secvență specifică de nucleotide (omologă cu situ-ul att din ADN-ul fagului). În timpul inducției, excluderea sa poate apărea cu o eroare (probabilitate 10-3--10-5 per celulă): un fragment de aceeași dimensiune ca ADN-ul fag este tăiat, dar cu începutul în locul greșit. În acest caz, unele dintre genele fagului sunt pierdute, iar unele dintre genele E. coli sunt capturate de acesta. Probabilitatea transferului de gene în acest caz scade odată cu creșterea distanței de la aceasta la locul att.
Fiecare fag temperat integrat în mod specific în cromozom este caracterizat de propriul său site att și, în consecință, de gene situate lângă el pe care este capabil să le transmită. O serie de fagi se pot integra în orice loc de pe cromozom și pot transfera orice gene printr-un mecanism de transducție specific. În plus, cromozomul conține de obicei secvențe care sunt parțial omoloage cu regiunea att a ADN-ului fagului. Dacă un situs att complet omolog este deteriorat, este posibil să se realizeze includerea fagului în cromozom de-a lungul acestor secvențe și transferul de gene adiacente acestora în timpul transducției specifice.
Când un fag temperat purtător de gene bacteriene este integrat în cromozomul unei noi bacterii gazdă, acesta conține deja două gene identice - proprii și cele aduse din exterior. Deoarece fagul îi lipsește o parte din propriile sale gene, adesea nu poate fi indus și nu se poate reproduce. Cu toate acestea, atunci când aceeași celulă este infectată cu un fag „ajutor” din aceeași specie, inducerea unui fag defect devine posibilă. Atât ADN-ul fagului „ajutor” normal, cât și ADN-ul fagului defect ies din cromozom și se reproduc, împreună cu genele bacteriene pe care le poartă. Prin urmare, aproximativ 50% din particulele de fagi rezultate poartă ADN bacterian. Acest fenomen se numește transducție de înaltă frecvență (HFT).
Conjugare (din latină conjugatio - conexiune), proces parasexual - transfer unidirecțional al unei părți din materialul genetic (plasmide, cromozom bacterian) prin contactul direct a două celule bacteriene. Descoperit în 1946 de J. Lederberg și E. Taitem. Are mare valoareîn natură, deoarece promovează schimbul de caracteristici utile în absența unui adevărat proces sexual. Dintre toate procesele de transfer orizontal al genelor, conjugarea permite transferul cel mai mare număr informatii genetice.
Mecanism
Pentru a stabili cu succes contactul între două celule, în celula donatoare trebuie să fie prezentă o plasmidă conjugativă (sex, transmisibilă). Prima dintre ele a fost descoperirea plasmidei F: un epizom (capabil să se integreze în cromozomul bacterian), lung de aproximativ 100 de mii de perechi de baze. Plasmida poartă gene care codifică un număr de funcții. Una dintre ele este formarea pililor sexuali, care sunt responsabili de aderența la celula primitoare.
Plasmidele conjugative codifică, de asemenea, proteine care împiedică atașarea pili-urilor altor bacterii de peretele celular al uneia date. Prin urmare, celulele care conțin deja plasmide transmisibile au câteva ordine de mărime mai puțin probabil să acționeze ca receptori pentru conjugare.
Plasmida codifică o endonuclează care taie una dintre catenele ADN-ului său la un anumit punct (oriT). Apoi firul tăiat se desfășoară și capătul de 5" este transferat în celula primitoare. S-a sugerat că ADN-ul este transferat prin canalele din pili sexuali, dar acum s-a demonstrat că transferul are loc prin porii din peretele celular. primul segment al firului care intră în celula receptoare Genele anti-restricție sunt localizate în ADN Aceste gene trebuie transcrise în receptor imediat după sosirea lor acolo pentru a asigura acumularea de proteine care blochează procesul de distrugere a ADN-ului prin enzime de restricție , lanțul transferat este închis într-un inel și structura dublu catenară a ADN-ului plasmid este restaurată pe baza acestuia.
Plasmida conjugativă poate fi integrată în cromozom prin recombinare omoloagă care implică elemente IS. Conjugarea urmează același mecanism, dar nu numai plasmida este transferată receptorului, ci și materialul cromozomial al donatorului. În acest caz, procesul durează ore întregi, iar catena de ADN transmisă se rupe adesea. Prin oprirea artificială a transferului de ADN în momente diferite și observând ce gene au fost transferate, s-a obținut o hartă a cromozomului coli(E. coli) și este prezentată structura sa inelară.
Când este scindată dintr-un cromozom, plasmida își poate capta fragmentul și îl poate transfera cu sine într-o altă celulă (analogie cu transducție). Acest proces se numește sexducție.
Unele plasmide mici, numite plasmide mobilizabile, pot fi transferate în timpul conjugării folosind aparatul de transfer al plasmidelor transmisibile „ajutor”. Pentru a face acest lucru, ele trebuie să conțină secvențe similare oriT al plasmidei conjugative și recunoscute de endonucleazele sale.
Recombinarea genetică la eucariote este formarea de indivizi cu o nouă combinație de caracteristici ca urmare a procesului sexual. Noul individ primește mai multe gene de la un părinte și mai multe de la un alt părinte, diferit genetic. Prin procesul de recombinare, numărul modificărilor ereditare care pot fi afectate de selecție crește.
La procariote, recombinarea genetică este un așa-numit proces parasexual. În aceste organisme, sunt cunoscute trei procese prin care materialul genetic de la doi părinți diferiți se poate recombina. Acestea sunt transformarea, conjugarea și transducția. Cu toate acestea, în niciunul dintre aceste procese nu are loc fuziunea celulară adevărată sau fuziunea completă a nucleoizilor. Doar o parte din materialul genetic al celulei donatoare este transferată în celula primitoare. Beneficiarul devine astfel diploid deoarece o parte din materialul său genetic este completat de materialul genetic al donatorului.
Într-un astfel de zigot incomplet, numit merozigot, format ca urmare a transferului de gene, materialul genetic al celulei primitoare se numește endogen, iar fragmentul genetic transferat de la donor este numit exogen. De obicei, părțile exogene și endogene sunt conectate și schimbă segmente imediat după transfer.
Transformare este un proces de transfer de gene în care o parte din ADN-ul unei celule donatoare, obținută fie prin extracție, fie prin liză naturală a celulei, poate pătrunde într-o celulă bacteriană receptoare înrudită (din aceeași specie sau din specii strâns înrudite). Ca urmare, fragmente din cromozomul ADN al donatorului sunt incluse în ADN-ul primitorului, ceea ce determină o modificare a caracteristicilor bacteriei primitoare.
Procesul de transformare poate fi împărțit în mai multe etape: 1 - contactul ADN-ului cu suprafața celulei; 2 - pătrunderea ADN-ului în celulă; 3 - legătura ADN-ului transformator cu fragmentul corespunzător al cromozomului receptor. Procesul ulterior este asociat cu recombinarea unei părți a moleculei de ADN transformatoare exogene cu ADN-ul cromozomial endogen receptor. Ultima etapă este replicarea noilor informații incluse în cromozom.
În condiții de laborator, transformarea se realizează după cum urmează. ADN-ul unei anumite tulpini de bacterii este extras, purificat și amestecat cu celule de bacterii ale unei alte tulpini care diferă de prima prin una sau mai multe proprietăți ereditare. Cultura microorganismului experimental este lăsată să crească. Printre descendenți se poate găsi un număr mic de celule cu unele proprietăți ale tulpinii din care a fost extras ADN-ul.
Foarte rar se întâmplă ca o singură celulă bacteriană să dobândească mai mult de o nouă proprietate ca urmare a transformării. Transmiterea unui număr mai mare de trăsături prin ADN se observă doar dacă cultura microbului donor este apropiată genetic de celulele microbului receptor.
Cu ajutorul transformării ADN-ului, caracteristici precum formarea capsulei, sinteza necesare celulei substanțe, activitate enzimatică, rezistență la otrăvuri, antibiotice și altele substante medicinale.
Transformarea a fost observată la multe bacterii, în special la reprezentanții genurilor Bacillus, Rhizobium, Streptococcus etc.
Conjugare- un proces în care celulele părinte apropiate sunt conectate, de obicei cu ajutorul punților de conjugare, prin care se fac schimb de materiale genetice. Conjugarea a fost studiată în diferite bacterii (Escherichia, Shigella, Salmonella, Pseudomonas în special, a fost bine studiată în Escherichia coli).
Capacitatea unei celule de a deveni donator este determinată de factorul sexual specific F (din engleză fertilitate - fertilitate), care, în timpul conjugării, este transferat de la o celulă bacteriană la alta. Aceste celule au fost numite celule F+. Celulele bacteriene care nu au un factor F sunt recipiente de material genetic și sunt desemnate F. Factorul sexual F este una dintre plasmidele conjugative și este o moleculă de ADN închisă circular cu o greutate moleculară de 64x106 a. e.m. Plasmida F determină formarea pe suprafața celulară a uneia sau două așa-numite fimbrie sexuale, sau F-pili, care facilitează conectarea celulelor donatoare cu celulele primitoare, precum și replicarea independentă de cromozomi a propriului ADN și formarea de produse care asigură transferul materialului genetic în sine F-plasmide și cromozomi celulari. Plasmida F este localizată în citoplasmă în mod autonom, în afara cromozomului bacterian. Cu toate acestea, are capacitatea de a fi inclus (integrat) în anumite locuri cromozomul bacterian și devin parte a acestuia.
Ca rezultat al integrării plasmidei F în cromozomul bacterian, se formează așa-numita tulpină Hfr (Frecvența înaltă de recombinare). Când o tulpină Hfr este încrucișată cu bacterii F, atunci, de regulă, factorul F nu este
Se transmite, iar genele cromozomului bacterian sunt transmise cu o frecvență destul de mare. La începutul procesului de conjugare, celulele donatoare F+ sau Hfr sunt conectate la celulele primitoare (datorită prezenței F-pili la donatori). Ulterior, între celule se formează o punte de conjugare și prin aceasta, de la celula donatoare la celula primitoare, se transferă materialul genetic sau plasmidele F sau cromozomii. De obicei, în timpul conjugării, este transferată doar o singură catenă de ADN donor, iar a doua catenă (complementară) este completată în celula primitoare. Transferul, de regulă, începe de la un capăt al cromozomului și continuă cu transferul ulterior al altor secțiuni ale acestuia (Fig. 21).
Transferul de material genetic poate fi prevenit în orice moment prin separarea perechilor de conjugare prin agitarea energic a unei suspensii de microorganisme într-un mediu lichid. În acest caz, doar unele dintre proprietățile celulelor masculine sunt transferate celulei feminine și pot apărea la descendenți. Mai devreme sau mai târziu, transferul se oprește în majoritatea perechilor de conjugare chiar și atunci când acestea nu sunt separate artificial. Acest lucru se întâmplă deoarece puntea de conjugare este fragilă și ușor distrusă fără a afecta viabilitatea celulei.
Astfel, ca urmare a conjugării, celula primitoare F - se transformă într-un merozigot, conținând, din cauza întreruperii spontane a transferului de material genetic, doar o parte din cromozomul donor F+ pe lângă propriul cromozom. Ca urmare a procesului de încrucișare (încrucișarea cromozomilor în care genele își schimbă locul), care se observă și la alte organisme, se formează o nouă combinație de material genetic. În funcție de locația materialului genetic care este schimbat, pot apărea diferite tipuri de recombinanți la descendenți.
Transducția- procesul de transfer de material genetic de la o celulă bacteriană la alta printr-un bacteriofag. Cu alte cuvinte, fagul joacă rolul unui gamet, transferând un fragment de ADN din celula donatoare în celula primitoare. Transducția are loc cu participarea fagilor temperați.
Sunt cunoscute trei tipuri principale de transducție: generală (nespecifică), localizată (specifică) și abortivă. Cu transducția nespecifică, diferite fragmente de ADN sunt transferate de la bacteriile donatoare la bacteriile primitoare cu ajutorul fagilor cu transducție moderată. În acest caz, fragmentul de ADN donor adus de fag poate fi inclus în regiunea omoloagă a ADN-ului celulei primitoare prin recombinare.
Transducția specifică este caracterizată prin capacitatea unui fag de a transfera doar anumite gene de la bacteriile donatoare la bacteriile primitoare. Acest lucru se datorează faptului că formarea unui fag transductor are loc ca urmare a conexiunii ADN-ului său cu gene bacteriene strict definite situate pe cromozomul celulei donatoare. Se crede că fiecare particulă de fag poartă fie o singură genă bacteriană, fie mai multe gene din apropiere.
La Transducția abortivă Fragmentul de cromozom al celulei donor adus de fag nu este inclus în cromozomul celulei primitoare, ci este localizat în citoplasma acesteia în mod autonom și în această formă poate funcționa. În timpul diviziunii celulei primitoare, fragmentul de ADN transdus al donorului poate fi transmis doar uneia dintre cele două celule fiice, adică este moștenit uniliniar și, prin urmare, se pierde în urmași.
În timpul transducției, este posibil să se transfere gene care controlează caracteristicile nutriționale ale bacteriilor, rezistența acestora la medicamente, activitate enzimatică, aparat motor (flagela) și alte proprietăți.
Transferul de trăsături prin procesul de transducție a fost găsit la reprezentanți ai genurilor Bacillus, Pseudomonas, Salmonella, Escherichia etc.
Recombinarea este un set de procese asociate cu înlocuirea unei secțiuni a acidului nucleic original cu o secțiune omoloagă (similară).
În acest caz, gradul de omologie poate fi diferit: de la identitatea completă a secvențelor de nucleotide originale și noi până la discrepanțe vizibile care conduc la o schimbare a fenotipului. Ca rezultat al recombinării, se formează noi combinații de alele, de exemplu: AB + ab → Ab + aB.
La procariote, există trei moduri de a încorpora ADN străin în genom: transformare, conjugare și transducție.
Transformare
Transformarea este transferul de ADN pur de la o celulă la alta. Transformarea a fost descoperită de bacteriologul F. Griffiths în 1928 în experimente cu pneumococi. Pneumococii au două tipuri de tulpini: forme S și R.
Forma S se caracterizează prin prezența unei capsule polizaharidice, datorită căreia, atunci când este cultivată artificial, formează colonii netede și strălucitoare; această formă este patogenă pentru șoareci. Forma R nu are capsulă când este cultivată artificial, formează colonii aspre; această formă este nepatogenă pentru șoareci. Dar dacă celulele S ucise și celulele R vii sunt injectate simultan în șoareci, șoarecii mor. Prin urmare, proprietățile genetice ale unei tulpini influențează proprietățile genetice ale altei tulpini.
În 1944, O. Avery, K. McLeod și M. McCarthy au demonstrat că modificările proprietăților ereditare ale celulelor sunt asociate cu transferul de ADN.
Capacitatea unei celule de a se transforma este posibilă în condiția sa specială, care se numește competență. Celulele competente își schimbă compoziția peretele celularşi plasmalema: peretele devine poros, plasmalema formează numeroase invaginări, iar pe suprafaţa exterioară apar antigene speciale - factori de competenţă (în special, proteine specifice cu greutate moleculară mică).
În condiții naturale, ADN-ul pur extracelular se formează în timpul morții (lizei) procariotelor.
De regulă, transformarea are loc în cadrul unei specii de procariote, dar în prezența genelor omoloage se observă și transformarea interspecifică.
Procesul de transformare include următoarele etape:
1. Atașarea ADN-ului dublu catenar transformat la receptorii de pe suprafața celulei primitoare.
2. Conversia ADN-ului dublu catenar în monocatenar.
3. Penetrarea ADN-ului monocatenar în celulă.
4. Integrarea transformării ADN-ului în cromozomul receptor și recombinarea materialului genetic.
Lungimea transformării ADN-ului ar trebui să fie de la 500 la 200 mii bp. Energia eliberată în timpul degradării uneia dintre catenele de ADN este utilizată pentru transportul activ al catenei rămase în celulă.
Primele trei etape de transformare nu depind de compoziția nucleotidică a ADN-ului. Cu toate acestea, procesul de integrare de transformare a ADN-ului în cromozomul receptor este mai probabil dacă acest ADN este foarte omolog cu ADN-ul receptor.
Procesul de transformare este descris în diagramă. Fiecare segment de linie dreaptă corespunde unei catene de ADN. ADN-ul transformat este indicat cu negru, iar ADN-ul celulei receptoare este indicat cu gri.
În prima etapă, transformarea ADN-ului se atașează la situsurile receptorului de pe suprafața celulei primitoare.
În a doua etapă, ADN-ul dublu catenar de pe suprafața celulei este convertit în ADN monocatenar datorită clivajului uneia dintre catenele de către nucleazele bacteriene.
În a treia etapă, catena de ADN rămasă este transportată prin membrană în citoplasmă. Aceasta folosește energia eliberată în timpul degradării lanțului complementar.
În timpul replicării unui cromozom bacterian, catena de ADN care se transformă este atașată la o regiune de ADN omoloagă (parțial complementară) a celulei primitoare. În acest caz, din cauza lipsei de complementaritate completă, se formează un heteroduplex („heterozigot molecular”) - o secțiune de ADN dublu catenar în care nu toate perechile de nucleotide au baze azotate conectate prin legături de hidrogen. Restul ADN-ului se replic normal.
După sfârșitul replicării ADN-ului, celula primitoare se divide pentru a forma două celule: o celulă parțial transformată cu un cromozom care include o regiune ADN heteroduplex și o celulă netransformată. În timpul replicării ADN-ului într-o celulă parțial transformată, lanțurile complementare sunt completate pe ambele catene de ADN. O catenă reține secvențele de nucleotide originale, în timp ce cealaltă devine complet transformată. După divizarea unei celule parțial transformate, se formează o celulă netransformată și o celulă complet transformată, în care secvența de nucleotide inițială este înlocuită cu secvența de nucleotide a ADN-ului transformator.
Astfel, în timpul transformării, genele destinatarului sunt înlocuite cu secvențe de nucleotide omoloage. Cu cât gradul de omologie este mai mare, cu atât transformarea este mai reușită.
Frecvența transformării la procariote depinde de proprietățile ADN-ului care se transformă, de concentrația acestuia, de starea celulei primitoare și de tipul bacteriilor. Frecvența maximă a celulelor transformate nu depășește 1 la 100 de celule.
Transformarea este cunoscută și pentru eucariote. Cu toate acestea, nu există locuri de receptor pe suprafața celulelor eucariote, iar ADN-ul de transformare este introdus artificial în celule. De exemplu, ADN-ul este introdus în ouăle de animale prin microinjecție directă și în ouăle de plante prin microinjectare în tubul de polen. Metodele de biobalistică (biolistică) sunt utilizate pe scară largă, permițând introducerea oricăror fragmente de ADN în culturile de țesuturi vegetale.
Conjugare
La procariote, conjugarea este contactul direct a două celule de calitate diferită, însoțită de transferul cel puțin parțial de material genetic de la celula donatoare la celula primitoare. (Procesul de conjugare a fost descoperit în 1946 de J. Lederberg și E. Tatum).
La E. coli, celula donatoare („mascul”) are o formă alungită, celula primitoare („feminină”) este izodiametrică. Celula donatoare formează vilozități sexuale (pili), care o atrag către celula primitoare și formează canale citoplasmatice. Prin aceste canale, ADN-ul trece de la celula donatoare la celula primitoare. Există trei tipuri de celule donatoare: F + (ef-plus), Hfr (eh-ef-a) și F ′ (ef-prim).
Donorii F + conțin un factor sexual în citoplasmă - o plasmidă F specifică.
Plasmida F este un replicon autonom de aproximativ 100 kb lungime. Peste 20 de gene au fost studiate în plasmida F. Aproximativ jumătate dintre ei formează operonul tra gigant (aproximativ 30 kb lungime); produsele acestui operon controlează formarea contactului dintre donor și primitor și transferul propriu-zis de ADN. Genele rămase reglează funcționarea operonului tra.
Celula primitoare nu conține plasmida F și este desemnată ca o celulă F.
Când se formează o punte citoplasmatică, unul dintre lanțurile plasmidei F este tăiat într-un anumit punct (punctul O), iar replicarea ADN-ului începe pe lanțul complementar conform principiului „cercului de rulare”. O copie a lanțului complementar trece prin puntea citoplasmatică în citoplasma celulei primitoare și lanțul lipsă este completat pe ea. După ce replicarea este finalizată, ADN-ul plasmid dublu catenar se închide într-un inel, iar celula F – se transformă într-o celulă F +. Timpul total pentru transferul unei copii a plasmidei F în celula primitoare este de aproximativ 5 minute.
Cu toate acestea, la încrucișarea F + × F –, numai genele conținute în F–plasmidă; genele menajere localizate pe cromozomul bacterian nu sunt transferate celulei primitoare.
În același timp, plasmida F se poate integra în cromozomul bacterian, adică poate intra într-o stare integrată. Există aproximativ 20 de situsuri de integrare a plasmidei F în cromozomul bacterian. Apoi, atunci când o copie a unuia dintre lanțurile de plasmide F este transferată în celula primitoare, o copie a unuia dintre lanțurile cromozomiale bacteriene este purtată împreună cu aceasta. Celulele cu o plasmidă F integrată sunt numite donatori Hfr (din engleză „frecvența înaltă de recombinare”). În funcție de condiții, este posibil transferul complet sau parțial al unei copii a cromozomului bacterian Hfr donator în citoplasma receptorului. Ca rezultat, se formează o celulă cu un cromozom bacterian dublu catenar original și o moleculă de ADN monocatenară omoloagă completă sau incompletă. O astfel de celulă se numește merozigot („zigot parțial”). Apoi, în timpul replicării ADN-ului, are loc recombinarea. Acest proces nu este fundamental diferit de recombinarea în timpul transformării.
Transferul unei copii de ADN începe aproximativ de la mijlocul ADN-ului plasmidei F (din punctul O, în care una dintre catenele de ADN este tăiată și începe replicarea ADN-ului plasmidei F). Astfel, jumătate din ADN-ul plasmidei F intră în celula primitoare la începutul conjugării, iar a doua jumătate numai după transferul complet al unei copii a ADN-ului cromozomial. Este nevoie de mai mult de 100 de minute pentru a finaliza acest proces la t = 37 0 C. Cu toate acestea, în condiții naturale, conjugarea este întreruptă mult mai devreme doar o parte a copiei cromozomului donor și doar prima jumătate a ADN-ului F-plasmidului trece în celula primitoare; Astfel, celula primitoare nu acceptă proprietățile donatorului Hfr.
Cu toate acestea, există tulpini de bacterii în care o copie a cromozomului bacterian împreună cu o copie a ADN-ului plasmidei F este complet transferată. Astfel de celule sunt numite vHfr-donors (din engleză „frecvență de recombinare foarte mare”).
Probabilitatea transferului unei anumite gene în celula primitoare depinde de distanța acesteia față de ADN-ul plasmidei F sau, mai precis, de punctul O în care începe replicarea ADN-ului plasmidei F. Cu cât timpul de conjugare este mai lung, cu atât este mai mare probabilitatea de transfer al unei anumite gene. Acest lucru face posibilă crearea unei hărți genetice a bacteriilor în câteva minute de conjugare. De exemplu, în Escherichia coli, gena thr (un operon de trei gene care controlează biosinteza treoninei) este situată în punctul zero (adică direct lângă ADN-ul plasmidei F), gena lac este transferată după 8 minute, gena recE - după 30 de minute, gena argR - după 70 de minute etc.
Plasmida F poate trece de la o stare integrată la o stare autonomă prin auto-excizie din cromozomul bacterian. În acest caz, este posibilă captarea unor părți ale ADN-ului cromozomial (până la 50% din genele cromozomiale). Plasmida F, care include gene cromozomiale, se numește factor F′. Transferul de material genetic în timpul încrucișărilor F ′ × F se numește sexducție.
Pe lângă plasmida F, la procariote sunt cunoscuți și alte tipuri de factori sexuali (R, Ent, Hly, Col), asigurând transferul materialului genetic de la bacterie la bacterie. Pe baza plasmidelor naturale (inclusiv ADN-ul cloroplastelor și mitocondriilor), se obțin molecule de ADN semisintetice care asigură transferul materialului genetic de la o celulă la alta, numite vectori. Vectorii trebuie să asigure nu numai transferul stabil de gene, ci și reglarea transcripției lor.
Plasmidele procariote se pot replica doar în celulele procariote. În același timp, este nevoie de transferul genelor de la eucariote la procariote și invers. În acest scop, se folosesc plasmide navetă, care conțin doi replicatori (procariote și eucariote) și sunt capabile să se replica atât în procariote, cât și în celule eucariote, de exemplu, plasmide Ti- și Ri capabile de replicare în celule procariote și vegetale și vectori semi-sintetici creați pe baza lor. Pentru a proteja vectorii de distrugerea de către nucleaze, aceștia sunt închiși în vezicule fosfolipide - lipozomi.
Transducția
Transducția este transferul de material genetic folosind viruși de la o celulă donatoare la o celulă primitoare. (Fenomenul de transducție a fost descoperit în 1951 de N. Zinder (un student al lui J. Lederberg)).
În timpul transducției, ADN-ul din celula gazdă intră în virioni. Virionii infectează alte celule, iar ADN-ul celulei bacteriene originale intră în altă celulă bacteriană. ADN-ul viral se integrează în cromozomul bacterian, iar ADN-ul bacterian introdus se recombină cu ADN-ul cromozomului bacterian. Ca rezultat, 50% din celule sunt transformate.
Există transducții generale (nespecifice), limitate (specifice) și abortive.
Transducția generală
În timpul transducției generale, fragmentele de ADN bacterian donor sunt incluse aleatoriu în particula de fag care se maturizează împreună cu ADN-ul fagului sau în locul ADN-ului fag. Fragmentele de ADN bacteriene se formează atunci când sunt tăiate de o enzimă controlată de fagi. O particulă de fag poate include până la 100 de gene bacteriene.
Transducție limitată
Cu transducție limitată, are loc recombinarea - ADN-ul bacterian înlocuiește o parte din ADN-ul fagului. ADN-ul recombinant conține un număr mic de gene bacteriene adiacente ADN-ului fag integrat în cromozomul bacterian.
În general și transducție limitată, ADN-ul donor înlocuiește regiuni omoloage ale ADN-ului receptorului. Acest proces este similar cu transformarea.
Transducția abortivă poate fi atât nespecifică, cât și specifică. Esența sa constă în faptul că fragmentul de ADN transdus de fag nu este inclus în cromozomul receptor, ci există ca un replicon citoplasmatic. Mai devreme sau mai târziu acest replicon se pierde.
Fenomenul de transducție de către viruși este utilizat pe scară largă în transferul de gene la eucariote. Dacă se folosește un virus care nu poate forma o capsidă (adică există doar sub formă de ADN), atunci transducția nu este fundamental diferită de transformare sau de transferul conjugativ al materialului genetic folosind vectori plasmidii. Sistemele vectoriale au fost create pe baza virusurilor SV40 modificate (formează până la 100 de mii de copii într-o celulă), herpes, vaccinia și virusul mozaicului conopidă.
Trebuie subliniat încă o dată că toate tipurile de recombinare descrise sunt asociate nu cu adăugarea de noi secțiuni de ADN, ci cu înlocuirea secvențelor de nucleotide existente. Cu cât este mai mare gradul de omologie între ADN-ul transformator și original, cu atât este mai mare probabilitatea recombinării cu succes. Cel mai simplu mod de a realiza recombinare sunt enzimele care se găsesc în toate organismele. Este mai dificil să se introducă noi reglementatori care sunt foarte specifici în genom. Prin urmare, pentru a introduce noi gene în genom, sunt utilizate metode mai complexe asociate cu modificări biochimice ale ADN-ului.
Tema 7: Moștenirea citoplasmatică . Genetica celulelor și țesuturilor somatice.
1. Moștenirea citoplasmatică. Material genetic al organitelor semi-autonome. Moștenirea plastidiană. Moștenirea prin mitocondrii. Sterilitatea masculină citoplasmatică
2. Tipuri speciale de moștenire. Predeterminarea citoplasmei. Moștenirea prin infecție și endosimbioți
3. Genetica celulelor somatice. Mutații somatice. himere. Genetica cancerului.
RECOMBINAȚIILE GENETICE la eucariote apar în timpul reproducerii sexuale prin schimbul reciproc de fragmente cromozomiale, doi cromozomi recombinanți fiind formați din doi cromozomi parentali, adică. apar doi indivizi recombinanți.
Procariotele nu au reproducere sexuală Þ ca urmare a rearanjamentelor intragenomice: o modificare a localizării genelor în interiorul cromozomului sau când părți din ADN-ul donatorului pătrund în # receptor → formarea unui merozigot, de exemplu. se formează doar UN SINGUR RECOMBINAT.
GeneRs apar cu participarea enzimelor în gene individuale sau grupuri de legături genice. Există GENE REC speciale care determină capacitatea bacteriilor de a se recombina. Transfer de material genetic de la B! la B! apare prin transformare, transducție și conjugare, iar genele plasmide - prin transducție și conjugare.
TRANSFORMARE – transfer direct de material genetic (fragment de ADN) de la donator Rec#. (Pentru prima dată, Griffiths a experimentat cu o tulpină necapsulară avirulentă vie de pneumococ, care a devenit virulentă atunci când a fost tratată cu un extract de pneumococ capsular ucis.)
De obicei, o singură genă este transferată de la ADN-ul donor la celula primitoare, deoarece Fragmentul de ADN care poate pătrunde în Rec# este foarte mic. Doar o parte din celulele B pot fi transformate!! populaţiile – COMPETENTE. Starea de competență (când peretele lui B! este permeabil la fragmente de ADN cu polimer înalt (Mg = 0,5–1 milion)) apare de obicei la sfârșitul FAZEI LOG.
Etapele procesului de transformare:
1) adsorbția ADN-ului donor pe Rec#;
2) pătrunderea ADN-ului în Rec# și despiralizarea ADN-ului.
3) conectarea oricăreia dintre cele două catene de ADN donor cu o regiune omoloagă a cromozomului receptor și recombinarea ulterioară.
Eficiența depinde de GRADUL DE OMOLOGIE dintre ADN-ul donorului și al primitorului, care determină rezultatul final, adică numărul de recombinanți (transformanți) formați are loc mult mai puțin frecvent decât transformarea intraspecifică.
TRANSDUCERE– transfer de material genetic cu ajutorul fagilor. Există trei tipuri de transducție:
Nespecific (general).În momentul asamblarii particulelor de fagi, ORICE fragment de ADN de la donator poate pătrunde în capul acestora. Orice gene donatoare sunt transferate împreună cu ADN-ul fagului și sunt incluse în regiunea omoloagă a ADN-ului Rec# prin recombinare. Fagii transferă doar material genetic
Specific– fagul transferă ANUMITE gene atunci când profagul este scindat din B! cromozomi împreună cu genele din apropiere, iar fagul devine defect. Când fagul interacționează cu Rec#, gena donor și fagul defect sunt inserate în cromozomul RecB! și B!! devin imun la infecția ulterioară cu un fag virulent.
Avortiv– fragmentul de ADN al bacteriei donatoare nu este inclus în cromozomul RecB, dar este localizat în citoplasmă și funcționează în această formă! În timpul divizării, această bucată de ADN este transmisă doar unei singure fiice # și se pierde în cele din urmă în urmași.
CONJUGARE– transferul de material genetic de la o celulă donatoare la o celulă primitoare în timpul ÎNcrucișării acestora. Donatori – ## cu plasmidă F (factor de sex). La încrucișarea F+ cu F–#, factorul sexual este transmis indiferent de cromozomul donor și aproape toate Rec# devin F+.
Plasmida F se poate integra în B! cromozom. În unele cazuri, este eliberat, în timp ce captează B-urile legate de el! gene (desemnate de gena inclusă: F-lac).
1) atașarea unei celule donatoare la Rec# folosind SEX-PILES
2) formarea unei PUNTE de conjugare, prin care sunt transmise factorul F și alte plasmide situate în citoplasma donatorului.
3) ruperea unuia dintre lanțurile ADN (la locul de includere a plasmidei F) cu participarea endonucleazei. Un capăt al ADN-ului pătrunde în Rec# și este imediat completat la o structură cu 2 catene. În timpul transferului, o parte din ADN-ul donor este capturată - tulpini Hfr (FRECVENȚĂ ÎNALTĂ DE RECOMBINAȚIE). La încrucișarea unei tulpini Hfr cu un F–#, factorul F nu este transmis (deoarece puntea de conjugare este ruptă, iar factorul F este situat în partea distală a cromozomului). Doar genele B sunt transmise mai departe! cromozomi situati aproape de inceputul transferului (punctul O (origine)).
4) Pe catena de ADN RĂMÂNĂ #, sunt sintetizate 2 lanțuri.
22. Sporii și sporularea în microorganisme, proprietățile sporilor, metode de depistare a sporilor.
Sporularea are loc în condiții nefavorabile formelor vegetative. Bacteriile au 3 tipuri de spori:
– ENDOSPORI (spori adevărați) – localizați în interior#, au un indice de refracție ridicat.
– ARTOSPORES – aranjarea ca răspuns la fragmentarea B vegetativ!!
– CHLAMYDIOSPORES (microchisturi) – se formează ca urmare a îngroșării pereților # vegetative și a acumulării de nutrienți de rezervă.
Doar un grup mic de eubacterii este capabil de sporulare, iar dintre cele patogene pentru pui, doar Clostridium și Bacillus. Fiecare # vegetativ formează 1 endospor. Sporii sunt REZISTENTI la temperatura, uscare, radiatii si substante chimice (inclusiv etanol de 70°). Ele pot persista foarte mult timp. Se presupune că sporii pot fi păstrați în sol uscat timp de până la 1000 de ani, dar, de fapt, după 50 de ani, 90% dintre spori își pierd viabilitatea.
Din punct de vedere morfologic, sporii pot fi rotunde, ovale, eliptice, unele echipate cu „nervi de rigidizare”.
PROCESUL DE SPORULARE începe imediat când apare o deficiență ingrediente nutritiveși durează aproximativ 8 ore și nu sunt necesare surse externe de energie sau energie. Stimulează - glucoză, P și NH 4, inhibă - peptonă, lactoză, NaCl, CaCl 2. Următorii PASI sunt evidențiați:
1) Etapa pregătitoare - se oprește diviziunea, începe acumularea de incluziuni lipidice.
2) Etapa de prespor - apare o membrană eliptică, înconjurând o secțiune de citoplasmă cu densitate alterată și proprietăți tinctoriale.
3) Formarea cochiliei
4) Etapa de maturare a sporilor - se compactează și orice mișcare în #-sporangium încetează.
5) Distrugerea părintelui #.
6) B conditii optime are loc germinarea sporilor. În primul rând, absoarbe în mod activ apa și se umflă, crește respirația, crește activitatea enzimatică, se eliberează AA - se activează metabolismul (în această perioadă sporul PIERDE REZISTENTA TERMICĂ). Sporul izbucnește apoi și apare o formă vegetativă.
Încărcare...