Štúdium reverzie protoplastov baktérií a húb odhalilo podobnosť priebehu tohto procesu u nich. Bežne sa dá rozdeliť do troch štádií: 1) regenerácia bunkovej steny, 2) reverzia, objavenie sa revertantných buniek, 3) obnovenie normálnej cytokinézy a objavenie sa buniek pôvodnej formy.
Každá skupina mikroorganizmov má zároveň svoje vlastné charakteristiky priebehu reverzie protoplastov spojené so štruktúrou buniek a bunkových stien, povahou metabolizmu a cytokinézy.
Reverzia bakteriálnych protoplastov. Ak počas liečby lyzozýmom alebo penicilínom v izotonickom médiu nie je bunková stena úplne odstránená z bakteriálnej bunky, potom keď sú tieto činidlá vylúčené z média, rýchle zotavenie bunky. Ak je bunková stena úplne odstránená, výsledný pravý protoplast nie je schopný normálnych podmienkach regenerovať ju. Jednou z podmienok, ktoré umožňujú takýmto formám vrátiť sa do pôvodného stavu, je prítomnosť pevného alebo polotuhého základu v kultivačnom médiu. Môže to byť želatína (5-30%), agar (0,7-2%), membránové filtre, usmrtené bakteriálne bunky alebo bunkové steny. Okrem toho je výhodné použiť pevný substrát.
Protoplastová reverzia vláknitých húb. K reverzii na mycéliové formy v protoplastoch húb dochádza tak v kvapaline, ako aj na povrchu pevného média alebo vo vrstve polotekutého agaru. Mnoho výskumníkov ukázalo, že k reverzii hubových protoplastov môže dôjsť tromi spôsobmi, ktoré sa líšia povahou tvorby primárneho mycélia. S prvým spôsobom protoplasty tvoria spočiatku reťazec buniek podobných kvasinkám (až 20 buniek). Potom terminál, už osmoticky stabilný, produkuje primárnu hýfu, ktorá tvorí mycélium. Druhý spôsob reverzia začína regeneráciou bunkovej steny protoplastmi, v dôsledku čoho sa stávajú odolnými voči osmotickému šoku. Protoplast potom tvorí zárodočnú trubicu. Tretia cesta reverzia hubových protoplastov je nezvyčajná. Protoplast, ktorý si zachová svoj guľovitý tvar, vytvorí novú škrupinu vo forme police, do ktorej sa potom prenesie obsah materského protoplastu. Ak sa objaví reťazec takýchto škrupín, potom sa cytoplazma pohybuje pozdĺž tohto reťazca a zanecháva za sebou "tiene" z bunkových stien. Posledná bunka reťazca tvorí primárnu hýfu. Protoplasty húb sa môžu vrátiť jedným z troch spôsobov alebo všetky tri spôsoby návratu sú pozorované u jedného druhu. Ťažko povedať, čo ovplyvňuje výber reverznej metódy, azda druhové vlastnosti organizmu, typ jeho cytokinézy, spôsob získania a podmienky inkubácie protoplastov, prípadne zloženie regeneračného média.
Rastúce a revertujúce protoplasty sú dobrým modelom na štúdium biosyntézy bunkovej steny a vzťahu medzi bunkovým rastom a delením jadra.
4.2. Kultivácia rastlinných buniek
Myšlienka možnosti kultivácie buniek mimo tela vznikla na konci 19. Obdobie od roku 1892 do roku 1902 možno považovať za prehistóriu vývoja metódy kultivácie rastlinných buniek a tkanív. V tom čase sa nemeckí vedci H. Fechting, K. Rechinger, G. Gaberlandt pokúšali vypestovať kúsky tkanív izolovaných z rastlín, skupín buniek a vlasov. Bez dosiahnutia experimentálneho úspechu však títo prví výskumníci vyjadrili množstvo nápadov, ktoré boli implementované neskôr.
V nasledujúcich 20 rokoch sa získali prvé výsledky o kultivácii živočíšnych tkanív na živných pôdach doplnených sérami. Ale v flóry napriek snahám o vytvorenie optimálnych živných médií, ktoré dokážu zabezpečiť dlhodobú existenciu a reprodukciu rastlinných buniek in vitro, sa nedosiahol žiadny významný pokrok.
V roku 1922 W. Robbins a Kotte nezávisle na sebe ukázali možnosť kultivácie meristémových buniek koreňového hrotu paradajok a kukurice na syntetických živných médiách. Tieto experimenty znamenali začiatok aplikácie metódy kultivácie izolovaných rastlinných buniek a orgánov.
V 30-60 rokoch vďaka práci veľkého počtu vedcov (F. White, R. Gautre a iní) počet rastlinných druhov, ktorých bunky a tkanivá boli pestované in vitro, dosiahol značný počet (viac ako 150) . Boli opísané kompozície živných médií, boli stanovené potreby kultúr na vitamíny a rastové stimulanty, boli vyvinuté metódy na získanie a pestovanie veľkých množstiev bunkových suspenzií, ako aj na kultiváciu jednej bunky izolovanej zo suspenzie. F. Steward, pracujúci s kultúrou izolovaného floému mrkvy, z nej v roku 1958 získal celé rastliny. Významný príspevok k rozvoju rastlinnej bunkovej a tkanivovej kultúry mala R. G. Butenko a jej spolupracovníci, ktorí pomocou týchto metód študovali fyziológiu rastlinných buniek a morfogenézu rastlín.
V nasledujúcich rokoch boli navrhnuté metódy na získanie izolovaných protoplastov z rastlinných tkanív, našli sa kultivačné podmienky, za ktorých sú schopné vytvárať novú bunkovú stenu, deliť sa a dať vznik bunkovým líniám. Použitím izolovaných protoplastov boli vyvinuté spôsoby hybridizácie somatických buniek fúziou protoplastov s PEG (polyetylénglykolom) a zavedením vírusovej RNA, bunkových organel a bakteriálnych buniek do nich. Metódou meristémovej kultivácie sa získali bezvírusové ekonomicky významné rastliny s vysokou mierou rozmnožovania.
V súčasnosti sa aktívne pokračuje vo vývoji metód hĺbkovej kultivácie buniek, metód elektrofúzie izolovaných protoplastov a pod.
Použitie metód na získanie somaklonálnych variantov, experimentálnych haploidov, skríning biochemických mutantov viedlo k vzniku produktívnejších a prispôsobených podmienkam kultivácie bunkových kmeňov používaných na vytváranie nových foriem a odrôd poľnohospodárskych, liečivých, okrasných a iných rastlín.
Zhromaždil sa experimentálny materiál demonštrujúci schopnosť NF obnoviť rast za priaznivých podmienok. Reverzné podmienky zahŕňajú použitie rôznych reverzných induktorov (fyzikálnych, chemických, biotických), ale môžu tiež spočívať len v odstránení nepriaznivých účinkov, ako sa to napríklad ukazuje pri mikroorganizmoch vystavených gama žiareniu.
Z fyzikálnych faktorov je najčastejšou príčinou reverzie zvýšenie teploty z 0,5-6°C na 20-22°C alebo až 37°C, krátkodobé oteplenie až na 45°C. Rýchly nárast CFU v mikrokozme sa považuje skôr za dôkaz reverzie než opätovného rastu niekoľkých prežívajúcich buniek.
V niektorých prípadoch optimalizácia teploty nedokáže stimulovať reverziu. V. parahaemolyticus sa zvráti, keď teplota stúpne na 25 °C v kombinácii s použitím minimálneho fyziologického média. NP V. harveyi a V. fischeri obnovia rast, keď sa pridajú organické alebo anorganické zdroje dusíka, uhlíka alebo rozkladačov peroxidu vodíka.
Medzi chemickými induktormi NF reverzie je známa skupina zlúčenín, ktoré ničia peroxid vodíka (antioxidanty). Medzi takéto zlúčeniny patrí pyruvát sodný, kataláza, vitamín E. Dostávajú sa priamo do mikrokozmu ako chrániče alebo ako súčasť živných médií určených na reverziu. To umožnilo získať reverziu E. coli, V. parahaemolyticus. Účinnosť spätného chodu je ovplyvnená chemické zloženie prostredia a jeho stavu agregácie (najlepšie tekuté živné pôdy).
Na zvrátenie NF sa do živných médií pridávajú rastové biotické faktory: fetálne sérum, supernatant rastúcej kultúry alebo z neho izolovaný rekombinantný proteín Rpf. Bol hlásený účinok cytokínov na reverziu NF. Nekultivované virulentné kmene Salmonella boli reverzibilné in vitro a in vivo v prítomnosti tumor nekrotizujúceho faktora (TNF).
Niekedy je jediným účinným spôsobom reverzie prechod cez citlivý organizmus. Tak napríklad NP rekultivácia patogénnych kmeňov Salmonella po zavedení do tela citlivých zvierat vždy viedla k pozitívnemu výsledku. Paralelná rekultivácia rovnakých suspenzií in vitro nepriniesla pozitívne výsledky.
Pravda o reverzii, a nie o opätovnom raste prežívajúcich buniek, zostáva najkontroverznejšou otázkou. Rast z malého inokula sa používa ako dôkaz reverzie. Rast kultúry z malého množstva vo vegetatívnych bunkách je oveľa pomalší ako vo variantoch s NF.
Bunkové štruktúry neboli presne študované, pretože samotné bunky neboli kultivované, ale sú známe výlučne z fragmentov DNA. Zrejme však bude potrebné rozdeliť „nekultivovateľné“ do čistých kultúr. To si však vyžaduje lacné, rýchle a dostupné metódy pre každé laboratórium. genetická analýza. Potom, napríklad, keď sa vo vzorke nájde „nekultivovateľná“ DNA, môžeme začať vyberať prostredia a podmienky, pričom sa zakaždým kontroluje genetickými metódami: je pestovaná kolónia požadovaným „nekultivovaným mikroorganizmom“ alebo nie? Ak nie, opäť obmieňajte prostredie a podmienky, až sa napokon začne pestovať to „nekultivované“. Ďalší možný spôsob„pozrieť sa im do tváre“ znamená pokúsiť sa nasadiť nejakú fluorescenčnú alebo rádioaktívnu značku na izolovanú „nekultivovateľnú“ DNA, vypustiť ju do prírody a zistiť, s kým sa hybridizuje podľa princípu komplementarity. Čo sa týka organizácie DNA - v zásade sa na diagnostiku nepoužíva celá DNA, ale len oblasť kódujúca 16S ribozomálnu RNA a medzi baktériami, archeami a "nekultivovanými" nie sú zásadné rozdiely. 16S RNA bola vybraná z mnohých celkom biologicky opodstatnených dôvodov. Ale tento prístup je tiež „z chudoby“: je veľmi drahé a časovo náročné analyzovať celú DNA, úplné sekvenovanie genómu sa vykonalo pre veľmi málo prokaryotov (pamätajte, koľko úsilia a laboratórií na celom svete boli zapojené do ľudského genómu a koniec koncov, baktérie majú len 10-krát menej génov ako naše).
Úvod
Vedci dlhé stáročia skúmali mikrobiálne populácie a mechanizmy ich vzniku a až koncom minulého storočia sa stretli so špeciálnou formou organizácie bakteriálnych kultúr – spoločenstvom mikroorganizmov, ktoré dokážu kolonizovať objekty životného prostredia a existujú nielen vo forme mikroplanktónu, ale aj špecificky organizovaných biofilmov. Biofilmy sú mobilné, neustále sa meniace heterogénne spoločenstvá (Chebotar, 2012), ktoré môžu tvoriť baktérie jedného alebo viacerých druhov a pozostávajú tak z aktívne fungujúcich buniek, ako aj zo spiacich či nekultivovaných. Vytváranie takýchto vysoko špecializovaných spoločenstiev je jednou z hlavných stratégií prežitia bakteriálnych kultúr nielen v prostredí, ale aj v ľudskom tele. Vo všeobecnosti sú biofilmy skupinou mikrobiálnych buniek obklopených silnou vrstvou makromolekulárneho hlienu.
Mechanizmus tvorby biofilmu
Mikroorganizmy zvyčajne existujú ako voľne plávajúce masy alebo jednotlivé kolónie, ale niektorí zástupcovia bakteriálnej ríše majú tendenciu sa prichytávať na špecifický povrchový substrát a vytvárať biofilm, ktorého mechanizmus tvorby je zložitý, prísne regulovaný a zahŕňa štyri postupné štádiá.
Fáza 1: reverzibilné (primárne) pripevnenie k povrchu. Prvý stupeň tvorby biofilmu charakterizuje reverzibilná adhézia spojená s pôsobením nešpecifických fyzikálno-chemických síl medzi molekulami a štruktúrami na povrchu mikroorganizmov (prvky bunkovej steny, bičíky, pili) a pevným substrátom v dôsledku rôznych interakcií: van der Waals, hydrofóbne, iónové, elektrostatické;
2. fáza: nezvratné pripevnenie k povrchu. Po adsorpcii sa bakteriálna bunka pohybuje po povrchu substrátu, pevne sa naň viaže prostredníctvom adhéznych faktorov, ako aj pomocou nepolymérnych adhezínov, ktoré rozlišujú štruktúrne prvky povrchov hostiteľských tkanív - kolagén, elastín, glykoproteíny , kyselina hyalurónová. V rovnakom štádiu okrem silného prichytenia k substrátu dochádza k: strate pohyblivosti baktériami, medzibunkovým interakciám, výmene génov medzi mikroorganizmami oboch odlišné typy.
3. fáza: dozrievanie - dozrievanie 1 . Po pevnom pripojení k substrátu a výmene génov začnú pripojené baktérie syntetizovať exopolysacharid obklopujúci matricu známu ako extracelulárna polymérna látka ( extracelulárny polymérne látka), čo je ochranný „hlien“ a tvorí 85 % celého zrelého biofilmu (Chebotar, 2012; Frolova, 2015). Táto matrica podporuje tvorbu počiatočného biofilmu z malých bakteriálnych kolónií. Zložky exopolysacharidu sa líšia v závislosti od toho, ktoré mikroorganizmy sú jeho súčasťou.
4. fáza: rast - dozrievanie 2 . V tomto štádiu sa vytvára zrelý biofilm, po ktorom prichádza čas pre sekundárnych kolonizátorov, teda buniek, ktoré sa prichytia na baktérie už lokalizované na povrchu (Afinogenova, 2011).
Zrelé biofilmy sú schopné stratiť jednotlivé fragmenty, ktoré sa šíria cez makroorganizmus, pripájajú sa k substrátom a vytvárajú nové biofilmy. Okrem toho sa baktérie nedelia v zrelých biofilmoch, pretože sú obklopené hustou matricou a zachovávajú si vysokú životaschopnosť.
Tvorba biofilmu je pomerne rýchla. Vzájomné prichytenie baktérií nastane v priebehu niekoľkých minút, pevne viazané kolónie sa vytvoria za 2 až 4 hodiny a produkcia extracelulárnej polymérnej látky nastane v priebehu 6 až 12 hodín, po ktorých sa baktérie, ktoré tvoria biofilm, stanú do značnej miery tolerantnými voči antibiotiká, dezinfekčné prostriedky, antiseptiká. Okrem toho sa biofilmy rýchlo zotavujú po mechanickom náraze (Chebotar, 2012).
Ultraštruktúra biofilmu
Ultraštruktúra biofilmu bola stanovená pomocou konfokálnej skenovacej laserovej mikroskopie. Extracelulárna matrica mikrobiálnych buniek má špecifickú štruktúru a je tvorená trojrozmernými hubovitými alebo stĺpcovými štruktúrami. Exopolysacharid uvoľnený v štádiu dozrievania biofilmu je reprezentovaný dvojvrstvovým heteropolysacharidom, ktorý je univerzálny pre každý typ mikroorganizmov. Jeho vonkajšia vrstva obsahuje polysacharidy v hydratovanom stave (dextrán, kyselina hyalurónová, celulóza) a vnútorná vrstva je vyplnená membránovými vezikulami, ktoré môžu pôsobiť ako faktory patogenity (takéto vezikuly obsahujú alkalický fosfát C, proteázy, lyzozým). Látky vezikúl plnia aj funkciu lýzy oslabených bakteriálnych buniek, ktorých fragmenty následne slúžia ako rastový faktor a zdroj výživy pre zvyšné členy biofilmu.
Všetky zložky matrice sú oddelené kanálmi, cez ktoré sa uskutočňuje transport živín a kyslíka, ako aj uvoľňovanie konečných produktov metabolizmu bakteriálnych buniek. Za tvorbu a udržiavanie takýchto transportných kanálov sú zodpovedné povrchové štruktúry - ramnolipidy, pozostávajúce zo zmesi polysacharidov, proteínov, nukleových kyselín a iné látky.
Matrica biofilmu obsahuje aj extracelulárnu DNA, ktorá sa podieľa na procesoch adhézie, medzibunkových interakciách a určuje špecifickosť existencie spoločenstiev biofilmu (Tets, 2012).
Morfológia buniek, ktoré tvoria biofilm
Pomocou elektrónovej mikroskopie sa zistilo, že skoré štádia vznik biofilmu, morfológia mikroorganizmov sa nemení (Frolova, 2015). V nasledujúcich, neskorších štádiách získavajú bakteriálne štruktúry morfologickú špecifickosť spojenú s pripojeným stavom a kolektívnym spolužitím. Okrem toho sú bunky v biofilme nahradené povrchovými štruktúrami, zvyšuje sa frekvencia výmeny genetického materiálu medzi jednotlivcami v spoločenstve a dochádza k deformácii ultraštrukturálnej organizácie.
Vlastnosti a úloha pri ochrane bakteriálnych populácií
Biofilmy sú jedným z najvýznamnejších ochranných faktorov, výrazne zvyšujúcich toleranciu baktérií voči stresovým situáciám (nedostatok kyslíka a živín pri hladovaní), voči faktorom imunitného systému. Ľudské telo, do akcie vonkajšie podmienky(antibiotiká, dezinfekčné prostriedky, sterilizácia). Takáto tolerancia prispieva k získaniu absolútnej odolnosti voči faktorom, ktoré by mohli baktérie zničiť, ak by boli vo voľnom stave.
Ochranná úloha biofilmov spočíva v nasledujúcich vlastnostiach:
- Bariérový majetok. Biofilmy zabraňujú hlbokému prenikaniu veľkých molekúl a buniek, ktoré spôsobujú zápal, do ich matrice a slúžia ako difúzna bariéra pre malé antimikrobiálne látky;
- Celkové ochranné vlastnosti. Baktérie (rovnakého aj rozdielneho druhu) sú schopné vymieňať si ochranné faktory (metabolické produkty alebo gény), teda vykonávať vzájomnú ochranu. Baktérie jedného druhu, ktoré sú rezistentné na antibiotiká, teda môžu prenášať gény zodpovedné za rezistenciu na baktérie iného druhu, ktoré sú citlivé na toto antibiotikum, čím sa zvyšuje ich odolnosť voči pôsobeniu faktora;
- Výmenná vlastnosť, ktorá zabezpečuje prenos génov a odpadových produktov medzi mikroorganizmami, ktoré sú súčasťou toho istého biofilmu (Chebotar, 2012; Tets, 2012);
- Vlastnosť inaktivity, teda vytváranie imobilných (neaktívnych, nemetabolizujúcich, spiacich) subpopulácií, je kľúčovou vlastnosťou, ktorá je vlastná výlučne biofilmom. Aby antibiotikum mohlo pôsobiť na mikroorganizmus, musí byť metabolicky aktívne. Preto sú neaktívne baktérie v biofilmoch voči takýmto vplyvom najodolnejšie (Tets, 2012; Frolova, 2015).
Rozmanitosť systémov regulácie biofilmu
Bunky v extracelulárnej matrici majú « zmysel pre kvórum“ ( kvórum snímanie) - schopnosť prenášať informácie a regulovať svoje správanie v dôsledku sekrécie signálnych molekúl. Inými slovami, je to regulačný systém umiestnený vo vnútri biofilmu. Sú známe tri systémy, ktoré sa navzájom líšia povahou autoinduktorov:
- Využívajú ho najmä gramnegatívne baktérie a acylovaný homoserín laktón pôsobí ako signálne molekuly, ktoré sa viaže na regulačný proteín, ktorý interaguje s dvoma regulačnými enzýmami – luciferázou a homoserín-laktón-syntázou. Aktivácia regulačných proteínov indukuje tvorbu zhlukov biofilmu mikróbmi (Tets, 2012; Turkutyukov, 2013).
- Je charakteristická pre grampozitívne baktérie a funguje pomocou lineárnych a cyklických foriem peptidov, furánov, laktónov, ich derivátov vylučovaných počas vonkajšie prostredie. Niektoré z nich interagujú so senzorickými kinázami viažucimi membránu, ktoré vedú signál cez membránu, zatiaľ čo iné sú transportované do bunky pomocou permeáz, kde sa viažu na intracelulárne receptory. Signálnym mechanizmom takýchto systémov je fosforylačno-defosforylačná kaskáda. Informačné molekuly interagujú s dvojzložkovými systémami, ktoré zahŕňajú signálnu proteínkinázu spojenú s membránou. Kináza deteguje mediátorový peptid a potom fosforyluje a aktivuje regulačný proteín, ktorý sa viaže na DNA a reguluje transkripciu. Signálne peptidy tohto systému sú kódované v chromozóme, zatiaľ čo receptorové proteíny sú kódované v plazmidoch. Plazmidy nesúce gény rezistencie na antibiotiká, gény pre hemolyzíny, bakteriocíny a gény virulencie sú teda translokované pomocou takejto komunikácie.
- Vyskytuje sa vo všetkých mikroorganizmoch a signálne molekuly zastupujú butyrolaktón, chinol, hydroxyketóny, luciferáza. Baktérie majú receptorové senzorické proteíny, ktoré viažu autoinduktory a vytvárajú komplex, ktorý interaguje s membránovo viazanou kinázou. Kináza sa fosforyluje, fosfát sa prenesie do cytoplazmatického proteínu a potom do regulačného proteínu, ktorý sa viaže na DNA. Následne dochádza k aktivácii génov kódujúcich regulačné RNA, čo vedie k zastaveniu expresie komponentov bunkových štruktúr, ktoré realizujú vnútrobunkové medzibunkové komunikácie.
Takýto komplexný systém regulácie, založený na produkcii molekúl induktora signálu, sa uskutočňuje na rôznych úrovniach vplyvu: transkripčnej, translačnej, posttranslačnej. V dôsledku „quorum sensingu“ v populácii biofilmu neustále dochádza k dvom typom selekcie – pozitívnej a negatívnej, to znamená, že bunky s prospešnými vlastnosťami sú zachované a baktérie s „zbytočnými“ fenotypmi sú zničené (Tets, 2012).
Účasť systému TA (toxín-antitoxínový systém) na tvorbe biofilmu
Keď už hovoríme o biofilmoch, stojí za zmienku, že nie každý mikroorganizmus je schopný ich tvorby. Proces syntézy exopolysacharidovej matrice je určený určitými faktormi. Vyplýva to z najnovších výsledkov štúdie Univerzity v Štrasburgu. Louis Pasteur, možno tvrdiť, že na vytvorenie biofilmu je nevyhnutná prítomnosť špecializovaného proteínu. Napríklad na vytvorenie komunity Staphylococcus aureus je potrebná prítomnosť SasG-proteínu (v komplexe so Zn 2+). SasG proteín je proteín viažuci RNA, ktorý aktivuje:
1) rast povrchových štruktúr baktérií - bičíky, pili;
2) syntéza extracelulárnych polysacharidov;
3) zabezpečuje tvorbu tolerancie.
Za sekréciu proteínu SasG je zodpovedný súbor dvoch alebo viacerých blízko príbuzných génov, ktoré spolu kódujú proteín aj jeho zodpovedajúci blokátor.
Tento systém sa nazýva TA-modul. Je lokalizovaný v plazmide. Ide o pomerne zložitý systém, ktorý zabezpečuje nielen schopnosť baktérií vytvárať biofilmy, ale zabezpečuje aj ich životaschopnosť ako celku. Podľa (Yamaguchi, 2011), ak dcérskej bunke chýba plazmid, potom je nestabilný antitoxín (blokátor) zdedený z cytoplazmy materskej bunky zničený a stabilný toxický proteín bunku zabíja.
Okrem toho je modul TA zodpovedný za:
1) génová regulácia: niektoré toxíny pôsobia ako všeobecné represory génovej expresie, zatiaľ čo iné sú špecifickejšie;
2) kontrola rastu: ako bolo uvedené, bakteriostatické toxíny nezabíjajú hostiteľskú bunku, ale obmedzujú jej rast;
3) bunková rezistencia: v niektorých populáciách baktérií existuje subpopulácia buniek, ktorá je odolná voči pôsobeniu mnohých tried antibiotík. Subpopulácia je kontrolovaná toxínovo-antitoxínovými systémami. Tieto pomaly rastúce odolné bunky zaisťujú populáciu proti úplnému vyhynutiu.
4) programovaná bunková smrť a prežívanie jej „blízkych príbuzných“ – odlišná úroveň odolnosti buniek populácie voči stresovým podmienkam, spôsobujúca programovanú smrť niektorých buniek, ktorá zabraňuje vyhynutiu celej populácie (mŕtva bunka sa stáva zdrojom výživy pre zvyšok).
5) odolnosť voči bakteriofágom: keď bakteriofág naruší transkripciu a transláciu bunkových proteínov, aktivácia toxín-antitoxínových systémov obmedzí replikáciu fágov.
Klinický aspekt štúdia biofilmov
V súčasnosti je už spoľahlivo dokázaná úloha mikrobiálnych biofilmov pri výskyte a rozvoji mnohých infekčných ochorení. Ide o infekcie srdcových chlopní a kĺbových protéz, infekcie povrchov rán. Rany sú ideálnym substrátom pre mikrobiálnu kontamináciu s následnou tvorbou biofilmu. Biofilmy v rane vytvárajú prostredie s určitou mikroklímou, ktorá sa vyznačuje nízkym obsahom kyslíka. Biofilmy spomaľujú migráciu a proliferáciu keratinocytov, čím inhibujú ochranné imunitné mechanizmy a na vonkajšej strane vytvárajú ochrannú vrstvu nepreniknuteľnú pre antimikrobiálne látky miestna akcia(Chebotar, 2012a).
Typické biofilmové infekčné patológie sú gingivitída (zápal ďasien), stomatitída (zápal ústnej sliznice) a tvorba zubného kameňa. Otitis – najčastejší otolaryngologický problém – sprevádza aj tvorba biofilmov, a to nielen bakteriálnych, ale aj plesňových.
Okrem infekcií rán zohrávajú biofilmy úlohu pri chronických ochoreniach močového systému, infekciách spojených s katétrom a implantátom (katétre, kardiostimulátory, srdcové chlopne, ortopedické pomôcky), kardiovaskulárnych ochoreniach (sinusitída, endokarditída). Inými slovami, biofilmy hrajú kľúčovú úlohu v patogenéze široký rozsah povrchové aj hlboké infekčné ochorenia. Všetky tieto choroby sa ťažko liečia, majú vysokú mieru relapsov a niektoré z nich môžu byť smrteľné.
Ak máte podozrenie na prítomnosť mikroorganizmov tvoriacich biofilm v vivo berú sa do úvahy tieto faktory:
1) oddelenie biofilmov v krvnom riečisku alebo močovom trakte môže viesť k tvorbe embólií;
2) Biofilmy gramnegatívnych baktérií môžu produkovať endotoxín (lipopolysacharid), čo vedie k toxickému šoku a DIC;
3) baktérie v biofilmoch si môžu vymieňať plazmidy rezistencie (prenos rezistencie z druhu na druh);
4) baktérie v biofilme nie sú ovplyvnené imunitným systémom hostiteľa;
5) biofilmy môžu znížiť citlivosť baktérií na antimikrobiálne činidlo.
Posledné tri body naznačujú, že biofilmy sú vysoko odolné voči antibiotikám. S ohľadom na ne je však vhodnejšie používať termín tolerancia. Príkladom vzniku fenoménu tolerancie je proteín SasG Stafylokok aureus. Jeho biosyntéza vyvoláva zlyhanie v postreplikačnom cykle, v ktorom je narušené fungovanie bakteriálneho enzýmu gyráza (analóg topoizomerázy-4 v baktériách). To vedie k výskytu perzistentných látok.
Pretrvávajúce bunky sú jedinečné bunky bakteriálnych spoločenstiev, ktoré majú rovnakú sadu génov ako zvyšok mikroorganizmov v spoločenstve a sú na rozdiel od buniek okolo nich mnohonásobne odolnejšie voči vonkajším faktorom (Ulyanov, 2014). Pretrvávajúce baktérie sa od bežných baktérií líšia svojou fyziológiou: aj za priaznivých podmienok vytvárajú okolo seba exopolysacharidovú matricu, rastú často oveľa pomalšie ako bežné baktérie a ako už bolo spomenuté, sú vysoko odolné voči vonkajším faktorom. Pretrvávajúce tvoria malú časť bakteriálnej komunity, ale ich počet sa zvyšuje v stacionárnej fáze rastu. Je zaujímavé, že dcérske bunky majú rovnakú odolnosť voči vonkajším faktorom ako rodičovské perzistentné bunky.
Uvažujme o mechanizme perzistentnej rezistencie. Predpokladajme, že na bakteriálnu kolóniu pôsobí vonkajší faktor – napríklad antibiotikum. Antibiotikum inhibuje aktivitu gyrázy (topoizomerázy-4), v dôsledku čoho sa v bakteriálnej bunke vyskytujú zlomy dvojvláknovej DNA, ale iba v tých oblastiach, kde je aktívna gyráza, teda v oblasti „replikatívnej vidlice“. ". Ak sú bunky chránené extracelulárnou polymérnou látkou a počet takýchto miest nie je väčší ako dve alebo štyri, potom bunkové systémy chránia baktériu pred smrťou obnovením poškodenia. V bežných rýchlo rastúcich bakteriálnych bunkách je takýchto zlomov veľa a DNA pri užívaní antibiotík degraduje, pričom DNA perzistentných látok je zachovaná. Účinok antibiotík sa môže líšiť, ale všetky čelia rovnakému problému: pomaly rastúce, dobre chránené perzistentné jedince sú menej vystresované a majú čas „zamlčať“, kým sa im nenávratne poškodí.
Uvedené informácie nevyčerpávajú údaje o charakteristikách mikrobiálnych biofilmov. Je potrebné poznamenať, že napriek rozsiahlemu teoretickému materiálu a dôležitosti problému zostávajú nevyriešené otázky súvisiace s biofilmotvornou aktivitou patogénnych a podmienene patogénnych mikroorganizmov v zložení nozokomiálnej mikroflóry zdravotníckych nemocníc rôzneho profilu. Neexistujú žiadne lieky, ktoré by boli účinné proti biofilmom a mikroflóre v zložení extracelulárnych matríc, ani prostriedky na boj proti zrelým biofilmom. Tento problém si vyžaduje ďalší rozvoj.
Bibliografia
1. Yamaguchi Y., Inouye M. Regulácia rastu a smrti v Escherichia coli toxínovo-antitoxínovými systémami. Nature Reviews Microbiology 2011, 9 (11): 779-790.
2. Afinogenova A.G., Dorovskaja E.N. Mikrobiálne biofilmy rán: najnovší stav techniky // Traumatológia a ortopédia. - 2011. - č.3. – S.119–125.
3. Balko A.B., Balko O.I., Avdeeva L.V. Tvorba biofilmu kmeňmi Pseudomonas aeruginosa // Mikrobiologický časopis. - 2013. - č.2. – S.50–56.
4. Maltsev S.V., Mansurova G.Sh. Čo je to biofilm? // Praktické lekárstvo. - 2011. - č.53. – S.7–10.
5. Tets V.V., Tets. G.V. Mikrobiálne biofilmy a problémy antibiotickej terapie // Praktická pulmonológia. - 2013. - č.4. – S. 60–64.
6. Turkutyukov V.B., Ibragimova T.D., Fomin D.V. Molekulárne črty morfológie biofilmov tvorených kmeňmi nefermentujúcich gramnegatívnych baktérií // Pacific Medical Journal. - 2013. - č.4. – S.44–47.
7. V. Yu. Ul'yanov, S. V. Operedintseva, I. G. Shvidenko, I. A. Norkin, G. V. Korshunov a E. V. Gladkova, Russ. Biologická kinetika biofilmov klinických kmeňov Staphylococcus aureus a Pseudomonas aeruginosa izolovaných od pacientov s bronchopulmonálnymi komplikáciami pri traumatickom ochorení miechy // Klinické laboratórna diagnostika. - 2014. - č. 8. – S.43–47.
8. Frolova Ya.N. Biologické vlastnosti biofilmov toxigénnych kmeňov Corinobacterium Diphtheriae gravis TOX + : Cand. ... Kandidát biologických vied: 6. 12. 2015 / Frolova Yana Nikolaevna. - Rostov, 2015. - 118 s.
9. Chebotar I.V. Mechanizmus antibiofilmovej imunity // Bulletin Ruskej akadémie lekárske vedy. - 2012. - T.67. - č. 12. – S.22–29.
10. Chebotar I.V., Konchalová E.D., Bugrová M.L. Vezikulárne štruktúry v systéme Neutrofil-Staphylococcus aureus Biofilm // Infekčná imunológia. – 2012a. - č. 61. – S.35–39.
Úplne alebo čiastočne stratil bunkovú stenu alebo prekurzory jej biosyntézy, rastú vo forme charakteristických malých kolónií. Prvýkrát objavený v roku 1935 E. Klienebergerom v kultúre Streptobacillus moniliformis izolovanej K. Levaditi et al. v roku 1932 z kĺbovej tekutiny pacienta s epidemickým artikulárnym erytémom. Streptobacillus moniliformis je gramnegatívny hemoglobinofilný bacil s guľôčkovitými opuchmi na koncoch, ktorý dobre rastie na krvnom (10-20%) agare a zrazenom sére.
Pri štúdiu experimentálnej infekcie u potkanov Klineberger izoloval niekoľko kmeňov obsahujúcich okrem typických bakteriálnych foriem aj polymorfné mikroorganizmy, ktoré sú vzhľadom kolónií a morfológiou veľmi podobné organizmom podobným pleuropneumóniám - organizmom podobným pleuropneumóniám (P PL O). Tieto mikroorganizmy boli pomenované na počesť Ying. Lister - v tvare L.
Klineberger dlhé roky považoval L-formy za predstaviteľov PPLO symbiontov baktérie Streptobacillus moniliformis. Dôkazom symbiotickej existencie dvoch rôznych mikroorganizmov bola absencia reverzie baktérií z L-foriem počas 13 rokov (350 pasáží).
Rôzne experimenty Amer. výskumník Daines (L. Dienes) a ďalší dokázali omyl Klinebergerovho konceptu. Ukázalo sa, že L-formy Streptobacillus moniliformis, Fusiformis necrophorus a ďalšie baktérie sú schopné premeniť sa na pôvodné bakteriálne druhy. Tvorba L-foriem baktérií je opísaná pod názvami „L-transformácia“, „L-konverzia“, „indukcia L-foriem“.
V. D. Timakov a G. Ya. Kagan získali L-formy mnohých druhov baktérií, študovali ich biol, vlastnosti a úlohu v patológii (reumatické choroby srdca, septická endokarditída, meningoencefalitída, hron, kvapavka atď.).
Transformácia do L-formy je vlastnosť, s najväčšou pravdepodobnosťou, vlastná všetkým baktériám. Lieky, ktoré majú L-transformačný účinok, buď blokujú určité väzby v biosyntéze bunkových stien, hlavne peptidoglykán (mureín), alebo ich ničia. Liečivá, ktoré indukujú L-formy baktérií, zahŕňajú: 1) antibiotiká vhodného spektra účinku, napríklad penicilín, cykloserín, lyzostafín atď.; 2) murolytické enzýmy - lyzozým, endoacetylhexosaminidáza lyzínu spojeného s fágom streptokoka skupiny C atď.; 3) niektoré aminokyseliny (glycín atď.).
Indukcia L-foriem baktérií závisí od podmienok a kultivačných médií: je potrebné vytvoriť fyzikálne. prostredie, ktoré prispieva k stabilizácii osmoticky krehkej bakteriálnej membrány a chráni L-formy pred smrťou.
Zloženie média a kultivačné podmienky sa líšia v závislosti od typu baktérií; na zachovanie integrity agarového gélu je potrebná polotuhá a polotekutá koncentrácia agarového gélu, prítomnosť normálneho konského séra a výber osmotickej koncentrácie solí. cytoplazmatická membrána baktérií L-formy.
Existujú nestabilné a stabilné L-formy baktérií. Nestabilné formy si zachovávajú nek-ry prvky bunkovej steny alebo jej prekurzory a pri pasážovaní na médiách bez L-indukujúceho činidla sa vracajú k pôvodným bakteriálnym druhom. Stabilné formy úplne strácajú zložky bunkovej steny a nie sú schopné ju obnoviť, preto sa ani pri opakovanom pasážovaní na médiách bez induktora, ako aj na médiách s obsahom sukcinátu sodného, resp. želatína, ktorá podporuje reverziu baktérií z L-foriem.
L-formy baktérií rastú vo forme dvoch typov kolónií - A. a B. Kolónie typu A sú častejšie vlastné stabilným L-formám baktérií, sú veľmi malé (50-100 mikrónov), rastú do agaru , rastú dobre v skupinách, jednotlivé kolónie často nedávajú rast. Minimálne reprodukčné elementy kolónií typu A, úplne bez bunkovej steny, nemajú receptory prijímajúce fágy. Kolónie typu B sú častejšie vlastné nestabilným L-formám baktérií, sú väčšie, 0,5-2 mm veľké, s jemným čipkovaným okrajom a stredom prerastajúcim do média. V kolóniách dominujú guľovité telá s rôznou optickou hustotou; je v nich menej submikroskopických prvkov ako v kolóniách typu A. Zachovávajú si určité prvky bunkovej steny, fágo-receptívne receptory a môžu byť aglutinované sérom pôvodného druhu.
Podmienkou je diferenciácia kolónií na typy A a B, ako aj fenomén stabilizácie L-foriem. V kultúrach stabilných L-foriem baktérií môžu byť obsiahnuté kolónie typu B a v kultúrach nestabilných L-foriem kolónie typu A.
Kolónie L-foriem baktérií obsahujú: 1) guľovité telieska rôznej optickej hustoty a veľkosti; 2) elementárne telieska alebo granule umiestnené v skupinách, ako aj intracelulárne vo väčších sférických útvaroch alebo vakuolách; 3) slabo tvarované, beztvaré, stále rastúce telá; 4) skrútené formy; 5) veľké telá s inklúziami vo forme vakuol. L-formy baktérií sa líšia polymorfizmom (obr. 1, 1-6) a zároveň sú v zásade rovnaké u rôznych typov baktérií / čo neumožňuje ich odlíšenie morfolom, zn.
Spolu so stratou bunkovej steny u L-foriem baktérií dochádza k strate mezozómov, čo vedie k priamemu prichyteniu cytoplazmatickej membrány k nukleoidu; obnovenie mezozómov v procese reverzie nie je pozorované.
Nedostatok bunkovej steny spôsobuje dezorganizáciu delenia a plurality morfolu, prejavy pri rozmnožovaní L-foriem baktérií. L-formy baktérií sa rozmnožujú delením, pučaním alebo rozpadom bunky na malé granule.
Fyziologické, antigénne a patogénne vlastnosti týchto foriem sú určené štruktúrou ich cytoplazmatickej membrány, prípadne cytoplazmy.
L-formy baktérií sa tvoria nielen in vitro, ale aj in vivo, môžu v organizme pretrvávať a prechádzať do pôvodnej bakteriálnej formy.
Obrázok 2 ukazuje výsledky získania L-foriem S. typhi in vivo pod vplyvom penicilínu. Baktérie a antibiotikum sa myšiam podávali súčasne intraperitoneálne. Zavedením 100 IU penicilínu na 1 g hmotnosti sa vytvorili nestabilné L-formy, ktoré sa po 24-48 hodinách vrátili do pôvodných bakteriálnych foriem, čo spôsobilo úhyn zvierat. So zavedením 2000 jednotiek penicilínu na 1 g hmotnosti počas 24-48 hodín. vytvorili sa stabilné L-formy, ktoré boli podrobené fagocytóze; smrť zvierat v nasledujúcich 5 dňoch. nebol dodržaný. Podobné údaje sa získali pri štúdiu in vivo indukcie L-foriem iných baktérií.
Pôvodná schéma prideľovania L-foriem z patol, materiál je vypracovaný, okraje umožňujú prideľovať a identifikovať L-formy baktérií z likvoru pacientov s hnisavou meningitídou a reumatickým ochorením srdca.
Obrázok 3 ukazuje mikrofotografie L-foriem izolovaných z krvi pacienta s reumatickým ochorením srdca a ich revertantov vytvorených v dôsledku reverzie na streptokoky, následne identifikované ako skupina A Streptococcus hemolyticus.
Protilátky proti stabilným L-formám Streptococcus hemolyticus boli zistené u 87,9 % pacientov s reumatizmom, u 77 % pacientov s infekčno-alergickou myokarditídou a len u 11 % pacientov. zdravých ľudí(V. D. Timakov, G. Ya. Kagan, 1973). L-formy rôznych typov baktérií sa nachádzajú v hrone, bakteriúrii, pyelonefritíde, abakteriálnych formách tuberkulózy, reumatických ochoreniach srdca atď.
Patogenita L-foriem baktérií bola experimentálne dokázaná, je známy hron, artritída spôsobená intraartikulárnym podaním L-foriem Streptococcus hemolyticus, tonzilitída opíc, komplikovaná intersticiálnou myokarditídou, vyvolaná intravenóznym podaním L-foriem Streptococcus hemolyticus, pyelonefritída potkanov a králikov spôsobená L-formami baktérií rodu Proteus a Streptococcus faecalis, králičia meningoencefalitída spojená s L-formami meningokoka a listerióza oviec a králikov spôsobená zavlečením L-formy Listeria monocytogenes. Patol, procesy spôsobené L-formami baktérií sa líšia postupným vývojom patol. javy, predĺžený prúd a zotrvanie aktivátora v L-forme podporujúce prechod choroby na hron, formu. Perzistencia L-foriem baktérií bola stanovená experimentálne na L-formách Mycobacterium tuberculosis a Streptococcus hemolyticus.
Pri jedinej intraperitoneálnej infekcii bielych myší stabilnými L-formami Streptococcus hemolyticus a následným ročným pozorovaním je L-forma antigénu zachovaná vo všetkých vnútorné orgány. Obrázok 4, 1 ukazuje príklad lokalizácie L-foriem Streptococcus hemolyticus v slezine po 3 týždňoch. po infekcii, na obrázku 4, 2 - po 27 týždňoch. Dlhodobé pretrvávanie L-foriem v tele je sprevádzané zvýšením škodlivého účinku; rozvoj intersticiálnej myokarditídy a závažnej glomerulonefritídy.
Vznik L-foriem baktérií in vivo, ich spojenie s mnohými chronicky sa vyskytujúcimi procesmi, možnosť zvratu bakteriálnych foriem s obnovením ich virulencie a v dôsledku toho vznik rezistentných účinná terapia relapsy boli umiestnené pred medom. mikrobiológia, problém hľadania spôsobov, ako sa vysporiadať s variantmi mikroorganizmov, ktoré stratili bunkovú stenu (sféroplasty, protoplasty, L-formy). Vyhľadávania sa vykonávajú z dvoch diametrálne odlišných pozícií: 1) zabránenie možnosti indukcie L-foriem in vivo (cesta, ktorú je ťažké kontrolovať); 2) užívanie liekov, ktoré vyvolávajú tvorbu L-foriem s následným užívaním iných liekov, ktoré sú neúčinné proti intaktným bunkám, ale intracelulárne prenikajú len do L-foriem baktérií a ničia ich. Táto cesta je najsľubnejšia. Existujú dôkazy o účinnosti kombinácií penicilínu a kanamycínu používaných na liečbu pyelonefritídy. Penicilín vyvoláva tvorbu L-foriem baktérií, ktoré sú zničené intracelulárnym prienikom kanamycínu, ktorý nemá žiadny vplyv na intaktné baktérie.
Bibliografia: Peshkov M. A. Cytológia baktérií, s. 151, M.-L., 1955; Timakov V.D a Kagan G. Ya L-formy baktérií a čeľaď mycoplasmataceae v patológii, M., 1973, bibliogr.; oni, L-formy baktérií, čeľaď mycoplasmataceae a problém mikrobiálnej perzistencie, Zhurn, mikr., epid, a imuno., č.4, s. 3, 1977, bibliogr.; Dienes L. Morfológia Li z Klieneberger a jej vzťah k streptobacillus monoliformis, J. Bact., v. 54, s. 231, 1947; Spoločnosť Dinenes L. a. Weinberger H. L-formy baktérií, Bact. Rev., v. 15, str. 245, 1951; Klieneberger E. Prirodzený výskyt organizmov podobných pleuropneumónii, jeho zjavná symbióza so Streptobacillus moniliformis a inými baktériami, J. Path. Bact., v. 40, s. 93, 1935; Kli eneb erger-N obel E. Pleuropneumonia-like organisms (PPLO) mycoplasmataceae, L.-N. Y., 1962; Mikrobiálne protoplasty, sféroplasty a L-formy, ed. od L. B. Guze, Baltimore, 1968.
V. D. Timakov, G. Ya. Kagan.
Vytrvalosť Z lat. persisto - trvalý pobyt, pobyt, dlhá existencia, prítomnosť dlhodobého pobytu infekcie v organizme zvierat a ľudí, alebo bez klinických patologických prejavov (latentný priebeh, remisia infekčný proces), alebo schopné za určitých podmienok (imunitná nerovnováha a imunodeficiencia rôznej etiológie – stres, hypotermia, interkurentná infekcia, exacerbácia chronická choroba atď.) k aktivácii s vyústením do choroby (aktívny priebeh, exacerbácia infekčného procesu).
Mechanizmy perzistencie: - Tvorba L-foriem Antigénne mimikry Imunoglobulínový obal Schopnosť vylučovať látky, ktoré interferujú s pôsobením imunitných faktorov Sorpcia hostiteľských proteínov na povrchu bunky a tienenie pred imunitným systémom hostiteľa Antifagocytárne faktory: Kapsuly Mikrokapsuly Sliznice Látky redukujúce chemotaxia Neúplná fagocytóza atď.
Pôsobenie baktérií na cytokíny: Pôsobenie Zničte cytokíny Baktérie H. aeruginosa pomocou enzýmov L. pneumophila Naviažte cytokíny E. coli Potlačenie syntézy cytokínov Cytokíny IL-2, TNFa, IF-γ IL-2 IL-1, IL- 2, TNFa, GMCSF S. typhimurium, S. flexneri TNFa M. tuberculosis TRF(3 M. avium IL-6 L. monocytogenes IL-3, CSF-1 E. coli IL-2, IL-4, IL-5, IF-y Y. enterocolitica, B. suis, V. TNFa cholerae, B. anthracis P. aeruginosa TNFa, IL-1, IF-y S. typhimurium IL-2
Anti-lyzozýmová a anti-laktoferínová aktivita: Mikroorganizmy n Anti-laktoferínová aktivita, Antilyzozýmová aktivita ng/ml, μg/ml M ± SD S. aureus S. haemolyticus S. epidermidis E. coli Klebsiella spp. 15 22, 72 ± 1, 88 10, 1 ± 2, 17* 16 20, 08 ± 1, 41 4, 40 ± 1, 12 15 11, 50 ± 1, 45* 9, 91 ± 2 1, 8 , 84 ± 1,41 4. 19 ± 0. 61 12 7. 83 ± 1. 13* 8. 92 ± 2. 45* 15 5. 65 ± 0. 62 1. 24 ± 0. 25 87 23. 67* 2, 58 ± 0, 27* 12 18, 17 ± 3, 20 1, 64 ± 0. 15 12 19, 40 ± 2, 47 3, 24 ± 0, 27* 14 18, 13 ± 1 , 83 ± 0, 28 Pacienti s reumatickými ochoreniami Kontrola *Štatisticky významné
Tvorba L-formy - baktérie, čiastočne alebo úplne zbavené bunkovej steny, ale zachovávajúce si schopnosť vývoja. Výskyt L-foriem je výsledkom pôsobenia látok, ktoré blokujú tvorbu bunkovej steny: 1. antibiotiká (penicilíny cykloserín, cefalosporíny, vankomycín), 2. enzýmy (lyzozým, amidáza, endopeptidáza), 3. ultrafialové a röntgenové lúče , 4. aminokyselina glycín.
Pozadie: Písmeno L je prvým písmenom názvu Lister Institute v Londýne, kde Dr. Emmy Kleineberger-Nobel prvýkrát v roku 1935 upozornila na vývoj morfologicky veľmi nezvyčajné bunky v bakteriálnej kultúre Streptobacillus moniliformis izolovanej z ušnej tekutiny potkana.
vakuoly L-forma Bacillus subtilis, mierka - 500 nm. Rôzne L-formy Bacillus subtilis, v mierke 10 µm.
L-formy Vlastnosti L-foriem: 1. Syntéza plnohodnotnej bunkovej steny je nemožná Návrat do vegetatívnej formy po normalizácii faktorov prostredia Návrat k vegetatívnej forme je nemožný. Ďalšia existencia ako v mykoplazmách Podobné kultúrne vlastnosti. 3. Postupná transformácia z grampozitívnych na gramnegatívne štruktúry. Tvorba stabilných a nestabilných foriem L. 5. Zmena antigénnych vlastností (strata K- a O-antigénov). Nadobudnutie schopnosti vytrvať. 6. Znížená virulencia v dôsledku straty rôznych faktorov patogenita (adhézia, invázia, endotoxín atď.).
Mechanizmus fagocytózy: Chemostaxia Sily fyzikálno-chemickej interakcie Koncentračný gradient 2. Adhézne štádium Osonizácia (AT, C 3 b, fibronektín, surfaktán) Fyzikálno-chemická interakcia 3. Endocytóza 4. Mikrobicidita Nezávislá od kyslíka závislá od kyslíka
makroorganizmus 1. Porušenie fúzie fagozómu s lyzozómom (mycobacterium tuberculosis, prvoky, toxoplazma) 2. Odolnosť voči lyzozomálnym enzýmom (gonokoky, streptokoky gr A, mykobaktérie, yersínie) 3. Dlhodobé (perzistencia v cytoplazme rickettsia) mikroorganizmus
Mechanizmus perzistencie chlamýdií Typické inklúzie obsahujúce elementárne a retikulárne telieska 48 hodín po inkubácii Patomorfologický model perzistencie. Po tepelnom šoku menšie inklúzie obsahujú veľké patologické formy chlamýdie
Makrofág nepredstavuje hlavnú AG (MOMP) Expresia skorých génových produktov lyzozóm Antigénne preťaženie Hyperprodukcia Ig A, G DTH Antigénne mimikry Exocytické vezikuly obsahujúce sfingomyelín, KG hps 60 - proteíny tepelného šoku Lipopolysacharid. Nevyjádřené Stav medzi retikulárnymi a elementárnymi telesami MOMP- nevyjádřené
+ Antifagocytárna aktivita: 1. Hustá bunková stena elementárnych teliesok (disulfidové väzby medzi proteínovými štruktúrami MOMP) 2. Pevnosť retikulárnych teliesok (polysacharidové puzdro) „zlyhanie“ Respiratory burst Aktivácia POL a poškodenie membrán vlastných buniek
TNFα γIF IL-1 1. Zvýšená expresia AG bunkových membrán (GCS, Fc) Aktivácia fibroblastov I epitelové bunky(neprofesionálne fagocyty) 2. Stimulácia IL 1 a IL 2 3. Aktivácia fagocytárneho aktu 4. Stimulácia tvorby Ig 5. Indukcia voľných radikálov
Mediátory perzistencie Chlamydia trachomatis Vplyv mediátora Nízke koncentrácie g-interferónu Prudký pokles množstva endogénneho tryptofánu (aktivácia enzýmu indolamín-2,3-dioxygenázy, ktorý štiepi tryptofán na N-formylkynurenín) TNF-a Nedostatok endogénnych tryptofán Sprostredkovaný aktiváciou b-IF (blokuje reprodukciu vnútrobunkových mikroorganizmov, zosilnením expresie membránových proteínov buniek) Nevyhnutný pre stavbu MOMP Nedostatok c. HMF a vysoké množstvo c. AMP Absencia aktivácie enzýmov potrebných na diferenciáciu RT na ET Nedostatok a/alebo pôsobenie antagonistov Ca 2+ Porušenie agregácie endozomálnych vakuol
Mediátory perzistencie Chlamydia trachomatis (pokračovanie) L-izoleucín Účinok môže byť spôsobený zahrnutím metabolického produktu a-metylbutarylu. spol. A pri syntéze mastných kyselín C. trachomatis s následným zabudovaním „cudzích“ triglyceridov do bunkovej membrány, čo vedie k jej destabilizačným stenám.
"Genetický drift" alebo antigénne mimikry: Aminokyselinové sekvencie 264-286 hlavného sigma faktora chlamýdiovej (Chl. trachomatis) RNA polymerázy. L 7 (peptid II), jeden z ribozomálnych proteínov AT Reumatické autoimunitné ochorenia
Perzistencia Francisella tularensis cytocholazín-necitlivá dráha Kaspáza 3 a 9 TNF, IL 1 23 -k. Da endozómy
+ Anti-izozým Anti-laktoferín Antikomplementová aktivita LPS francisella tularentis S-LPS R-LPS Reziduálna virulencia virulentná Nízka citlivosť hostiteľa LPS-viažuci proteín – LBP Inertný LPS Rýchla eliminácia Vysoká citlivosť hostiteľa Smrť organizmus perzistencia
Perzistencia a adaptívna mutagenéza v biofilmoch: Odolnosť biofilmov voči vonkajším vplyvom charakterizuje pojem „perzistencia“ (z anglického persistence – vytrvalosť, schopnosť prežitia). mŕtve bunky
Význam perzistencie v biofilmoch Podľa Centra pre kontrolu chorôb (CDC USA) je asi 65 % všetkých infekcií spôsobených tvorbou biofilmov v makroorganizme Tvorba biofilmov na všetkých zavlečených do makroorganizmu zdravotnícke prístroje(katétre, protézy, stenty atď.); Tvorba biofilmov na lekárskych prístrojoch...
baktéria + DNA. J (syntéza chaperónu) E. coli pmr. C (syntéza fosfolipidov) at. S. typhimurium Nepriaznivé podmienky Expresia génu SOS rmf gén, inhibítor translácie Gény tepelného a chladového šoku rec. A, um. DC, uvr. AB, sul. A Persister cells htr. A, htp. X, csp. H, clp. B, cbp. AB Gény systému „toxinantitoxin“ din. J/yaf. Q, áno. M, rel. BE, maz. EF
Gén A Gén T Gén P Antibiotikum Antitoxín Ribozóm Defektný proteín Normálny proteín T-A komplexŽiadna perzistencia proteínovej syntézy
Hlavné toxíny a ich miesto aplikácie v E. coli: cieľová aktivita toxínu Proces Ccd B DNA gyráza Dvojvláknové zlomy Replikácia Rel E Translačné ribozómy Štiepenie m RNA Translácia Maz F RNA endoribonukleáza Translácia Par E DNA gyráza Dvojreťazcové zlomy Replikácia Doc. RNA translácia Vap C RNA endoribonukleáza Neznáme Ξ-toxín Neznáme Fosfotransferáza Neznáme Hip A EF-TU Proteínkináza Translácia Hip B Translácia ribozómov štiepenie mRNA Preklad
Sigma faktor RNA polymerázy Rpo. S Adaptívna mutagenéza: ? "Adaptívny" označuje mutácie, ktoré sa vyskytujú v pomaly sa rozmnožujúcej alebo spiacej populácii mikroorganizmu počas obdobia dlhodobého stresu a ktoré pôsobia proti príčinám tohto stresu. Veillonella parvula Streptococcus mutans Antibiotická rezistencia
Lewis K. 2008 verí, že hlavným spôsobom boja proti pretrvávaniu v biofilmoch je „rozptyľovanie pacienta“ ...
Načítava...