Téma: Genetika mikroorganizmov 1. Konjugácia, transdukcia, transformácia. 2. Variabilita mikroorganizmov. 3. Využitie úspechov v bakteriálnej genetike.
Dedičný aparát baktérií má množstvo znakov: baktérie sú haploidné organizmy, to znamená, že majú 1 chromozóm. V tomto ohľade pri dedení vlastností nedochádza k fenoménu dominancie; Baktérie majú vysokú mieru rozmnožovania, v súvislosti s ktorou sa v krátkom čase (deň) vystrieda niekoľko desiatok generácií baktérií. To umožňuje študovať obrovské populácie a ľahko identifikovať aj zriedkavé mutácie. Dedičný aparát baktérií predstavuje chromozóm. Baktérie majú len jednu. Bakteriálny chromozóm je molekula DNA. Dĺžka tejto molekuly dosahuje 1,0 mm a aby sa „vošla“ do bakteriálnej bunky, nie je lineárna ako u eukaryotov, ale je zvinutá do slučiek a poskladaná do prstenca. Tento kruh je v jednom bode pripojený k cytoplazmatickej membráne. Jednotlivé gény sa nachádzajú na bakteriálnom chromozóme. o coli Napríklad je ich vyše 2000.
2. funkčné jednotky genóm baktérií, okrem chromozomálnych génov, sú: IS-sekvencia; transpozóny; plazmidy. IS-sekvencie (anglicky insertion - insertion, sequence - sequence) - krátke fragmenty DNA. Nenesú štrukturálne (kódujúce konkrétny proteín) gény, ale obsahujú iba gény zodpovedné za transpozíciu (schopnosť sekvencií IS pohybovať sa po chromozóme a integrovať sa do jeho rôznych oblastí). IS sekvencie sú rovnaké pre odlišné typy baktérie. Transpozóny sú molekuly DNA väčšie ako sekvencie IS. Okrem génov zodpovedných za transpozíciu obsahujú aj štrukturálny gén kódujúci ten či onen znak. Transpozóny (Tn-elementy) pozostávajú z 2000-25000 párov báz, obsahujú fragment DNA nesúci špecifické gény a dva koncové IS prvky. Každý transpozón zvyčajne obsahuje gény, ktoré prepožičiavajú baktérii vlastnosti dôležité, ako je mnohonásobná rezistencia voči antibakteriálnym látkam. Vo všeobecnosti sú transpozóny charakterizované rovnakými génmi ako plazmidy (gény pre rezistenciu na antibiotiká, produkciu toxínov, ďalšie metabolické enzýmy). Transpozóny sa ľahko pohybujú pozdĺž chromozómu. Ich poloha ovplyvňuje expresiu ich vlastných štruktúrnych génov a susedných chromozomálnych génov. Transpozóny môžu existovať aj mimo chromozómu,
Plazmidy sú kruhové superzvinuté molekuly DNA. Ich molekulová hmotnosť sa značne líši a môže byť stokrát väčšia ako u transpozónov. Plazmidy obsahujú štrukturálne gény, ktoré dodávajú bakteriálnej bunke rôzne, pre ňu veľmi dôležité vlastnosti: R-plazmidy - lieková rezistencia; Col-plazmidy - schopnosť syntetizovať kolicíny; F-plazmidy - na prenos genetickej informácie; Tox-plazmidy - na syntézu toxínu; Biodegradačné plazmidy - ničia jeden alebo druhý substrát atď. Plazmidy môžu byť integrované do chromozómu (na rozdiel od IS sekvencií a transpozónov sú zabudované do presne definovaných oblastí), alebo môžu existovať autonómne. V tomto prípade majú schopnosť autonómnej replikácie, a preto môže byť v bunke 2, 4, 8 kópií takéhoto plazmidu. Mnohé plazmidy obsahujú gény prenosnosti a sú schopné prenosu z jednej bunky do druhej počas konjugácie (výmena genetickej informácie). Takéto plazmidy sa nazývajú prenosné.
U baktérií existujú 2 typy variability – fenotypová a genotypová. Fenotypová variabilita – modifikácia – neovplyvňuje genotyp, ale postihuje väčšinu jedincov v populácii. Modifikácie sa nededia a časom vyblednú, t.j. vrátia sa k pôvodnému fenotypu po väčšom (dlhodobé modifikácie) alebo menšom (krátkodobé modifikácie) počte generácií. h Genotypová variabilita ovplyvňuje genotyp. Je založená na mutáciách a rekombináciách. Mutácie v baktériách sa zásadne nelíšia od mutácií v eukaryotických bunkách. Charakteristickým znakom mutácií v baktériách je relatívna jednoduchosť ich detekcie, pretože je možné pracovať s veľkými populáciami baktérií. Podľa pôvodu môžu byť mutácie: spontánne; vyvolané. Podľa dĺžky: bodkované; genetické; chromozomálne. Podľa smeru: rovno; - spätný chod.
Rekombinácia (výmena genetického materiálu) v baktériách sa líši od rekombinácie v eukaryotoch: baktérie majú niekoľko rekombinačných mechanizmov; pri rekombináciách v baktériách nevzniká zygota ako u eukaryot, ale merozygota (nesie kompletnú genetickú informáciu príjemcu a časť genetickej informácie darcu vo forme doplnku); v bakteriálnej rekombinantnej bunke sa mení nielen kvalita, ale aj kvantita genetickej informácie.
Konjugácia U baktérií spôsob prenosu genetického materiálu z jednej bakteriálnej bunky do druhej. V tomto prípade sú dve baktérie spojené tenkým mostíkom, cez ktorý prechádza segment vlákna deoxyribo z jednej bunky (darcu) do druhej (príjemca). nukleová kyselina(DNA). Dedičné vlastnosti príjemcu sa menia v súlade s množstvom genetickej informácie obsiahnutej v prenesenom kúsku DNA.
Konjugácia Konjugácia (z lat. conjugatio - spojenie), parasexuálny proces - jednosmerný prenos časti genetického materiálu (plazmidy, bakteriálny chromozóm) s priamym kontaktom dvoch bakteriálnych buniek. Otvorili ju v roku 1946 J. Lederberg a E. Taitem. Má veľký význam v prírode, pretože podporuje výmenu užitočných vlastností pri absencii skutočného sexuálneho procesu. Zo všetkých procesov horizontálneho prenosu génov umožňuje konjugácia prenos najväčší počet genetická informácia.
Konjugácia je výmena genetickej informácie v baktériách jej prenosom z darcu na príjemcu počas ich priameho kontaktu. Po vytvorení konjugačného mostíka medzi darcom a príjemcom sa cez neho dostane jeden reťazec DNA darcu do bunky príjemcu. Čím dlhší je kontakt, tým viac darcovskej DNA sa môže preniesť na príjemcu. Na základe prerušenia konjugácie v určitých intervaloch je možné určiť poradie génov na chromozóme baktérií – zostaviť chromozómové mapy baktérií (zmapovať baktérie). F+-bunky majú funkciu darcu.
Transdukcia Esther Lederberg uspela pri izolácii bakteriofága lambda, DNA vírusu, z Escherichia coli K 12 v roku 1950. Skutočný objav transdukcie je spojený s menom Joshua Lederberg. V roku 1952 spolu s Nortonom Zinderom objavili úplnú transdukciu. V roku 1953 Lederberg et al preukázali existenciu abortívnej transdukcie a v roku 1956 špecifickej transdukcie.
Transdukcia je výmena genetickej informácie v baktériách jej prenosom od darcu k príjemcovi pomocou stredne silných (transdukujúcich) bakteriofágov. Transdukujúce fágy môžu niesť 1 alebo viac génov (znakov). Transdukcia sa deje: špecifická - prenáša sa vždy ten istý gén; nešpecifické - prenášajú sa rôzne gény. Je to spôsobené lokalizáciou transdukujúcich fágov v darcovskom genóme: v prípade špecifickej transdukcie sa vždy nachádzajú na rovnakom mieste na chromozóme; pri nešpecifických je ich lokalizácia premenlivá.
Ryža. 2. Transdukcia 1 - baktéria - darca (B+), 2 - fág, 3 - reprodukcia, 4 - adsorpcia, 5 - baktéria - príjemca (B-), 6 - baktéria - príjemca s novou vlastnosťou.
Transformácia je výmena genetickej informácie v baktériách zavedením hotového preparátu DNA (špeciálne pripraveného alebo priamo izolovaného z bunky darcu) do bakteriálnej bunky príjemcu. Najčastejšie k prenosu genetickej informácie dochádza, keď je príjemca kultivovaný na živnom médiu obsahujúcom DNA darcu. Pre vnímanie darcovskej DNA počas transformácie musí byť bunka príjemcu v určitom fyziologickom stave (kompetencii), ktorý sa dosahuje špeciálnymi metódami spracovania bakteriálnej populácie alebo sa vyskytuje spontánne. Pri transformácii sa prenášajú jednotlivé (zvyčajne 1) znaky. Transformácia je najobjektívnejším dôkazom asociácie DNA alebo jej fragmentov s jedným alebo iným fenotypovým znakom, pretože do bunky príjemcu sa zavádza čistý preparát DNA.
Ryža. 3. Transformácia kapsulárneho kmeňa baktérií (1) počas výsevu dáva rast (6). Po uvarení tejto kultúry nedochádza k rastu (7). Výsledok takéhoto experimentu s kmeňom bez kapsúl (4 -rast +, 8 -rast -) je podobný. Kombinácia extraktu z manioku (1) a živej kultúry nekapsulárnych kmeňov (3) v jednej nádobe s následným nasadením umožňuje rast kapsulárneho kmeňa (5).
Vlastnosti buniek kolónií S- a R-formy S-forma R-forma Kolónie sú drsné, nepriehľadné s nerovnými okrajmi, často zvrásnené Bičíky často chýbajú Kapsuly alebo slizničná vrstva chýba Biochemicky menej aktívne Slabo virulentné alebo avirulentné Antigénne defektné Zle citlivé na fág Suspenzia rýchlo sadá, drobivý sediment, polymorfné bunky Kolónie priehľadné, s hladkým lesklým povrchom, okrúhle, s hladkými okrajmi, vypuklé Pohyblivé druhy majú bičíky Kapsulárne druhy majú jasne viditeľné puzdro alebo sliznicu Biochemicky aktívnejšie Virulentné vlastnosti sa prejavujú u patogénnych druhov Antigénne kompletné Suspenzné bunky citlivé na fágy vo fyziologickom roztoku homogénne, stabilné, bunky normálnej veľkosti
Transformácia - zmena dedičných vlastností bunky v dôsledku preniknutia alebo umelého zavedenia cudzej DNA do nej. Povahu transformačného faktora stanovili Avery a McLeod v roku 1944. Transformovať je možné len tie baktérie, do ktorých buniek môže preniknúť vysokomolekulárna, dvojvláknová (intaktná) DNA. Schopnosť absorbovať DNA je kompetencia a závisí od fyziologického stavu bunky. DNA môže byť prijatá počas určitej krátkej fázy zmeny bunkového povrchu. Pomocou DNA sa môžu prenášať také vlastnosti ako: tvorba kapsuly, syntéza in-in, enzymatická aktivita, odolnosť voči jedom, antibiotikám.. Akákoľvek DNA môže preniknúť do kompetentnej bunky, ale iba DNA príbuzného druhu sa môže rekombinovať . Konjugácia - prenos genetického materiálu priamym kontaktom medzi 2 bunkami. Skúmali Lederberg a Tatum v roku 1946 na mutantoch E. coli. Jeden mutant potreboval aminokyseliny A a B, ale bol schopný syntetizovať Cu D, druhý bol na to kompetentný (A-B-C+D+). Tieto mutanty nerástli a netvorili kolónie na minimálnom živnom médiu, ale ak sa k nemu pridala suspenzia oboch mutantov, kolónie sa objavili. Bunky týchto kolónií mali dedičnú schopnosť syntetizovať všetky aminokyseliny (A + B + C + D +), tu slúži konjugácia ako predpoklad rekombinácie. Pri štúdiu baktérií sa zistilo, že schopnosť bunky byť darcom je spojená s prítomnosťou F faktora (F+ bunky, ktoré neobsahujú faktor – F- a môžu fungovať ako príjemca) – a plazmid, kruhová molekula dvojvláknovej DNA. To. recipientné bunky sa stávajú darcami v dôsledku konjugácie a chromozomálne znaky sa neprenášajú. F-plazmid spôsobuje na bunke tvorbu genitálnych fimbrií/F-pili, ktoré slúžia na rozpoznanie pri kontakte medzi bunkou darcu a bunkou príjemcu a umožňujú vytvorenie mostíka, cez ktorý DNA prechádza do bunky. Konjugácia je bežná u enterobaktérií, prokaryotov. Transdukcia - pasívny prenos bakteriálnych génov z jednej bunky do druhej časticami bakteriofága, čo vedie k zmene dedičných vlastností bunky. Existujú 2 typy transdukcie: a) nešpecifická - pri ktorej je možné preniesť akýkoľvek fragment DNA hostiteľa (namiesto nej je DNA hostiteľskej bunky obsiahnutá vo fágovej častici / do vlastného génu /); b) Špecifický - možno preniesť presne definovaný fragment DNA, niektoré fágové gény sú nahradené hostiteľskými génmi). V oboch prípadoch sú fágy defektné; strácajú schopnosť lýzovať bunku.
38. Faktory odporu (r-faktory). vlastnosti plazmidov. transpozóny.
1. odpor- odolné org-mov voči akýmkoľvek antigénom. Boli objavené baktérie odolné voči niektorým antibiotikám. V 50. rokoch v Japonsku (pôvodcovia disinterie. Všimnite si mnohopočetnosť bact. disinteria a to môže viesť k ďalším baktériám. R-faktory obsahujú gény, vďaka ktorým je bunka odolná voči niektorým antibiotikám. Niektoré R-faktory spôsobujú rezistenciu okamžite na 8 antibiotík , a ďalšie R-ph nám dávajú schopnosť ťažkých kovov (ortuť, nikel, kadmium) R-plazmid nesie 2 skupiny génov: 1) gén zodpovedný za prenos plazmidu konjugáciou (tra ) a sú arr. -nazývané "faktory prenosu odporu (RTF), 2) gény, ktoré. určujú samotnú rezistenciu a tie komp. Pozostáva len z malej časti plazmidu.
RTF zahŕňa všetky gény zodpovedné za prenos faktora R z bunky do bunky, ktorý sa uskutočňuje konjugáciou. To znamená, že faktor R, ako aj faktor F sú infekčné. Prenos R-faktora medzi niekoľkými rôznymi rodmi baktérií je možný, čo prispieva k ich ďalšej distribúcii. Enzymatická chemická modifikácia antibiotík je hlavnou príčinou požitia v dôsledku plazmidov. Napríklad kanamycín a neomycín boli podrobené fosforelácii, zatiaľ čo pinpicín bol inaktivovaný penicilinázou. poz. Ak je k dispozícii R-faktory, je možná genetická rekombinácia, potom môže vzniknúť nová kombinácia génov, ktorá poskytne ďalšie vlastnosti. R-faktory majú veľký význam pre chemoterapiu.
2. Bakteriocíny. Mnoho bakt.syntéznych.proteínov, Yukotor. Zabíjanie príbuzných druhov alebo kmeňov alebo inhibícia ich rastu. Tieto proteíny sa nazývajú bakteriocíny. Sú to kodér. Špeciálne.plazmidy, ktoré.sú.nazývané.bakteriocinogénne faktory. Bakteriocíny boli izolované z Esrichia coli (kolicíny) a iných baktérií. Názov bakteriocínov je daný podľa produkčnej formy baktérií, napríklad stafylokokov produkovaných stafylocínom. anorganické, zabíjajúce.baktérie.zvané.antiseptiká.
3. Iné rozpoznávanie, definované plazmidmi. Plazmidy môžu obsahovať gény, ktoré spôsobujú množstvo špecifických biol. V plazmidoch možno nájsť enzýmové gény potrebné na rozklad kampyfory, kyseliny salicylovej a iných základných substrátov. Zoznam sv-in, zdedených s plazmidmi, znamená a zahŕňa: fixáciu dusíka, arr-e nodulov, absorpciu cukrov, syntézu hydrogenázy atď. Niektoré z týchto sv-in môžu byť definované génmi baktérií. Chromozómy (výmena génov m-du chromozóm a plazmid). Plazmidy zohrali dôležitú úlohu vo vývoji prokaryotov.
4. Nekompatibilita. Mnoho bakt.obsahov.plazmidov rôznych veľkostí. Prítomnosť rôznych plazmidov v jednej bunke naznačuje, že takéto plazmidy sú navzájom kompatibilné. Ale 2 príbuzné plazmidy nemôžu koexistovať v tej istej bunke, sú nekompatibilné. Všetky plazmidy iné zo skupiny nekompatibilít: plazmidy vo vzťahu k rovnakej skupine nekompatibilít.
transpozóny - toto je posledná z DNA, ktorá sa môže integrovať do mnohých častí genómu a môže sa „preniesť“ z plazmidu do chromozómu bact, do iného plazmidu. Transpasóny obsahujú gény, ktoré definujú vonkajšie znaky, a to, že sú odolné voči takým antibiotikám, ako je pinic, tetracyklín atď. v bakt.chromozómoch a plazmidoch.). Na oboch stranách génov je miesto, ktoré sa nachádza vo vnútri transpozónu, umiestnené 2 v rovnakej sekvencii, ktorá môže ísť rovnakým alebo opačným smerom. Tieto repetície báz DNA sú čiastočne totožné s IS - El-tami.
41. Vývoj m/s.
Bunky všetkých živých vecí, od primitívnych foriem až po vysoko organizované, pozostávajú z rovnakých štruktúrnych prvkov a využívajú rovnaké mechanizmy na získavanie energie a rast. Toto je biochemická jednota všetkých živých organizmov. V procese evolúcie dochádzalo k formovaniu a formovaniu rôznych foriem živých vecí. Pre proces evolúcie života je potrebné predstaviť si, aké podmienky boli na Zemi, v ktorých sa spontánna tvorba života ukázala ako možná. V poslednom období po vzniku Zeme na nej prebiehali aktívne biologické procesy, ktoré menili jej vzhľad a viedli k vzniku zemskej kôry, hydrosféry a atmosféry. Keď sa organická hmota nahromadila na Zemi vo veľkých množstvách => nastali podmienky, za ktorých mohol nastať prechod od chemickej evolúcie ku vzniku prvých samostatne sa rozmnožujúcich živých bytostí. Pre bunku života je charakteristické, že sa vždy objavuje v podobe určitých štruktúr, ktoré sú priestorovo izolované od vonkajšieho prostredia, no neustále s ním interagujú vo forme otvorených systémov. Predpokladal, že ďalšou etapou evolúcie na ceste k vzniku života bolo vytvorenie určitej štruktúrnej organizácie – abiogénne syntetizovaných organických zlúčenín. Mali guľovitý tvar, priemer 0,5-7 mikrónov, podobali sa kokoidným formám baktérií, obsahovali proteinoidy a mali určitú stabilitu. Pri farbení po gramoch sa zistilo, že mikrosféry sa vytvorili z kyslých proteinoidov - gr- a hlavných proteinoidov - gr +. Toto štádium je prechodným štádiom od chemickej k biologickej evolúcii a výsledný vzorec možno definovať ako prebiologický prirodzený výber. V budúcnosti navrhol, že prvé prokaryoty, mačka, by sa mohli objaviť vo vodných útvaroch, kde bolo na ostrovoch veľa organických látok, boli to organizmy, ktoré existujú v dôsledku fermentácie a mali hlavné funkcie anaeróbneho metabolizmu. Ak predpokladáme, že sírany boli prítomné aj vo vodných útvaroch, tak ďalšou etapou evolúcie je efektívny transport elektrónov s vytvorením protónového potenciálu ako zdroja energie na regeneráciu ATP. Okrem toho sa experimentálne ukázalo, že v počiatočnom štádiu evolúcie sa prokaryoty mohli reprodukovať a prenášať informácie svojim potomkom bez účasti nukleových kyselín. Pre ďalší vývoj prokaryotov bolo potrebné vytvoriť špeciálny aparát, ktorý by zabezpečil presnú reprodukciu polypeptidov. To viedlo k vytvoreniu nového mechanizmu syntézy – templátovej syntézy, ktorá je založená na využití vlastností polynukleotidov. Vlastnosťou polynukleových molekúl je schopnosť presne sa reprodukovať na princípe štrukturálnej komplementarity.
Hlavná udalosť vo vývoji: prechod z primárnej redukčnej atmosféry na atmosféru obsahujúcu kyslík. Baktérie majú nový typ metabolizmu - aeróbne dýchanie, ktoré sa stalo možným v dôsledku transformácie cytochrómov na terminálne oxidázy pomocou molekúl O 2 ako akceptora elektrónov. Predpokladá sa, že pred 2 miliardami rokov už existovali všetky fototrofné prokaryoty, mačka je známa dodnes. Prokaryoty spočiatku zaberali veľa rôznych ekologických výklenkov, ale potom postupne ustúpili eukaryotom. Vývoj rôznych odlišné typy metabolizmus v prokaryotoch bol spôsobený jednoduchou štruktúrnou bunkou, vysoko rozvinutým regulačným systémom, rýchlym rastom a prítomnosťou niekoľkých mechanizmov prenosu génov.
42.MIKROORGOVÝ PATOGÉN A IMUNITA.
Imunita nás chráni pred infekčnými agens: baktériami, vírusmi a prvokmi, to znamená, že chráni telo pred všetkým cudzím.
Infekcia je ťažká biologický proces vyplývajúce z prenikania patogénnych mikróbov do tela a narušenia stálosti jeho vnútorného prostredia.
Patogenita je schopnosť mikróbov určitého druhu spôsobiť za vhodných podmienok infekčné ochorenie, ktoré je preň typické. Preto je patogenita druhovou vlastnosťou.
V prírodnom prostredí sa vyskytujú biologické škodliviny, ktoré spôsobujú u ľudí rôzne ochorenia. Ide o patogény, vírusy, helminty, prvoky. Môžu byť v atmosfére, vode, pôde, v tele iných živých organizmov, vrátane samotnej osoby.
Najnebezpečnejšie patogény infekčných chorôb. Majú rôznu stabilitu v prostredí. Niektorí sú schopní žiť mimo ľudského tela len niekoľko hodín; sú vo vzduchu, vo vode, na rôznych predmetoch, rýchlo umierajú. Iní môžu žiť v prostredí od niekoľkých dní do niekoľkých rokov. Pre iných je životné prostredie prirodzeným biotopom. Po štvrté - iné organizmy, ako napríklad voľne žijúce zvieratá, sú miestom ochrany a rozmnožovania.
Zdrojom infekcie je často pôda, ktorá je neustále obývaná patogénmi tetanu, botulizmu, plynatej gangrény a niektorých hubových chorôb. Do ľudského tela sa môžu dostať pri poškodení pokožky, s neumytými potravinami alebo pri porušení hygienických pravidiel.
|
Typické antibiotiká |
Výrobcovia |
Koho to ovplyvňuje |
Mechanizmus akcie |
Ťažkosti pri terapeutickej aplikácii |
|
Penicilíny, cefalosporíny |
Rody húb Reniklium, Cephalosporum |
Gram-pozitívne a gram-negatívne baktérie |
Porušenie syntézy bunkovej steny |
alergické reakcie |
|
Streptomycín, gentamicín, kanamycín, tobramycín, amikacín |
Aktinomycéty rodu Streptomyces, pôrodné baktérie Micromonospora. Bacil lus |
Ireverzibilná inhibícia syntézy bielkovín |
Toxický účinok na sluchový nerv a obličky |
|
|
Antibiotiká s rovnakým názvom |
Aktinomycéty rodu Streptomyces |
Gram-pozitívne a gram-negatívne baktérie, rickettsia, chlamýdie, prvoky |
Reverzibilná inhibícia syntézy proteínov |
Šírenie rezistentných kmeňov |
|
Antibakteriálne: erytromycín Antifungálne a antiprotozoálne: polyény |
Aktinomycéty rodu Streptomyces Tiež |
Grampozitívne baktérie Huby, niektoré prvoky |
Porušenie plazmatickej membrány |
Toxicita |
|
Polymyxíny, gramicidíny, bacitracíny |
Rôzne mikroorganizmy |
Väčšinou gramnegatívne baktérie |
Mechanizmus účinku je odlišný |
Vysoká toxicita |
Genetické rekombinácie- prerozdelenie genetického materiálu rodičov v potomstve, ktoré podmieňuje kombinačnú variabilitu organizmov. Vyskytujú sa za účasti enzýmov v rámci jednotlivých génov.
Konjugácia - prenos genetického materiálu z bunky darcu do bunky príjemcu prostredníctvom úzkeho kontaktu. Darcami genetického materiálu sú bunky nesúce F-plazmid. Príjemcami sú bakteriálne bunky, ktorým chýba F-plazmid.
Prvým stupňom konjugácie je pripojenie darcovskej bunky k príjemcovi pomocou genitálnych klkov. Medzi bunkami sa vytvorí konjugačný mostík, cez ktorý sa F-plazmid prenesie z bunky darcu do bunky príjemcu.
Ak je F-plazmid vložený do chromozómu baktérie, jeden reťazec DNA sa zlomí za účasti endonukleázy. Proximálny koniec DNA preniká do recipientnej bunky cez konjugačný mostík a je okamžite dokončený do dvojvláknovej štruktúry. Vlákno zostávajúce v darcovskej bunke je matricou na syntézu druhého vlákna.
Transformácia- priamy prenos genetického materiálu darcu do bunky príjemcu. Transformácia efektívne prebieha iba medzi baktériami rovnakého druhu s rôznymi genotypmi.
Bunky, ktoré môžu prijať darcovskú DNA, sa nazývajú kompetentné. Stav kompetencie nastáva počas rastu buniek a zhoduje sa s koncom logaritmickej fázy.
Fragmenty dvojvláknovej DNA s molekulovou hmotnosťou aspoň 0,5-1x106 majú transformačnú aktivitu
Transformačný proces pozostáva z fáz:
1) adsorpcia darcovskej DNA na bunku príjemcu,
2) prienik DNA do bunky príjemcu s následnou despiralizáciou,
3) spojenie jedného vlákna DNA s homológnou oblasťou chromozómu príjemcu.
Transdukcia - prenos genetického materiálu z jednej baktérie na druhú pomocou fágov. Rozlíšiť:
1) nešpecifická transdukcia– keď sa akýkoľvek darcovský gén prenesie do bunky príjemcu spolu s fágovou DNA. Fragment DNA donorovej baktérie prenesený fágom môže byť inkorporovaný do oblasti homológnej DNA recipientnej bunky rekombináciou. Transdukujúci fág je iba nosičom genetického materiálu z jednej baktérie do druhej a samotná fágová DNA sa nezúčastňuje na tvorbe rekombinantov,
2) špecifická transdukcia. fág prenáša špecifické gény z baktérie darcu do baktérie príjemcu. Keď transdukčné fágy interagujú s bunkami recipientného kmeňa, gén donorovej baktérie sa spolu s DNA defektného fága začlení do chromozómu recipientnej baktérie.
3) neúspešný- keď fragment DNA darcovskej baktérie prinesený fágom nie je zahrnutý v chromozóme baktérie príjemcu, ale nachádza sa v jej cytoplazme a môže fungovať v tejto forme. Pri delení rekombinantnej bakteriálnej bunky sa prinesený darcovský fragment DNA prenesie len do jednej z dcérskych buniek a časom zmizne.
Téma 6: Doktrína infekcie. Chemoterapeutické lieky. Antibiotiká.
Otázky pre samoukov:
1. Infekcia. Podmienky výskytu a spôsoby prenosu patogénu.
2. Formy infekcie a ich charakteristika.
3. Obdobia infekčnej choroby.
4. Charakterizácia bakteriálnych toxínov.
5. Antibiotiká: rozdelenie, použitie, komplikácie pri užívaní antibiotík.
6. Metódy stanovenia citlivosti mikroorganizmov na antibiotiká.
7. Najdôležitejšie skupiny chemoterapeutík a mechanizmy ich účinku.
Teoretický materiál pre samotréning :
Dátum pridania: 2015-09-03 | Zobrazenia: 888 | porušenie autorských práv
| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 21 | | | | | | | | | | | |
infekcia trávenia mikróbmi
Rekombinácia je proces výmeny genetického materiálu rozbíjaním a spájaním rôznych molekúl. K rekombinácii dochádza na opravu dvojvláknových zlomov v DNA a na pokračovanie replikácie, keď sa replikačná vidlica zastaví v eukaryotoch, baktériách a archaeách. Vírusy sa môžu rekombinovať medzi molekulami RNA svojich genómov.
K rekombinácii v eukaryotoch zvyčajne dochádza počas prechodu počas meiózy, najmä počas tvorby spermií a vajíčok u zvierat. Rekombinácia spolu s replikáciou DNA, transkripciou RNA a transláciou proteínov patrí k základnej, včasnej homológnej rekombinácii
Homológna rekombinácia
Klasifikácia typov homologickej rekombinácie: alelická, ektopická a homeologická; recipročné (prekríženie) a nerecipročné (génová konverzia).
recipročná rekombinácia. Skoré predstavy o povahe kríženia: hypotézy „rozbiť a spojiť“ a „selektívne kopírovať“. Meselsonove experimenty na dôkaze mechanizmu „prerušenia a spojenia“. Vývoj metodologických prístupov k štúdiu molekulárnych mechanizmov rekombinácie. Dva stupne tvorby rekombinantnej DNA: „spojené“ a primárne rekombinantné molekuly.
Genetická kontrola homológnej rekombinácie v bakteriofágoch. Červený systém v bakteriofágu l. Exonukleáza l. Orf systém. Bakteriofág T4: úloha génov 30, 32, 43, 46, 47, 49 a uvsX. Enzymológia rekombinačných reakcií: endo- a exonukleázy, DNA polymeráza, DNA ligáza, UvsX proteín, SSB proteín a iné proteíny. Procesy „presunu vlákna“, tvorba D-slučky, „migrácia vetvy“, korekcia heteroduplexu. Hlavnými štádiami prechodu sú presynapsia, synapsia a postsynapsia. Kríženie vzorov v bakteriofágoch. Všeobecnosť procesov rekombinácie a opravy DNA.
Základné modely homológnej rekombinácie. Prázdninový model. Pozadie modelu, podstata, hodnota. Vývoj modelu v ďalších štúdiách, jeho stav techniky. Meselsonov-Readingov model. Model opravy dvojvláknového zlomu DNA (DNR) v kvasinkách (Zhostak et al.) aplikovaný na kríženie a konverziu.
Rekombinácia počas transformácie chromozomálnej DNA v baktériách. parametre rekombinácie. Veľkosti integrovateľných fragmentov donorovej DNA. Kinetika a účinnosť transformácie. Dôkaz pre integráciu jednovláknových fragmentov donorovej DNA. Genetická kontrola a hlavné štádiá transformačného procesu u Bacillus subtilis a Streptococcus pneumoniae. Komplex darca-príjemca. Genetická kontrola a mechanizmus rekombinácie počas transformácie u Haemophilus influenzae. Transformozóm.
Rekombinácia počas konjugácie v Escherichia coli. Charakterizácia prenosu konjugácie DNA. Mechanizmy integrácie darcovskej DNA do chromozómu recipientnej bunky.
Genetická kontrola homológnej rekombinácie v E. coli. Gény zapojené do presynapsie: recA, recB, recC, recD, recE, recJ atď. Pleiotropný efekt mutácií recB a recC. ATP-dependentná RecBCD nukleáza, jej aktivity, mechanizmy účinku a úlohy v rôznych genetických procesoch. Chi stránka ako rekombinačný hotspot. Univerzálnosť ATP-dependentných nukleáz pre baktérie. Gény, ktoré riadia proces synapsie: recA, recF, recO, recR, ssb atď. Vlastnosti mutantov recA. RecA proteín, jeho vlastnosti. Reakcie katalyzované proteínom RecA, jeho kľúčovou úlohou v prvých fázach procesu kríženia: presynapsia a synapsia. Povaha synapsie v homológnej rekombinácii. RecA DNA vlákna, ich štruktúra a funkcie v rekombinácii. Schéma kríženia v E. coli zahŕňajúca RecBCD nukleázu a RecA proteín. RecA homológy v iných prokaryotických a eukaryotických organizmoch. Úloha proteínu SSB. Postsynapsiové gény: ruvA, ruvB, ruvC, recG a ich produkty. Úloha pri realizácii migrácie Hollidayovho polochiazmu a pri jeho riešení.
Supresorové mutácie v sbcA, sbcB, sbcC a sbcD. Exonukleázy I a VIII. SbcCD nukleáza. Tri cesty rekombinácie chromozomálnej DNA v E. coli K-12 podľa Clarka: RecBCD, RecF a RecE, ich charakteristiky. Úloha dráh RecF a RecE v homológnej rekombinácii plazmidov.
Vlastnosti procesu kríženia v eukaryotoch. Meiotický prechod. Úloha synaptonemálneho komplexu. Genetická kontrola meiotickej rekombinácie. Rozmanitosť proteínov podobných RecA (rekombináz) v eukaryotoch.
Mitotické kríženie: vzťah medzi recipročnou a nerecipročnou rekombináciou. Kríženie v bunkách G1. Rozdiely v genetickej kontrole meiotického a mitotického kríženia v kvasinkách sacharomycét.
Rekombinačné hotspoty v eukaryotoch. Úloha DNR DNA pri iniciácii meiotického a mitotického kríženia.
Rekombinačná oprava DNR v chromozomálnej a plazmidovej DNA v kvasinkách. Genetická kontrola a rôzne mechanizmy: model Zhostaka et al. a jeho modifikácie, mechanizmy „break and copy“, „annealing“ komplementárnych reťazcov DNA (“single-red annealing“), „homológne-dependentné ligácie“.
Ektopická rekombinácia, jej genetická kontrola, molekulárne mechanizmy a biologický význam.
Génová konverzia (korekcia rekombinantného heteroduplexu). Nereciprocita intragénnej rekombinácie. Hypotéza korekcie nesúladu (Hallyday). Genetická kontrola a spôsoby korekcie heteroduplexov v E. coli. Systémy na opravu nepárových báz s tvorbou a budovaním rozšírených medzier v heteroduplexe. Systém Mut HLSU, jeho charakteristiky. Molekulárny model heteroduplexnej korekcie za účasti systému MutHLSU. Evolučný konzervativizmus MutL a MutS proteínov. Úloha MutL a MutS proteínov v procesoch korekcie chybne spárovaných báz a v regulácii homeologickej rekombinácie. Systémy korekcie nesúladu v E. coli s tvorbou a vypĺňaním krátkych medzier. Korekcia heteroduplexov pri bakteriálnej transformácii, jej genetická kontrola (Hex systém), vplyv na výsledky genetického mapovania. Korekcia a vysoké negatívne rušenie.
Génová konverzia v eukaryotoch. Tetradová analýza interalelických krížení. Typy notebookov. Polarita konverzie, jej príčiny. Spoločná konverzia. Dĺžka konverzného úseku. Otázka vzťahu medzi meiotickou konverziou a recipročnou rekombináciou bočných markerov. Konverzia mitotického alelického génu. Ektopická meiotická a mitotická konverzia. Prepínanie MAT lokusov v homotalických kvasinkách. Genetická kontrola konverzie génov v ekaryotoch s použitím kvasiniek a ľudí ako príkladov. Eukaryotické homológy bakteriálnych proteínov MutL a MutS - rodiny proteínov PMS, MHL, MHS atď., ich funkcie v rekombinácii a iných bunkových procesoch. Zložitosť systémov korekcie nesúladu v eukaryotoch na základe účasti rôznych homológov bakteriálnych proteínov MutL a MutS.
Úloha konverzie v evolúcii a ontogenéze. Vzťah medzi procesmi kríženia a konverzie v rôznych genetických systémoch. Procesy konverzie, ktoré sa vyskytujú nezávisle od kríženia.
Rekombinačné procesy, ktoré nepotrebujú homológiu pre synapsiu
Rekombinácia špecifická pre lokalitu. Distribúcia miestne špecifických rekombinačných systémov u prokaryotov a eukaryotov, ich funkcie. Miestovo špecifické topoizomerázy typu I ako kľúčové proteíny miestne špecifickej rekombinácie v bakteriofágoch, baktériách a kvasinkách. Dve rodiny miestne špecifických topoizomeráz I sú integrázy a resolvázy.
Miestne špecifická rekombinácia počas integrácie a excízie fágu l. Campbellova schéma. Rozdiely medzi genetickými mapami vegetatívneho fága a profága. Štruktúra stránok attP a attB. System Int. Int proteín ako zástupca rodiny integráz. Proteín E.coli IHF. Intasoma. Molekulový model fágovej integrácie a excízie l. Antiparalelné zarovnanie miest att počas synapsie. Povaha synapsie pri miestne špecifickej rekombinácii.
Miestovo špecifické inverzie DNA v bakteriofágoch a baktériách (systém Din) a v kvasinkách. Kľúčovými rekombinantnými proteínmi sú invertázy ako členovia rodiny resolvas. Zosilňovače rekombinácie pre inverzie špecifické pre lokalitu. Proteín Fis E.coli. Invertazóm. Molekulový model rekombinácie uskutočňovaný resolvázami. Úloha miestne špecifických inverzií v regulácii génovej expresie.
Transpozície mobilných genetických prvkov. Transpozície u prokaryotov. Pohyblivé genetické prvky: prvky IS, transpozóny (Tn), Mu fág. Štruktúra pohyblivých prvkov. Funkcie ovládané rôznymi pohyblivými prvkami. Transpozícia. Účasť proteínov hostiteľskej bunky na transpozícii. Otázka špecifickosti integrácie mobilného prvku do cieľa DNA. Všeobecnosť reakcií, ktoré tvoria procesy transpozície v rôznych typoch mobilných prvkov prokaryotov a eukaryotov.
Genetická organizácia jednoduchých transpozónov rodiny Tn3. gény tnpA a tnpR, ich produkty. Replikatívna transpozícia, dva kroky procesu. Molekulárny model Shapiro. Genetická kontrola a molekulárny mechanizmus nereplikatívnej transpozície v komplexných transpozónoch Tn5, Tn9 a Tn10. Genetická kontrola a mechanizmy transpozície vo fágu Mu. transpozóm.
Konjugatívne transpozóny grampozitívnych a gramnegatívnych baktérií, ich klasifikácia. Genetická kontrola a mechanizmy transpozície. biologický význam.
Mobilné genetické prvky eukaryotov (kvasinky, rastliny, Drosophila, cicavce). Klasifikácia eukaryotických mobilných prvkov. Prvky so štruktúrou prokaryotického typu. Retrotranspozóny I. typu u kvasiniek, rastlín a živočíchov, ich štruktúra, genetická kontrola a transpozičný mechanizmus, klasifikácia. Retrotranspozóny typu II: štrukturálne vlastnosti, distribúcia, transpozičný mechanizmus.
Genetické účinky spôsobené mobilnými prvkami u prokaryotov a eukaryotov: zmeny v génovej expresii, génové mutácie, chromozomálne preskupenia, hybridná dysgenéza. Účasť mobilných prvkov na organizácii štruktúry chromozómov. Úloha v ontogenéze živých organizmov a vo vývoji genetického materiálu. Pohyblivé prvky ako nástroj genetického výskumu.
nelegálna rekombinácia. Rozsah javov, ktoré možno pripísať nelegálnej rekombinácii. Nehomologická rekombinácia v baktériách katalyzovaná DNA gyrázou. Molekulárny model (Ikeda). Nehomologická rekombinácia zahŕňajúca DNA-dependentnú proteínkinázu u stavovcov. Úloha pri oprave dvojvláknových zlomov, integrácii exogénnej DNA do chromozómov a preskupeniach sekvencií imunoglobulínovej DNA.
Programované rekombinačné prestavby genetického materiálu v ontogenéze
Spájanie odpojených častí génov pomocou miestne špecifickej rekombinácie počas sporulácie v Bacillus subtilis a počas tvorby heterocyst vo filamentóznych cyanobaktériách. Preskupenie genetického materiálu počas tvorby makronukleu u ciliátov. Zníženie chromatínu u mnohých predstaviteľov bezstavovcov.
Miestne špecifická rekombinácia u stavovcov zapojených do preskupení imunoglobulínových DNA sekvencií. Štruktúra molekúl imunoglobulínu. Organizácia a štruktúra sekvencií DNA podieľajúcich sa na tvorbe génov kódujúcich imunoglobulíny. Úloha génových produktov RAG1 a RAG2. Mechanizmus miestne špecifickej rekombinácie počas dokovania kódujúcich segmentov imunoglobulínových génov. Účasť iných genetických procesov na tvorbe imunoglobulínových génov: homológna rekombinácia (ektopický mitotický cross over, ektopická mitotická konverzia), nelegálna rekombinácia, hypermutagenéza, alternatívny zostrih. Obmedzenie týchto procesov na určité štádiá diferenciácie B-lymfocytov.
Transformácia je proces absorpcie voľnej molekuly DNA z prostredia bunkou a jej začlenenia do genómu, čo vedie k tomu, že sa v takejto bunke objavia nové dedičné znaky charakteristické pre organizmus darcu DNA. Niekedy sa transformácia chápe ako akýkoľvek proces horizontálneho prenosu génov vrátane transdukcie, konjugácie atď.
Transformácia prokaryotov
V akejkoľvek populácii je len časť baktérií schopná absorbovať molekuly DNA z prostredia. Stav buniek, v ktorom je to možné, sa nazýva stav kompetencie. Zvyčajne sa maximálny počet kompetentných buniek pozoruje na konci logaritmickej rastovej fázy.
V stave kompetencie baktérie produkujú špeciálny proteín s nízkou molekulovou hmotnosťou (kompetenčný faktor), ktorý aktivuje syntézu autolyzínu, endonukleázy I a proteínu viažuceho DNA. Autolyzín čiastočne ničí bunkovú stenu, čo umožňuje prechod DNA a tiež znižuje odolnosť baktérií voči osmotickému šoku. V stave kompetencie klesá aj celková intenzita metabolizmu. Je možné umelo uviesť bunky do stavu kompetencie. Na tento účel sa média s vysokým obsahom iónov vápnika, cézia, rubídia, elektroporácia alebo recipientné bunky nahrádzajú protoplastmi bez bunkových stien.
Účinnosť transformácie je určená počtom kolónií pestovaných na Petriho miske po pridaní 1 μg superšpirálovej plazmidovej DNA k bunkám a nasadení buniek na živné médium. Moderné metódy umožňujú dosiahnuť účinnosť 106--109.
Absorbovaná DNA by mala byť dvojvláknová (účinnosť transformácie jednovláknovej DNA je rádovo nižšia, ale o niečo sa zvyšuje s kyslé prostredie), jeho dĺžka je najmenej 450 párov báz. Optimálne pH pre priebeh procesu je okolo 7. Pre niektoré baktérie (Neisseria gonorrhoeae, Hemophilus) musí DNA, ktorá sa má absorbovať, obsahovať určité sekvencie.
DNA je ireverzibilne adsorbovaná na proteín viažuci DNA, potom je jedno z vlákien rozrezané endonukleázou na fragmenty 2-4 000 párov báz a preniká do bunky, druhé je úplne zničené. Ak majú tieto fragmenty vysoký stupeň homológie s niektorými oblasťami bakteriálneho chromozómu, tieto oblasti môžu byť nimi nahradené. Účinnosť transformácie preto závisí od evolučnej vzdialenosti medzi darcom a príjemcom. Celková doba spracovania nepresiahne niekoľko minút. Následne sa pri delení DNA vybudovaná na základe pôvodného vlákna DNA dostane do jednej dcérskej bunky a do druhej bunky na základe vlákna s obsiahnutým cudzím fragmentom (štiepenie).
Transformácia eukaryotických buniek pomocou syntetických polymérnych katiónov
Dodanie cudzích nukleových kyselín do intaktných buniek, príp transformácia, je základom mnohých metód genetické inžinierstvo. Transport funkčných génov do tkanív môže umožniť korekciu génových deficitov a mutácií, ktoré vedú k závažným dedičným patológiám resp. rakovinové nádory. V súčasnosti vyvinutý celý riadok metódy zavádzania DNA do buniek, medzi ktorými sú najčastejšie precipitácia fosforečnanom vápenatým alebo dietylaminoetyl-dextránom (DEAE-dextrán), elektroporácia, mikroinjekcia, vkladanie DNA do rekonštruovaného obalu vírusov alebo lipozómov (lipidové vezikuly umelej membrány).
Napriek rôznorodosti týchto metód pokračuje hľadanie nových spôsobov transformácie pro- a eukaryotických buniek. Na jednej strane je to kvôli potrebe zvýšiť efektivitu transformácie, na druhej strane sú vyššie uvedené metódy použiteľné len na obmedzený počet bunkových línií a sú neúčinné pri pokuse o zavedenie RNA do buniek. Nakoniec, väčšina z týchto prístupov nemôže byť použitá na in vivo genetickú transformáciu.
Ako nosiče DNA sa používajú retrovírusové vektory, vektory založené na vírusoch obsahujúcich DNA a HIV, lipozómy na báze katiónových lipidov a polymérne katióny viažuce DNA. Použitie syntetických polymérov ako nosičov DNA má množstvo výhod: jednoduché skladovanie a čistenie, jednoduché testovanie toxicity a bezpečnosti a, čo je obzvlášť dôležité pre génovú terapiu, zníženie rizika patogenetických a imunologických komplikácií.
Keď sa zmiešajú roztoky lineárnych polykatiónov a DNA, vytvárajú sa interpolyelektrolytové komplexy (IPEC) v dôsledku vytvorenia kooperatívneho systému medzireťazcových elektrostatických väzieb. V tomto prípade polykatiónové reťazce obklopujú molekulu DNA a vytvárajú gule alebo toroidy v závislosti od typu polyméru. Začlenenie do IPEC vedie ku zhutneniu DNA, zvýšeniu jej odolnosti voči pôsobeniu nukleáz, zosilňuje jej interakciu s bunkovou membránou a zvyšuje transformačnú aktivitu vo vzťahu k prokaryotickým aj eukaryotickým bunkám. Kombináciou polykatiónových molekúl s ligandami schopnými špecificky sa viazať na bunkovú membránu je možné zabezpečiť penetráciu IPEC do bunky cez receptorovú dráhu a v tele - cielenú dodávku do cieľových buniek.
Systémy dodávania DNA na použitie v génovej terapii musia zabezpečiť penetráciu DNA do požadovaného orgánu, tkaniva alebo špecifickej skupiny buniek a potom do bunkového jadra. Antisense oligonukleotidy, ktoré sa najčastejšie používajú v génovej terapii, musia nájsť mRNA alebo oblasť chromozomálnej DNA, proti ktorej sú namierené. Zavedený gén musí byť začlenený do konštruktu schopného ho exprimovať.
Ide však o pomerne zložitý problém. Keď sa nukleová kyselina alebo oligonukleotid zavedie do tela, prevažne sa nedostanú do požadovaného tkaniva alebo orgánu a tá ich časť, ktorá bude na správnom mieste, bude schopná prejsť cez hydrofóbnu bunku len v malej miere. membrána. Okrem toho sa v priebehu evolúcie vyvinuli mechanizmy na ochranu telesných buniek pred inváziou faktorov vonkajšie prostredie vrátane cudzej DNA. Keď sa cudzia DNA dostane do bunky, nemusí sa lokalizovať tam, kde je to potrebné, a navyše môže skončiť v lyzozómoch, kde ju zničia nukleázy.
K penetrácii do bunky a intracelulárnemu transportu IPEC dochádza pravdepodobne v dôsledku tvorby a následnej deštrukcie endozómov. V každej fáze tohto procesu sa stráca významná časť materiálu. Slabé uvoľňovanie vektorov z endozómov do cytoplazmy a ich neefektívny prenos do jadra vedie k nízkej účinnosti expresie transgénu.
Reštrikčná mapa plazmidu pBR 322:
čísla označujú číslovanie nukleotidov;
tenké čiarky - jednotlivé miesta rozpoznané obmedzeniami;
hrubé sivé šípky nad - smer transkripcie;
Pbla - Ampr génový promótor - rezistencia na ampicilín;
Ptet - promótor génu Tetr - rezistencia na tetracyklín;
TT1 - Rho-nezávislý terminátor transkripcie (pozícia 3140-3160); TT2 - pozícia 3080-3110; ROP - proteín, ktorý podporuje tvorbu duplexov medzi RNA 1 a RNA 2 (negatívny regulátor počtu kópií); RNA 1 - kontrolná RNA (kontroluje počet kópií plazmidu); RNA 2 - "primer" RNA (slúži ako primer na replikáciu); hrubé čierne šípky - smer transkripcie RNA 1 a RNA 2
Vektory založené na fágu M13
Existujú tri spôsoby, ako zvýšiť účinnosť prenosu DNA v eukaryotických buniek pomocou syntetických polykatiónov. Po prvé, ide o zvýšenie špecifickosti transfekcie v dôsledku ligandov naviazaných na polykatiónovú molekulu a poskytnutie selektívnej interakcie komplexov s bunkami určitého fenotypu. Po druhé, zvýšenie účinnosti transformácie v dôsledku selekcie génov alebo oligonukleotidov zavedených do bunky. Po tretie, zvýšenie frekvencie transfekcie, ktoré sa dosahuje použitím ligandov, ktoré účinnejšie interagujú s bunkovou membránou, a látok, ktoré membránu destabilizujú. Okrem toho je možná syntéza nových polykatiónov.
Laboratórium molekulárnej virológie a genetického inžinierstva Výskumného ústavu chrípky Ruskej akadémie lekárskych vied v Petrohrade študuje spôsob dodania DNA a vírusových častíc do buniek. V tejto práci používame súbor polymérnych nosičov syntetizovaných pracovníkmi Ústavu makromolekulárnych zlúčenín Ruskej akadémie vied. Ako expresné vektory boli použité nasledujúce plazmidy: pUC 18, obsahujúci cytomegalovírusový promótor a gén b-galaktozidázy, a pBR 322, obsahujúci cytomegalovírusový promótor a gén pre zelený fluorescenčný proteín rias.
Ako výsledok štúdií sa zistilo, že IPEC poly-(2-(dimetylamino)etyl)metakrylátu (PDMAEMA) s nízkou molekulovou hmotnosťou majú najvyššiu transfekčnú aktivitu. Ďalší výskum umožní vývoj nových prístupov k riešeniu skutočné problémy vo virológii, molekulárnej a bunkovej biológie, genetické inžinierstvo, génová terapia.
Transdukcia (z lat. transductio - pohyb) je proces prenosu bakteriálnej DNA z jednej bunky do druhej bakteriofágom. Všeobecná transdukcia sa používa v bakteriálnej genetike na mapovanie genómu a kmeňové inžinierstvo. Mierne aj virulentné fágy sú schopné transdukcie, tie však ničia bakteriálnu populáciu, preto je transdukcia s ich pomocou v prírode alebo vo výskume málo dôležitá.
Všeobecná (nešpecifická) transdukcia
Vykonáva ho fág P1, ktorý existuje v bakteriálnej bunke vo forme plazmidu, a fágy P22 a Mu, ktoré sa integrujú do ktorejkoľvek časti bakteriálneho chromozómu. Po indukcii profága, s pravdepodobnosťou 10?5 na bunku, môže byť fragment bakteriálnej DNA chybne zabalený do fágovej kapsidy, v tomto prípade samotný fág neobsahuje DNA. Dĺžka tohto fragmentu sa rovná dĺžke normálnej fágovej DNA, jeho pôvod môže byť akýkoľvek: náhodná oblasť chromozómu, plazmid, iné fágy mierneho pásma.
Keď je fragment DNA v inej bakteriálnej bunke, môže byť začlenený do jej genómu, zvyčajne homológnou rekombináciou. Plazmidy prenesené fágom sú schopné uzavrieť sa do kruhu a replikovať sa už v ňom nová klietka. V niektorých prípadoch sa fragment DNA neintegruje do chromozómu príjemcu, nereplikuje sa, ale zostáva v bunke a je prepísaný. Tento jav sa nazýva abortívna transdukcia.
Špecifická transdukcia
Špecifická transdukcia bola najlepšie študovaná na príklade fágu L. Tento fág sa integruje len do jednej oblasti (miesto att) chromozómu E. coli s určitou nukleotidovou sekvenciou (homológnou s oblasťou att vo fágovej DNA). Počas indukcie môže jeho vylúčenie zlyhať s chybou (pravdepodobnosť 10?3--10?5 na bunku): fragment rovnakej veľkosti ako fágová DNA je vyrezaný, ale so začiatkom na nesprávnom mieste. V tomto prípade sa niektoré fágové gény stratia a niektoré gény E. coli sú ním zachytené. Pravdepodobnosť prenosu génu v tomto prípade klesá so zvyšovaním vzdialenosti od neho k miestu att.
Každý mierny fág, ktorý sa špecificky integruje do chromozómu, má svoje vlastné miesto att a teda aj gény umiestnené vedľa neho, ktoré je schopný prenášať. Množstvo fágov sa môže integrovať do akéhokoľvek miesta na chromozóme a niesť akékoľvek gény mechanizmom špecifickej transdukcie. Okrem toho chromozóm zvyčajne obsahuje sekvencie, ktoré sú čiastočne homológne s att oblasťou fágovej DNA. Pri poškodení úplne homológneho miesta att je možné dosiahnuť inklúziu fága do chromozómu podľa týchto sekvencií a preniesť v priebehu špecifickej transdukcie gény, ktoré už s nimi susedia.
Keď sa mierny fág nesúci bakteriálne gény integruje do chromozómu novej hostiteľskej baktérie, obsahuje už dva identické gény – svoj vlastný a prinesený zvonku. Keďže fág je zbavený niektorých vlastných génov, často sa nedá indukovať a reprodukovať. Keď je však tá istá bunka infikovaná "pomocným" fágom rovnakého druhu, je možná indukcia defektného fága. DNA normálneho „pomocného“ fága aj DNA defektného fága spolu s bakteriálnymi génmi, ktoré nesú, vychádzajú z chromozómu a replikujú sa. Preto asi 50 % výsledných fágových častíc nesie bakteriálnu DNA. Tento jav sa nazýva vysokofrekvenčná transdukcia (HFT).
Konjugácia (z lat. conjugatio - spojenie), parasexuálny proces - jednosmerný prenos časti genetického materiálu (plazmidy, bakteriálny chromozóm) s priamym kontaktom dvoch bakteriálnych buniek. Otvorili ju v roku 1946 J. Lederberg a E. Taitem. V prírode má veľký význam, pretože podporuje výmenu užitočných vlastností pri absencii skutočného sexuálneho procesu. Zo všetkých procesov horizontálneho prenosu génov umožňuje konjugácia prenos najväčšieho množstva genetickej informácie.
Mechanizmus
Na úspešné vytvorenie kontaktu medzi dvoma bunkami musí byť v darcovskej bunke prítomný konjugačný (sexuálny, prenosný) plazmid. Prvým z nich bol F-plazmid: epizóm (schopný integrácie do bakteriálneho chromozómu), dlhý asi 100 tisíc párov báz. Plazmid nesie gény kódujúce množstvo funkcií. Jedným z nich je tvorba sexuálnych pili zodpovedných za priľnutie k bunke príjemcu.
Konjugatívne plazmidy tiež kódujú proteíny, ktoré bránia prichyteniu pili iných baktérií bunková stena daný. Preto bunky, ktoré už obsahujú prenosné plazmidy, majú o niekoľko rádov menšiu pravdepodobnosť, že budú pôsobiť ako príjemcovia počas konjugácie.
Plazmid kóduje endonukleázu, ktorá štiepi jedno z jeho reťazcov DNA v špecifickom bode (oriT). Potom sa odstrihnutý reťazec rozkrúti a 5" koniec sa prenesie do bunky príjemcu. Predpokladalo sa, že DNA sa prenáša kanálmi v sexuálnom pili, ale zatiaľ sa ukázalo, že k prenosu dochádza cez póry v bunke steny.V prvom segmente vlákna vstupujúceho do DNA bunky príjemcu sú umiestnené antireštrikčné gény.Tieto gény musia byť v príjemcovi prepísané ihneď po ich príchode, aby sa zabezpečila akumulácia proteínov, ktoré blokujú proces deštrukcie DNA reštrikčnými enzýmami .Nakoniec sa prenesený reťazec uzavrie do kruhu a na jeho základe sa obnoví dvojvláknová štruktúra plazmidovej DNA. Celý proces trvá niekoľko minút.
Konjugačný plazmid môže byť integrovaný do chromozómu homológnou rekombináciou zahŕňajúcou IS elementy. Konjugácia v tomto prípade prebieha podľa rovnakého mechanizmu, avšak príjemcovi sa neprenesie len plazmid, ale aj chromozomálny materiál darcu. V tomto prípade sa proces oneskoruje o hodiny, často dochádza k prerušeniu prenášaného vlákna DNA. Umelým zastavením prenosu DNA v rôznych časoch a pozorovaním, ktoré gény sa preniesli, sa získala mapa chromozómu E. coli a ukázala sa jeho kruhová štruktúra.
Po odštiepení z chromozómu môže plazmid zachytiť jeho fragment a preniesť ho s ním do inej bunky (analógia s transdukciou). Tento proces sa nazýva sexdukcia.
Niektoré malé plazmidy, nazývané mobilizovateľné, môžu byť prenesené konjugáciou pomocou "pomocného" prenosového zariadenia na prenos plazmidov. Aby to bolo možné, musia obsahovať sekvencie podobné oriT konjugačného plazmidu a rozpoznávané jeho endonukleázami.
Načítava...