Besnota(lat. - Lyssa; angl. - Rabies; besnota, hydrofóbia) - obzvlášť nebezpečné akútne zooantroponické ochorenie teplokrvných živočíchov všetkých druhov a ľudí, vyznačujúce sa ťažkým poškodením centrálneho nervového systému, nezvyčajným správaním, agresivitou, paralýzou a smrťou.

Historické pozadie, rozdelenie, stupeň nebezpečenstva a poškodenia. Choroba bola popísaná asi pred 5000 tisíc rokmi. Správy o tom sú k dispozícii v zákonníku Babylonu, dielach starých Grékov, najmä Aristotela. Dokonca aj mená "Besnota", "Lyssa" odrážajú hlavný klinický príznak choroby a sú preložené ako zúrivosť, šialený hnev. Starovekí lekári dokázali určiť prenos choroby cez sliny „rozzúrených“ psov. Dokonca aj v II storočí. n. e. lekári používali ako preventívne opatrenie proti besnote chirurgické odstránenie tkaniva v mieste uhryznutia a kauterizácia rán horúcim železom.
Obdobie objavov L. Pasteura je ďalšou etapou v histórii štúdia besnoty (1881-1903). Pasteur objavil vírusovú etiológiu besnoty. V roku 1890 Pasteurovi študenti E. Roux a E. Nocard zistili, že sliny chorých zvierat sa stávajú nákazlivými 3-8 dní pred klinickým prejavom choroby. L. Pasteur preukázal možnosť reprodukovania choroby intracerebrálnou injekciou materiálu a pri takýchto prechodoch mozgom králikov sa môžu meniť biologické vlastnosti vírusu. V roku 1885 sa uskutočnilo prvé očkovanie ľudí, čo sa stalo vrcholným úspechom celého úsilia L. Pasteura zachrániť ľudstvo pred besnotou. Zavedenie Pasteurovho očkovania viedlo k 10-násobnému alebo viacnásobnému zníženiu úmrtnosti na besnotu.

V súčasnosti je besnota registrovaná vo väčšine krajín sveta. Podľa WHO, napriek tomu, že každý rok sa na svete zaočkuje proti besnote viac ako 5 miliónov ľudí a desiatky miliónov zvierat, ročne je zaznamenaných okolo 50 tisíc úmrtí na túto chorobu a celkový počet chorých úžitkových zvierat je stovky. tisícky.

Napriek dosiahnutým úspechom nie je problém besnoty ani zďaleka vyriešený, stal sa veľmi aktuálnym v dôsledku progresívneho šírenia choroby medzi voľne žijúcimi zvieratami – takzvanej prirodzenej besnoty. Epizootita medzi voľne žijúcimi zvieratami viedla k zvýšeniu výskytu hospodárskych zvierat, predovšetkým hovädzieho dobytka.

Pôvodca ochorenia. Besnotu spôsobuje RNA vírus v tvare guľky z čeľade Rhabdoviridae, rod Lyssavirus.

Ryža. 1 - model vírusu besnoty:
a - zmenšujúce sa závity nukleokapsidu; b - relatívna poloha hrotov a základného micelárneho proteínu (pohľad zhora); v - hroty; g - micelárny proteín; e - vnútorná membránovitá vrstva; (e) Oblasť viriónu vykazujúca pomer lipidov k micelárnej vrstve, vlákna hrotov môžu siahať hlbšie do obalu. Bezchrbtová časť obalu môže vytvárať dutiny v nukleoproteínovej špirále.

Predtým sa všetky kmene vírusu besnoty považovali za antigénne jednotné. Teraz sa zistilo, že vírus besnoty má štyri sérotypy: vírus 1. sérotypu bol izolovaný v rôznych častiach sveta; vírus sérotypu 2 izolovaný z kostná dreň netopier v Nigérii; vírus 3. sérotypu sa izoluje z piskora a človeka; vírus sérotypu 4 bol izolovaný z koní, komárov a komárov v Nigérii a zatiaľ nebol klasifikovaný. Všetky varianty vírusu sú imunologicky príbuzné.

Centrálny nervový systém je selektívnym miestom pre pôvodcu besnoty. V najvyššom titri bol vírus nájdený v mozgu (Ammon rohy, cerebellum a medulla oblongata). Po porážke centrálneho nervového systému patogén preniká do všetkých vnútorných orgánov a krvi, s výnimkou omenta, sleziny a žlčníka. Vírus sa neustále nachádza v slinných žľazách a tkanivách očí. Kultivované intracerebrálnymi pasážami u králikov a bielych myší a v mnohých bunkových kultúrach.

Z hľadiska odolnosti voči chemickým dezinfekčným prostriedkom je patogén besnoty klasifikovaný ako odolný (druhá skupina). Nízke teploty vírus konzervujú a počas zimy zostáva v mozgoch zvieracích mŕtvol zahrabaných v zemi. Vírus je termolabilný: pri 60 ° C sa inaktivuje po 10 minútach a pri 100 ° C - okamžite. Ultrafialové lúče ju zabijú za 5-10 minút. V hnijúcom materiáli zostáva 2-3 týždne. Autolytické procesy a hniloba spôsobujú smrť patogénu v mozgu mŕtvol v závislosti od teploty po 5-90 dňoch.
Nasledujúce sú najúčinnejšie dezinfekčné prostriedky: 2% roztoky chloramínu, alkálie alebo formalínu, 1% jód, 4% roztok peroxidu vodíka, Virkon C 1:200 atď. Rýchlo inaktivujú vírus.

epizootológia. Hlavné epizootologické údaje o besnote:

Vnímavé druhy zvierat: teplokrvné živočíchy všetkých druhov. Najcitlivejšie sú líška, kojot, šakal, vlk, vačkovec a hraboš. Škrečky, sysle, skunky, mývaly, domáca mačka, netopier, rys, mangusta, morča a iné hlodavce, ale aj králik.
Citlivosť na vírus besnoty u ľudí, psov, oviec, koní, hovädzieho dobytka sa považuje za strednú a vtáky - slabé.
Mladé zvieratá sú na vírus náchylnejšie ako staré.

Zdroje a rezervoáre infekčného agens. Rezervoárom a hlavným zdrojom pôvodcu besnoty sú voľne žijúce dravce, psy a mačky, v niektorých krajinách sveta aj netopiere. V epizootiách mestského typu sú hlavnými šíriteľmi choroby túlavé a zanedbané psy a v epizootiách prírodného typu voľne žijúce dravce (líška, psík medvedíkovitý, líška polárna, vlk, korzák, šakal).

Spôsob infekcie a mechanizmus prenosu patogénu. K infekcii ľudí a zvierat dochádza priamym kontaktom so zdrojmi patogénu besnoty v dôsledku uhryznutia alebo slinenia poškodenej kože alebo slizníc.

Ryža. 2. Šírenie vírusu u zvierat a ľudí

Nakaziť sa besnotou je možné cez sliznice očí a nosa, alimentárne a aerogénne, ako aj prenosné.
V experimentálnych podmienkach bol pozorovaný aerogénny mechanizmus prenosu infekcie na líšky a iné voľne žijúce mäsožravce v jaskyniach, kde boli chované milióny netopierov. Mäsožravce boli infikované netopierím vírusom pomocou aerosólového generátora. Divoké zvieratá infikované aerosólom chované v oddelenej miestnosti a v izolovaných klietkach infikovali líšky a iné zvieratá: 37 líšok a iných mäsožravcov uhynulo na besnotu za viac ako 6 mesiacov. Tieto experimenty potvrdili respiračný prenos besnoty medzi voľne žijúcimi mäsožravcami. Vírus besnoty sa podarilo izolovať zo vzduchu pozorovaných jaskýň interacerebrálnou infekciou myší (Winkler, 1968). Constantine (1967) tiež poznamenal, že dvaja sanitári trpeli hydrofóbiou v dôsledku údajnej aerogénnej kontaminácie v ohnisku netopierej jaskyne. Winkler a kol. (1972) zistili prepuknutie besnoty v laboratórnej kolónii kojotov, líšok a mývalov, pravdepodobne v dôsledku aerogénneho prenosu vírusu adaptovaného na netopiere. Je potrebné poznamenať, že aerogénny mechanizmus prenosu infekcie sa reprodukuje najmä vírusom besnoty podporovaným netopiermi.
U myší, škrečkov, netopierov, králikov, skunkov sa besnota reprodukovala v experimentálnych podmienkach, keď bola infikovaná intranazálnou cestou.

Intenzita prejavu epizootického procesu. Pri vysokej hustote rozšírenia líšok, korzákov, psíkov medvedíkovitých, vlkov, šakalov, arktických líšok sa choroba rýchlo šíri, pri priemernej hustote ich rozšírenia sa besnota prejavuje ojedinele. Pri nízkej hustote populácie voľne žijúcich šeliem epizootika bledne.

Sezónnosť prejavu choroby, periodicita. Maximálny nárast výskytu na jeseň av zimno-jarnom období. Bol stanovený troj-štvorročný cyklus besnoty, ktorý súvisí s dynamikou počtu hlavných nádrží.

Faktory prispievajúce k vzniku a šíreniu besnoty. Prítomnosť zanedbaných psov a mačiek, ako aj
choré divé zvieratá.

Chorobnosť, úmrtnosť. Chorobnosť medzi neočkovanými zvieratami pohryzenými besnými psami je 30-35%, úmrtnosť je 100%.

Pôvodca besnoty je podľa epizootologickej klasifikácie zaradený do skupiny prirodzených fokálnych infekcií.

V súčasnosti existujú v Rusku tri typy infekcie besnotou:

arktický (nádrž - polárne líšky);
prírodná ohnisková lesostep (nádrž - líšky);
antropourgické (nádrž - mačky, psy).

Vzhľadom na povahu rezervoáru patogénov sa rozlišujú epizootiká besnoty mestských a prírodných typov. V epizootiách mestského typu sú hlavnými zdrojmi patogénu a šíriteľov choroby túlavé a túlavé psy. Rozsah epizoocie závisí od ich počtu. V epizootiách prírodného typu chorobu šíria najmä voľne žijúce dravce. Lokalizácia prirodzených ložísk ochorenia zodpovedá distribúcii líšok, korsakov, psíkov mývalovitých, vlkov, šakalov, arktických líšok. Sú veľmi citlivé na vírus, agresívne, často náchylné na migrácie na veľké vzdialenosti a pri ochorení intenzívne vylučujú vírus slinami. Tieto okolnosti spolu so značnou hustotou populácií niektorých predátorov (líška, psík medvedíkovitý), rýchlou zmenou ich generácií a trvania inkubačná doba pri besnote zaisťujú kontinuitu epizootického procesu aj napriek pomerne rýchlemu úhynu každého jednotlivého chorého zvieraťa.

Patogenéza. Možnosť vzniku infekcie besnotou, ktorej pôvodca sa zvyčajne prenáša uhryznutím, závisí od množstva vírusu, ktorý sa dostal do tela, od jeho virulencie a iných biologických vlastností, ako aj od miesta a charakteru poranení. spôsobené besným zvieraťom. Čím bohatšie je tkanivo v oblasti brány infekcie nervovými zakončeniami, tým väčšia je možnosť vzniku ochorenia. Dôležitý je aj stupeň prirodzenej odolnosti organizmu v závislosti od druhu a veku zvieraťa. Vírus sa v podstate dostáva do tela zvieraťa cez poškodenú kožu alebo sliznice.

Výskyt vírusu v krvi je často zaznamenaný pred nástupom klinických príznakov ochorenia a zhoduje sa so zvýšením telesnej teploty.

V patogenéze ochorenia možno podmienečne rozlíšiť tri hlavné fázy:

I - extraneurálne, bez viditeľnej reprodukcie vírusu v mieste očkovania (do 2 týždňov),
II - intraneurálne, dostredivé šírenie infekcie,
III - šírenie vírusu v tele, sprevádzané objavením sa symptómov ochorenia a spravidla smrťou zvieraťa.

Reprodukcia vírusu v sivej hmote mozgu spôsobuje rozvoj difúznej nehnisavej encefalitídy. Vírus putuje z mozgu pozdĺž odstredivých nervových dráh do slinné žľazy, kde sa množí v bunkách nervových uzlín a po ich degenerácii sa dostáva do kanálikov žliaz, pričom infikuje sliny. Izolácia vírusu slinami začína 10 dní pred nástupom klinických príznakov. V inkubačnej dobe sa vírus neurogénnou cestou transportuje aj z mozgu do slzných žliaz, sietnice a rohovky, do nadobličiek, kde sa zrejme aj rozmnožuje. Dopad patogénu najskôr spôsobí podráždenie buniek hlavné oddelenia centrálny nervový systém, čo vedie k zvýšeniu reflexnej excitability a agresivity chorého zvieraťa, čo spôsobuje svalové kŕče. Potom dochádza k degenerácii nervových buniek. Smrť nastáva v dôsledku paralýzy dýchacích svalov.

Aktuálne a klinický prejav príznaky besnoty. Inkubačná doba sa pohybuje od niekoľkých dní do 1 roka a v priemere je 3-6 týždňov. Jeho trvanie závisí od typu, veku, odolnosti zvieraťa, množstva preniknutého vírusu a jeho virulencie, lokalizácie a charakteru rany. Čím je rana bližšie k mozgu, tým rýchlejšie sa klinika besnoty objaví.

Ochorenie je často akútne. Klinický obraz podobné u zvierat všetkých druhov, ale lepšie študované u psov. Besnota sa u nich zvyčajne prejavuje v dvoch formách: násilná a tichá.

O násilný hnev Existujú tri obdobia: prodromálna, excitačná a paralýza.
Prodromálne obdobie (prekurzorové štádium) trvá od 12 hodín do 3 dní. Toto obdobie začína miernou zmenou správania. Choré zvieratá sú letargické, nudné, vyhýbajú sa ľuďom, snažia sa schovať na tmavom mieste, neochotne idú na výzvu majiteľa. V iných prípadoch sa pes stáva láskavým k majiteľovi a známym, pokúša sa olizovať si ruky a tvár. Potom sa úzkosť a excitabilita postupne zvyšujú. Zviera často leží a vyskakuje, bezdôvodne šteká, je zvýšená reflexná dráždivosť (na svetlo, hluk, šelest, dotyk atď.), objavuje sa dýchavičnosť, rozšírené zreničky. Niekedy sa vyskytuje v mieste uhryznutia silné svrbenie, zviera toto miesto olizuje, češe, obhrýza. Ako choroba postupuje, často sa objavuje zvrátená chuť do jedla. Pes žerie nejedlé predmety (kamene, sklo, drevo, zem, vlastné výkaly a pod.). Počas tohto obdobia sa vyvíja paréza svalov hltana. Zaznamenávajú sa ťažkosti s prehĺtaním (zdá sa, že sa pes niečím dusí), slinenie, chrapľavý a trhavý štekanie, neistá chôdza a niekedy aj strabizmus.

Druhé obdobie - excitácia - trvá 3-4 dni a je charakterizované nárastom symptómov opísaných vyššie. Agresivita rastie, pes môže bezdôvodne pohrýzť iné zviera alebo človeka, dokonca aj jeho majiteľa, obhrýza železo, palice, zem, často si láme zuby, niekedy aj spodnú čeľusť. U chorých psov sa zvyšuje túžba vymaniť sa a utiecť, besný pes prebehne za deň desiatky kilometrov, cestou pohryzie a nakazí iných psov a ľudí. Charakteristické je, že pes ticho pribehne k zvieratám a ľuďom a hryzie ich. Násilné útoky, trvajúce niekoľko hodín, sú nahradené obdobiami útlaku. Postupne sa rozvíja ochrnutie jednotlivých svalových skupín. Obzvlášť nápadná je zmena hlasu psa v dôsledku paralýzy svalov hrtana. Kôra znie chrapľavo, pripomína vytie. Toto znamenie má diagnostická hodnota. Spodná čeľusť je úplne ochrnutá, ochabuje. Ústna dutina je neustále otvorená, jazyk vypadne do polovice, pozoruje sa hojné slinenie. Súčasne dochádza k paralýze prehĺtacích svalov a svalov jazyka, v dôsledku čoho zvieratá nemôžu jesť potravu. Objaví sa strabizmus.

Tretie obdobie - paralytické - trvá 1-4 dni. Okrem ochrnutia dolnej čeľuste sú ochrnuté zadné končatiny, svaly chvosta, močového mechúra a konečníka, potom svaly trupu a predných končatín. Telesná teplota v štádiu excitácie stúpa na 40-41 ° C a v paralytickom štádiu klesá pod normál. V krvi je zaznamenaná polymorfonukleárna leukocytóza, počet leukocytov je znížený a obsah cukru v moči sa zvyšuje na 3%. Celkové trvanie choroby je 8-10 dní, ale často môže smrť nastať po 3-4 dňoch.

O tichá (paralytická) forma besnoty(častejšie zaznamenané, keď sú psy infikované líškami) excitácia je slabo vyjadrená alebo nie je vyjadrená vôbec. U zvieraťa s úplnou absenciou agresivity je zaznamenané silné slinenie a ťažkosti s prehĺtaním. U neznalých ľudí tieto javy často vyvolávajú pokus o odstránenie neexistujúcej kosti a pri tom sa môžu nakaziť besnotou. Potom u psov dochádza k ochrnutiu dolnej čeľuste, svalov končatín a trupu. Choroba trvá 2-4 dni.

Atypická forma besnoty nemá štádium excitácie. Zaznamenáva sa úbytok svalov a atrofia. Boli zaznamenané prípady besnoty, ktoré sa vyskytli len s príznakmi hemoragickej gastroenteritídy: vracanie, polotekuté výkaly obsahujúce krvavo-slizovité hmoty. Ešte menej často je zaznamenaný abortívny priebeh ochorenia kulminujúci uzdravením a recidivujúca besnota (po zjavnom uzdravení sa opäť rozvinú klinické príznaky ochorenia).

Na besnotu u mačiek klinické príznaky sú v podstate rovnaké ako u psov, ochorenie prebieha prevažne v násilnej forme. Infikované zviera sa často pokúša skryť na tichom, tmavom mieste. Choré mačky sú veľmi agresívne voči ľuďom a psom. Spôsobujú hlboké škody tým, že zatínajú pazúry a snažia sa uhryznúť do tváre. Ich hlas sa mení. V štádiu vzrušenia majú mačky tendenciu, podobne ako psy, utekať z domu. V budúcnosti sa vyvinie paralýza hltanu a končatín. Smrť nastáva 2-5 dní po nástupe klinických príznakov. Pri paralytickej besnote je agresivita slabo vyjadrená.

líšky keď sú chorí, sú upozornení nezvyčajným správaním: strácajú pocit strachu, útočia na psov, hospodárske zvieratá a ľudí. Choré zvieratá rýchlo strácajú váhu, často sa v oblasti infekcie vyskytuje svrbenie.

Na besnotu u hovädzieho dobytka inkubačná doba je viac ako 2 mesiace, častejšie od 15 do 24 dní. V niektorých prípadoch môže od okamihu uhryznutia po prvé príznaky ochorenia prejsť 1-3 roky. Besnota sa vyskytuje hlavne v dvoch formách: násilná a tichá. V násilnej forme choroba začína vzrušením. Zviera si často ľahne, vyskočí, bije chvostom, dupe, hádže sa o stenu, udiera rohmi. Agresivita je obzvlášť výrazná vo vzťahu k psom a mačkám. Zaznamenáva sa slinenie, potenie, časté nutkanie na močenie a defekáciu, sexuálne vzrušenie. Po 2-3 dňoch sa vyvinie paralýza svalov hltana (nemožnosť prehĺtania), dolnej čeľuste (slinenie), zadných a predných končatín. Smrť nastáva na 3-6 deň choroby.
Pri pokojnej forme sú príznaky vzrušenia mierne alebo chýbajú. Pozoruje sa útlak, odmietanie kŕmenia. Kravy prestávajú vylučovať mlieko a žuvačky. Ďalej sú to obrny hrtana, hltana, dolnej čeľuste (chrapľavé bučanie, slinenie, neschopnosť prehĺtať) a potom zadné a predné končatiny. Smrť nastáva na 2-4 deň.

O oviec a kôz príznaky sú rovnaké ako u hovädzieho dobytka: agresivita, najmä voči psom, zvýšená sexuálna dráždivosť. Paralýza sa rýchlo rozvíja a na 3.-5. deň zvieratá uhynú. Pri paralytickej forme besnoty nie je zaznamenané vzrušenie a agresivita.

Besnota u koní najprv sa prejavuje úzkosťou, strachom, vzrušivosťou. V mieste uhryznutia je často možné svrbenie. Prejavuje sa agresivita voči zvieratám, niekedy aj voči ľuďom. Počas obdobia vzrušenia sa kone vrhajú na stenu, lámu si hlavy, obhrýzajú kŕmidlá, dvere, niekedy naopak upadnú do depresie a opierajú si hlavu o stenu. Existujú kŕče svalov pier, líc, krku, hrudník. S ďalším vývojom ochorenia sa vyvíja paralýza prehĺtacích svalov a potom končatín. Zviera uhynie na 3-4 deň choroby. Niekedy však smrť nastane po 1 dni. Pri paralytickej forme besnoty vypadne štádium excitácie.

Besnota u ošípanýchčasto prebieha prudko a násilnou formou. Ošípané sa preháňajú v koterci, odmietajú sa kŕmiť, obhrýzajú kŕmidlá, prepážky, miesto uhryznutia. Existuje silné slinenie. Prejavuje sa agresivita voči iným zvieratám a ľuďom. Prasnice sa vrhajú na vlastné prasiatka. Čoskoro sa vyvinie paralýza a 1-2 dni po objavení sa zvieratá uhynú. Trvanie ochorenia nie je dlhšie ako 6 dní.
Pri paralytickej forme besnoty (zriedkavo zaznamenanej) sú zaznamenané depresie, odmietanie jedla a vody, mierne slinenie, zápcha a rýchlo progresívna paralýza. Zvieratá uhynú 5-6 dní po nástupe príznakov ochorenia.

Patologické príznaky. Patologické zmeny sú vo všeobecnosti nešpecifické. Pri prehliadke mŕtvol sa zaznamenáva vychudnutie, stopy po uhryznutí a škrabance, poškodenie pier, jazyka a zubov. Viditeľné sliznice sú cyanotické. Pri pitve sa zistí cyanóza a suchosť seróznych vrstiev a slizníc, kongestívna množina. vnútorné orgány; krv tmavá, hustá, dechtovitá, zle koagulovaná; tmavočervené svaly. Žalúdok je často prázdny alebo obsahuje rôzne nejedlé predmety: kusy dreva, kamene, handry, podstielku atď. Sliznica žalúdka je zvyčajne hyperemická, edematózna, s malými krvácaniami. Tvrdá plena je napnutá. Cievy injekčne. Mozog a jeho mäkká škrupina sú edematózne, často s petechiálnymi krvácaniami, lokalizované hlavne v mozočku a predĺženej mieche. Mozgové zákruty sú vyhladené, mozgové tkanivo je ochabnuté.
Histologické zmeny sú charakterizované rozvojom diseminovanej nehnisavej polyencefalomyelitídy lymfocytového typu.

Dôležitou diagnostickou hodnotou pri besnote je tvorba v cytoplazme gangliových buniek špecifických teliesok - inklúzií Babes-Negri, okrúhlych alebo oválnych, obsahujúcich bazofilné granulárne formácie vírusových nukleokapsidov rôznych štruktúr.

Diagnostika a odlišná diagnóza besnota. Diagnóza besnoty sa robí na základe komplexu epizootických, klinických, patologických a anatomických údajov a výsledkov. laboratórny výskum(konečná diagnóza).
Na výskum besnoty sa do laboratória posiela čerstvá mŕtvola alebo hlava z veľkých zvierat - hlava. Materiál na laboratórny výskum sa musí odoberať a odosielať v súlade s Pokynom o opatreniach na boj proti besnote zvierat.

Všeobecná schéma diagnostiky ochorenia je znázornená na obrázku 3:

AT posledné roky boli vyvinuté nové metódy diagnostiky besnoty: rádioimunoanalýza, enzýmová imunoanalýza (ELISA), enzýmová imunoanalýza (TF-ELISA), identifikácia vírusu pomocou monoklonálnych protilátok, PCR.

V diferenciálnej diagnostike je potrebné vylúčiť Aujeszkyho chorobu, listeriózu, botulizmus. U psov - nervová forma moru, u koní - infekčná encefalomyelitída, u hovädzieho dobytka - malígna katarálna horúčka. Podozrenie na besnotu je možné aj v prípadoch otravy, koliky, ťažké formy ketózy a iných neprenosných ochorení, ako aj v prítomnosti cudzie telesá v ústna dutina alebo hltanu, upchatie pažeráka.

imunita, špecifická profylaxia . Zvieratá očkované proti besnote produkujú vírus neutralizujúce, komplement fixujúce, precipitačné, antihemaglutinačné a lytické (ničiace bunky infikované vírusom v prítomnosti komplementu) protilátky. Mechanizmus postvakcinačnej imunity nie je definitívne rozlúštený. Predpokladá sa, že očkovanie spôsobuje biochemické zmeny, ktoré znižujú citlivosť nervových buniek na vírus. Podstata umelej imunizácie proti besnote sa redukuje na aktívnu produkciu protilátok, ktoré neutralizujú vírus v mieste jeho prieniku do tela pred vstupom do nervových elementov alebo pri nútenej imunizácii neutralizujú vírus na ceste do centrálneho nervového systému. systém. Aktivujú sa aj T-lymfocyty zodpovedné za produkciu interferónu. Preto je pri tomto ochorení možná postinfekčná vakcinácia: vakcinačný kmeň, prenikajúci do nervových buniek skôr ako terénny, spôsobuje, že produkujú interferón, ktorý inaktivuje divoký vírus besnoty, a protilátky, ktoré blokujú špecifické bunkové receptory.

AT veterinárna prax V súčasnosti sa používajú ako živé tkanivové, tak aj kultivované a inaktivované vakcíny proti besnote (vakcíny proti besnote) - až 84 odrôd vakcín proti besnote v 41 krajinách sveta.

Vakcíny proti besnote sú rozdelené do troch skupín: mozgové vakcíny, ktoré sú vyrobené z mozgového tkaniva zvierat infikovaných fixovaným vírusom besnoty; embryonálne, v ktorých zložkou obsahujúcou vírus je tkanivo kuracích a kačacích embryí; kultúrne vakcíny proti besnote vyrobené z vírusu besnoty reprodukovaného v primárnych trypsinizovaných alebo transplantovaných bunkách VNK-21/13.

V Ruskej federácii bola vyvinutá inaktivovaná vakcína proti besnote na báze kmeňa Schelkovo-51, reprodukovaná v bunkovej kultúre VNK-21, ktorá má vysokú imunizačnú aktivitu.
Na preventívne a nútené očkovanie hovädzieho dobytka a drobného dobytka, koní, ošípaných aplikovať tekutú kultúru ("Rabikov") vakcínu proti besnote.
Na preventívne očkovanie psov a mačiek aplikujte suchú kultúru inaktivovanú vakcínu proti besnote z kmeňa Schelkovo-51 ("Rabikan"). Bola vyvinutá univerzálna vakcína - pre hovädzí dobytok, kone, ovce, ošípané, psy, mačky.
Dovážané vakcíny sú široko zastúpené na ruský trh. Veterinári používajú proti besnote vakcíny Nobivak Rabies, Nobivak RL, Defensor-3, Rabizin, Rabigen Mono a iné.
Pre orálnu vakcináciu divých a túlavých zvierat boli vyvinuté vakcinačné metódy založené na tom, že zvieratá jedia rôzne návnady pomocou vakcín Lisvulpen, Sinrab a iných.V súčasnosti sa pracuje na vytvorení geneticky upravených (rekombinantných) vakcín.

Prevencia. V rámci prevencie besnoty sú psy evidované v populácii, kontrola dodržiavania pravidiel pre chov domácich zvierat, odchyt túlavé psy a mačiek, každoročné preventívne očkovanie psov a v nevyhnutné prípady a mačky. Neočkovaných psov je zakázané používať na lov a stráženie fariem a stád.
Zamestnanci lesného a poľovníckeho úradu sú povinní hlásiť podozrenie na besnotu u voľne žijúcich zvierat, odovzdať ich mŕtvoly na vyšetrenie a prijať opatrenia na zníženie počtu voľne žijúcich predátorov v znevýhodnených a besnotou ohrozených oblastiach. Prevencia besnoty u hospodárskych zvierat sa uskutočňuje ich ochranou pred predátormi, ako aj preventívnou vakcináciou v infikovaných oblastiach.
Predaj, kúpa, ako aj preprava psov do iných miest alebo regiónov je povolená len vtedy, ak existuje veterinárne osvedčenie s poznámkou, že pes bol očkovaný proti besnote nie viac ako 12 mesiacov a nie menej ako 30 dní pred vývozom.

Liečba besnoty. účinnými prostriedkami neexistuje žiadna terapia. Choré zvieratá sú okamžite izolované a usmrtené, pretože ich nadmerná expozícia je spojená s rizikom nakazenia ľudí.

Kontrolné opatrenia. Pri organizovaní opatrení na boj proti besnote treba rozlišovať medzi epizootickým ohniskom, znevýhodneným miestom a ohrozenou zónou.
Epizootické ohniská besnoty sú byty, obytné budovy, súkromné domácnosti občanov, stavby hospodárskych zvierat, sklady, letné tábory, pasienky, lesy a iné objekty, kde sa našli zvieratá s besnotou.
Nepriaznivým územím pre besnotu je sídlisko alebo časť veľkého sídla, samostatný chov hospodárskych zvierat, farma, pasienok, les, na území ktorého bolo zistené epizootické ohnisko besnoty.
Ohrozená zóna zahŕňa sídla, chovy hospodárskych zvierat, pasienky a iné územia, kde hrozí zavlečenie besnoty alebo aktivácia prirodzených ohnísk ochorenia.

Činnosti na eradikáciu besnoty sú znázornené na obrázku 4:

Opatrenia na ochranu ľudí pred infekciou besnotou. Osoby, ktoré sú neustále vystavené riziku nákazy (laboratórny personál pracujúci s vírusom besnoty, chovatelia psov a pod.), by mali byť profylakticky imunizované.

Všetci ľudia uhryznutí, poškriabaní, uslintaní akýmkoľvek zvieraťom, dokonca aj navonok zdraví, sú považovaní za podozrivých z infekcie besnotou.

Po kontakte možno rozvoju infekcie zabrániť včasným a vhodným ošetrením rany preventívna liečba obeť. Zranený by mal nejaký čas počkať, kým z rany nevytečie malá časť krvi. Potom sa odporúča ranu umyť veľkým množstvom vody a mydla, ošetriť alkoholom, tinktúrou príp vodný roztok jód a aplikujte obväz. Ranu dôkladne umyte, aby ste predišli ďalšiemu poškodeniu tkaniva. Miestne krytie rán je najvýhodnejšie, ak sa vykonáva bezprostredne po útoku zvieraťa (do 1 hodiny, ak je to možné). Obeť sa odošle na stanovište prvej pomoci a vykoná sa liečebná a profylaktická imunizácia gamaglobulínom proti besnote a vakcínou proti besnote. Osoby s besnotou sú hospitalizované.

Analýza na besnotu u psov zahŕňa vykonanie špeciálnych rýchlych testov na prítomnosť špecifických protilátok proti besnote v krvi. Niekedy sa používa v komplexnej diagnostike pri podozrení na infekciu domácich zvierat vírusom besnoty. Toto ochorenie predstavuje hrozbu pre život zvierat, ľudí, takže chovatelia psov by mali mať predstavu o tom, ako sa toto ochorenie prejavuje. Ak existuje podozrenie na infekciu, ak malo zviera kontakt s možným nosičom baktérií, mali by ste ho okamžite vziať na veterinárnu kliniku na laboratórnu diagnostiku, bez ktorej nie je možné stanoviť presnú diagnózu.

(besnota) je akútne ochorenie teplokrvných živočíchov infekčnej etiológie, spôsobené vírusom, ktorý postihuje centrálny nervový systém a spôsobuje vážne poruchy v organizme. bohužiaľ, účinnú liečbu nie je v súčasnosti vyvinutý, takže infekcia je vždy smrteľná.

Pôvodcom infekčného ochorenia je vírus obsahujúci RNA (rabdovírus). Ovplyvňuje domáce a voľne žijúce zvieratá. Existuje takzvaný "prirodzený" vírus a "laboratórium".

DÔLEŽITÉ! BESNICA JE ZOOANTROPOZOÓNNA CHOROBA, TAKŽE NÁKAZ SA PRENÁŠA NA ČLOVEKA. Ohniská sú VŠADE. OCHORENIE MÁ PRIRODZENÝ FOKÁLNY CHARAKTER.

Prirodzeným rezervoárom rabdovírusu sú infikované mäsožravé predátory. Smrteľný vírus sa nachádza v slinách infikovaných jedincov. Vyskytuje sa infekcia kontaktom, s uhryznutím, prenikaním slín do odrenín, rany na derme.

Po preniknutí do tela sa vírus okamžite pohybuje po nervových cestách do mozgu, miechy, slinných žliaz, kde sa následne množí.

V slinách infikovaných zvierat sa rabdovírus objaví približne tri až sedem dní pred objavením sa prvých príznakov. Infikovaný jedinec je zároveň už nosičom vírusu, ktorý predstavuje skutočnú hrozbu pre ľudí a iné domáce zvieratá. Preto sa infekcia besnotou môže vyskytnúť aj vtedy, ak vás alebo vášho domáceho maznáčika uhryzne zjavne zdravé zviera.

Formy, štádiá besnoty

Inkubačná doba trvá od 2-7 dní do niekoľkých týždňov. Intenzita prejavu symptómov závisí od veku, odolnosti, imunitnej obrany, virulencie a koncentrácie rabdovírusu v organizme. Smrteľné ochorenie u zvierat sa vyskytuje pokojne, násilne, menej často v atypických formách.

U psov je zaznamenaná prevažne násilná forma infekcie, ktorej trvanie je od šiestich do desiatich dní. Má tri štádiá prejavu:

prodromálny. Trvanie melancholického štádia nie je dlhšie ako dva dni. V tomto štádiu vývoja infekcie je zaznamenaná zmena v správaní psa. Zvieratá sú silne utláčané, vyzerajú depresívne, schovávajú sa na tmavých odľahlých miestach, neradi nadväzujú kontakt a neadekvátne reagujú na podnety.
Manic(štádium excitácie). Trvanie kurzu nie je dlhšie ako tri alebo štyri dni. Choré zvieratá prejavujú neprimeranú agresiu voči svojim kolegom, iným domácim miláčikom, ľuďom vrátane majiteľa. Agresiu nahrádza láskavé správanie. Domáce zviera vyžaduje pozornosť, olizuje ruky, tvár osoby. Choré domáce zvieratá jedia nejedlé predmety. Často psy utekajú z domu a dokážu neúnavne bežať 20-30 km.
Paralytický(depresívne). Toto štádium, ktoré netrvá dlhšie ako šesť dní, sa vyznačuje vážnymi poruchami vo fungovaní centrálneho nervového systému. Zaznamenáva sa paralýza hltana, hrtana, svalové kŕče, kŕče. Spodná čeľusť klesá. Neexistuje žiadny reflex prehĺtania. Z úst neustále tečú sliny. Hlasné zvuky, zvuk vody spôsobuje najsilnejšiu paniku. Koordinácia pohybu je narušená. Domáce zviera upadne do kómy, umiera na vyčerpanie, zhoršené dýchanie, srdcová funkcia.

Stojí za zmienku, že besný pes, bez ohľadu na formu a štádium choroby, uhryzne človeka bez varovania zvierat pred útokom štekaním.

Tichá, atypická forma

Tichá forma ochorenia je charakterizovaná absenciou štádia excitácie. Trvanie - od dvoch do piatich dní. Vyznačuje sa všeobecným útlakom, melanchóliou, nedostatočnou reakciou na vonkajšie podnety. Zvieratá umierajú v dôsledku paralýzy svalových štruktúr tela, hltana. Choroba vždy končí smrťou.

Menej často u psov je zaznamenaná atypická forma ochorenia, ktorá sa prejavuje atypickými, pre túto infekciu netypickými prejavmi. Prebieha akútne, subakútne, menej často chronicky (dva až tri mesiace). U zvierat sa zaznamenáva zmena správania, poruchy centrálneho nervového systému, gastrointestinálneho traktu.

Ak si všimnete netypické správanie vášho domáceho maznáčika, zmenu návykov, prejavy agresivity, a tiež ak sa pes dostal do kontaktu alebo ho pohrýzli bezdomovci, voľne žijúce zvieratá, určite ho musíte vziať na veterinárnu kliniku a skontrolovať psa na besnotu. . Nezabudnite, že príznaky sa spontánne zvyšujú v určitom poradí.

Diagnostické metódy

Pri stanovení predbežnej diagnózy je potrebné vziať do úvahy údaje o anamnéze, patologické anatomické výsledky, epizootologickú situáciu a symptómy. Vykonáva sa séria laboratórnych, histologických, mikroskopických, bakteriologických štúdií, expresných testov.

Vzhľadom na podobnosť symptómov s inými infekciami sa vykonáva diferenciálna diagnostika (ELISA, PCR). Je potrebné vylúčiť Aujeszkyho chorobu, psinku, encefalomyelitídu.

Dôležité! Ak je podozrenie na infekciu, zviera pohrýzol človeka, pes sa umiestni do špeciálnych izolovaných boxov a desať dní, kým nie sú pripravené výsledky testov, sa sleduje jeho stav. Ak sa diagnóza potvrdí, bohužiaľ, pristúpi k eutanázii. Zvieratá sú eutanázované, pretože na túto infekciu neexistuje žiadny liek.

Presnú diagnózu možno stanoviť až po smrti zvierat. Výsledný patologický materiál sa skúma rôznymi metódami.

Základné diagnostické štúdie

Najspoľahlivejšia metóda, ktorá ochorenie vždy potvrdí, je mikroskopické štúdie biomateriál na prítomnosť špecifických inklúzií v mozgu – telieska Babes-Negri. Nachádza sa v amonových rohoch.

Na detekciu špecifického antigénu v mozgu sa používa reakcia difúzna precipitácia, imunofluorescenčný rozbor odtlačku rohovky.

Imunofluorescenčná metóda umožňuje rýchlo diagnostikovať prítomnosť vírusu v tele psov. Metóda určuje vírusový antigén v 93-97% prípadov.

Krvný test na protilátky

Vzhľadom na to, že sa vírus pohybuje pozdĺž nervových kmeňov, je mimoriadne zriedkavé ho zistiť v krvnom obehu. Spravidla sa pri podozrení na infekciu vyšetruje cerebrospinálny mok na analýzu.

Sérologické štúdie spočívajú vo vykonaní všeobecného biochemického krvného testu. Zaznamenávajú sa zmeny vo vzorci leukocytov (leukocytóza), oligúria, albuminúria, glukozúria a zvýšenie koncentrácie monocytov.

Testovanie vášho domáceho maznáčika na besnotu, určenie intenzity postvakcinačnej imunity umožní test na prítomnosť špecifických protilátok proti besnote v krvi. Zadržané tento postup len v akreditovaných laboratóriách, niektorých veterinárnych ambulanciách. Treba poznamenať, že náklady na túto analýzu sú dosť vysoké. Výsledky po zákroku budú pripravené za 10-20 dní.

Dnes sa vykonávajú dva typy testov na protilátky proti besnote - RFFIT (rýchla inhibícia fluorescenčného fokusového testu) a FAVN - fluorescenčný vírus neutralizujúci protilátkový test, ktorý určuje titer protilátok v IU / ml. Tieto techniky sa vykonávajú na živých kultúrach bunkových štruktúr s pridaním infekčného agens do reakcie. U psov sa odoberie 0,5-1 ml krvného séra.

Test sa vykonáva hlavne vtedy, ak chcete vziať svojho miláčika do zahraničia. Mnohé krajiny EÚ zakazujú dovážať na svoje územie zvieratá, ktoré neboli očkované proti besnote, ako aj psy a mačky, ktoré nemajú výsledky tejto analýzy.

Keď sa v krvi psa vyvinú protilátky proti tejto infekcii, musíte urobiť test na protilátky. Špecifická imunita po imunizácii sa vytvára mesiac po očkovaní. Od tohto momentu môžete vziať svojho miláčika do laboratória na test na protilátky proti besnote. Okrem toho, ak je po očkovaní potrebný tento test, od dátumu očkovania by nemal uplynúť viac ako rok. Test je potrebné urobiť najneskôr mesiac pred termínom preočkovania.

Ak je titer protilátok proti besnote nižší ako 0,50 IU / ml, pes sa preočkuje. O mesiac neskôr sa vykoná opätovná analýza. Na tvorbu ochranných protilátok po imunizácii vplýva viacero faktorov: plemeno, vek, individuálne vlastnosti organizmu, frekvencia imunizácie proti besnote. Veterinári odporúčajú sledovať titer protilátok u psov a mačiek po očkovaní, aj keď neplánujete cestovať do zahraničia.

Mnohí majitelia berú svojich miláčikov na vidiek, do prírody, do lesa, na poľovačku. Nezabudnite, že psa môžu pohrýzť voľne žijúce zvieratá, ktoré môžu byť infikované alebo sú nosičmi vírusov.

Jediný spôsob, ako ochrániť svojho psa pred smrteľnou infekciou, je včasné očkovanie.

V budúcnosti, v závislosti od zvoleného lieku, sa preočkovanie vykonáva raz ročne. Niektoré vakcíny poskytujú imunitnú ochranu na obdobie troch rokov. Optimálnu schému očkovania, preočkovania vyberie veterinár.

MEDZIŠTÁTNA RADA PRE ŠTANDARDIZÁCIU. METROLÓGIA A CERTIFIKÁCIA

INTERSTATE

ŠTANDARDNÝ

ZVIERATÁ

Oficiálne vydanie

Štandardná forma

Predslov

Ciele, základné princípy a základný postup pri vykonávaní prác na medzištátnej normalizácii stanovuje GOST 1.0 - 92 „Medzištátny normalizačný systém. Základy ustanovení“ a GOST 1.2-2009 „Medzištátny štandardizačný systém. Medzištátne štandardy. pravidlá a odporúčania pre medzištátnu normalizáciu. Pravidlá vývoja. prijatie, žiadosť, obnovenie a zrušenie“

O štandarde

1 VYVINUTÉ Federálnou štátnou rozpočtovou inštitúciou „Celoruské štátne centrum pre kvalitu a štandardizáciu liekov pre zvieratá a krmivá“ (FGBU „VGNKI“)

2 ZAVEDENÉ Federálnou agentúrou pre technickú reguláciu a metrológiu Ruská federácia

3 PRIJATÉ Medzištátnou radou pre normalizáciu, metrológiu a certifikáciu (zápisnica z 27. júna 2013 č. 57-P)

Skrátený názov krajiny podľa MK (ISO 3166) 004-97	Kód krajiny nie MK (ISO 3166) 004-97	Skrátený názov národného normalizačného orgánu
		Ministerstvo hospodárstva Arménskej republiky
Bielorusko		Štátna norma Bieloruskej republiky
Kirgizsko		Kirgizsko štandard
		Moldavsko-štandard
		Gosstandart
Uzbekistan		Uzsgandart

4 Nariadením Federálnej agentúry pre technickú reguláciu a metrológiu z 30. septembra 2013 č. 1127-st bola od 1. januára 2015 uvedená do platnosti medzištátna norma GOST 26075-2013 ako národná norma Ruskej federácie.

5 MIESTO GOST 26075-54

Informácie o zmenách tohto štandardu sú zverejnené v každoročne vydávanom informačnom indexe „Národné štandardy“ a text zmien a doplnkov v mesačne zverejňovanom informačnom indexe „Národné štandardy“. V prípade revízie (nahradenia) alebo zrušenia tohto štandardu bude príslušné oznámenie uverejnené v mesačne zverejňovanom informačnom indexe „Národné štandardy“. Príslušné informácie, oznámenia a texty sú zverejnené aj vo verejnom informačnom systéme - na oficiálnej webovej stránke Federálnej agentúry pre technickú reguláciu a metrológiu na internete

V Ruskej federácii nie je možné túto normu úplne alebo čiastočne reprodukovať. replikované a distribuované ako oficiálna publikácia bez povolenia Federálnej agentúry pre technickú reguláciu a metrológiu

MEDZIŠTÁTNY ŠTANDARD

ZVIERATÁ

Metódy laboratórnej diagnostiky besnoty

Dátum predstavenia - 2015 - 01 - 01

1 oblasť použitia

Táto norma sa vzťahuje na všetky druhy cicavcov a stanovuje nasledujúce metódy laboratórnej diagnostiky besnoty:

Metóda fluorescenčných protilátok (MFA);

Spôsob izolácie vírusu besnoty v bunkovej kultúre myšieho neuroblastómu CCL-131 (alebo neurinómu Gasserovho uzla potkana - NGUK-1);

Biologický test na bielych myšiach:

Metóda enzýmovej imunoanalýzy (ELISA);

Difúzna precipitačná reakcia (RDP).

Poznámky

1 Tieto metódy sú použiteľné pre všetkých členov rodu Lyssavwus.

2 Vírus pouličnej besnoty patrí medzi mikroorganizmy 2. triedy patogenity (predstavuje smrteľné nebezpečenstvo pre ľudí a zvieratá).

3 V prípade potreby genotypizácia vírusu besnoty pomocou hotového testovacích systémov používa sa metóda polymerázovej reťazovej reakcie s reverznou transkriptázou (RT-PCR).

2 Normatívne odkazy

Táto norma používa normatívne odkazy na nasledujúce normy:

GOST ISO/IEC 17025 - 2009 Všeobecné požiadavky na spôsobilosť skúšobných a kalibračných laboratórií

GOST 12.0.004 - 90 Systém noriem bezpečnosti práce. Organizácia školení bezpečnosti práce. Všeobecné ustanovenia

GOST 12.1.005-68 Systém noriem bezpečnosti práce. Všeobecné hygienické a hygienické požiadavky na vzduch v pracovnom priestore

GOST 12.1.008 - 76 Systém noriem bezpečnosti práce. biologická bezpečnosť. Všeobecné požiadavky

GOST 12.4.011 - 89 Systém noriem bezpečnosti práce. Prostriedky ochrany pracovníkov. Všeobecné požiadavky a klasifikácia

GOST 17.0.0.01 - 76 Systém noriem v oblasti ochrany prírody a zlepšovania využívania prírodných zdrojov. Kľúčové body

GOST 177-88 Peroxid vodíka. technické údaje GOST 2603 - 79 Činidlá. Acetón. Špecifikácie GOST 2768 - 84 Technický acetón. Špecifikácie GOST 4204 - 77 Činidlá. Kyselina sírová. Špecifikácie GOST 6709 - 72 Destilovaná voda. Technické údaje.

GOST ISO 7218 - 2011 Mikrobiológia produkty na jedenie a krmivo pre zvieratá. Všeobecné požiadavky a odporúčania pre mikrobiologické štúdie

GOST 8074 - 82 Prístrojové mikroskopy. Typy, základné parametre a veľkosti. Technické požiadavky.

GOST 9147 - 80 Laboratórne porcelánové sklo a vybavenie. Špecifikácie GOST 9284-75 Mikroskopické sklíčka. Špecifikácie GOST 12026 - 76 Laboratórny filtračný papier. Špecifikácie GOST 13739-78 Imerzný olej pre mikroskopiu. Technické požiadavky. Testovacie metódy

GOST 16317-87 Elektrické chladiace spotrebiče pre domácnosť. Všeobecné špecifikácie

GOST 21241-69 Lekárska pinzeta. Všeobecné špecifikácie.

GOST 22967 - 90 Lekárske injekčné striekačky na viacnásobné použitie. Všeobecné technické požiadavky a skúšobné metódy

GOST 24661 - 91 (ISO 7866 84) Injekčné striekačky na jedno použitie

GOST 25046 - 81 (ISO 7864-81) Jednorazové injekčné ihly. Hlavné rozmery. Technické požiadavky. Testovacie metódy

GOST 25336 - 82 Laboratórne sklo a vybavenie. Typy, základné parametre a rozmery

GOST 29230 - 91 (ISO 835-4-81) Laboratórne sklo. Pipety absolvovali. Časť 4. Fúkacie pipety

Poznámka - Pri používaní tejto normy je vhodné skontrolovať platnosť referenčných noriem vo verejnom informačnom systéme - na oficiálnej stránke Federálnej agentúry pre technickú reguláciu a metrológiu na internete alebo podľa ročného informačného indexu "Národné normy" , ktorý bol zverejnený k 1. januáru bežného roka a lo vydaniach mesačného informačného indexu „Národné štandardy“ za aktuálny rok. Ak je referenčná norma nahradená (upravená), pri používaní tejto normy by ste sa mali riadiť nahradzujúcou (upravenou) normou. Ak je norma, na ktorú sa odkazuje, zrušená bez náhrady, platí ustanovenie, v ktorom je uvedený odkaz na ňu, v rozsahu, v akom to nie je dotknuté.

3 Pojmy, definície a skratky

3.1 V tomto štandarde sa používajú nasledujúce pojmy s ich príslušnými definíciami:

3.1.1 besnota infekčná choroba ľudí a zvierat spôsobená členmi čeľade Rhabdoviridae rodu Lyssavirus (rhabdovírus), ktorá má za následok smrteľný výsledok v 100% prípadov.

3.1.2 Vírus besnoty: Pôvodca infekčného ochorenia u ľudí a zvierat.

3.1.3 Štruktúry povrchových proteínov vírusu besnoty antigénu vírusu besnoty, proti ktorým sa vytvárajú protilátky.

3.1.2 fluorescenčná protilátková metóda (MFA): Metóda detekcie antigénu vírusu besnoty protilátkami proti besnote značenými fluoresceín eotiokyanátom s tvorbou charakteristických svetelných inklúznych komplexov, ktoré sa detegujú v zornom poli fluorescenčného mikroskopu. .

3.1.3 metóda izolácie vírusu besnoty v bunkovej kultúre myšieho neuroblastómu CCL-131 (alebo neurinómu Gasserovho ganglia potkana - NGUK-1): Metóda izolácie antigénu vírusu besnoty. na základe rozmnožovania vírusu v bunkovej kultúre a jeho identifikácie metódou fluorescenčných protilátok.

3.1.3 biotest: Metóda izolácie vírusu besnoty u bielych myší injekciou suspenzie patologického materiálu, po ktorej nasleduje identifikácia vírusu metódou fluorescenčných protilátok.

3.1.4 enzýmová imunoanalýza (ELISA) metóda na detekciu antigénu vírusu besnoty na základe jeho špecifickej interakcie s protilátkou proti besnote imobilizovanej na pevnom podklade, po ktorej nasleduje detekcia naviazaného antigénu pomocou druhej enzýmom značenej protilátky farbením reakčného produktu chromogénom.

3.1.5 difúzny precipitačný test (RDP): Metóda na detekciu vírusu besnoty založená na schopnosti protilátok a vírusového antigénu besnoty difundovať v agarovom géli a po špecifickej interakcii vytvárať komplex antigén-protilátka viditeľný aj nahom. oko ako zrážková línia.

3.1.6 metóda polymerázovej reťazovej reakcie s reverznou transkriptázou (RT-PCR) na detekciu genómu vírusu besnoty transláciou špecifickej RNA sekvencie vírusu do DNA, po ktorej nasleduje opakované kopírovanie výslednej DNA a detekcia reakčných produktov vykonaná in vitro .

3.2 V tejto norme sa používajú nasledujúce skratky:

FAG - fluorescenčný imunoglobulín proti besnote;

ANG - globulín proti besnote;

CFG - kontrolný fluorescenčný globulín;

PBS - roztok fosfátového pufra;

NGUK-1-neurinóm Gasserov uzol potkana;

FITC - fluoresceín izotiocinát:

RNA - ribonukleová kyselina:

DNA - kyselina deoxyribonukleová:

CCN31 - bunková kultúra myšieho neuroblastómu:

OFD - ortofenyldiamín;

TMB - tetrametylbenzidín.

4 Podmienky výskumu a bezpečnostné požiadavky

4.1 Podmienky výskumu

4.1.1 Všeobecné požiadavky na mikrobiologické analýzy a prácu s mikroorganizmami I-II skupiny patogenity - podľa GOST ISO 7218.

4.1.2 Všeobecné požiadavky na priestory - podľa GOST ISO 7218.

4.1.3 Požiadavky na personál - podľa GOST ISO 7218, GOST ISO / IEC 17025. (1).

Výskum môžu vykonávať kvalifikovaní zamestnanci so skúsenosťami s prácou s mikroorganizmami I-II skupín patogenity, ktorí študovali metódy mikrobiologickej práce. očkované proti besnote.

4.2 Bezpečnostné požiadavky

4.2.1 Všeobecné bezpečnostné požiadavky na prácu v súlade s GOST 12.1.008.

4.2.2 Ochranné prostriedky pre pracovníkov musia spĺňať požiadavky GOST 12.4.011.

4.2.3 Vzduch v pracovnom priestore musí spĺňať požiadavky GOST 12.1.005.

4.2.4 Školenie personálu bezpečnosti práce v súlade s GOST 12.0.004.

4.2.5 Likvidácia materiálu získaného na štúdium, ako aj použitých osobných ochranných pracovných prostriedkov, nástrojov a pod. uskutočnené varom počas 30 minút alebo autoklávovaním počas 15 minút pri tlaku (0,11 ± 0,20) MPa.

5 Meracie prístroje, zariadenia, materiály, činidlá a zvieratá

5.1 Na výskumné použitie:

Skenovací spektrofotometer so spektrálnym rozsahom vlnových dĺžok od 190 do 1100 nm s chybou najviac ± 0,5 nm a rozsahom meraní optickej hustoty (OD) od 0,1 do 3,0;

Doštičky na imunologické reakcie 96-jamkové:

Termostat, ktorý udržuje teplotu od 20"-C do 50°C:

Chladnička pre domácnosť, ktorá zabezpečuje udržiavanie teploty od 0 ° C do 10 ° C podľa GOST 16317:

laboratórna odstredivka;

vodný kúpeľ;

Invertovaný luminiscenčný mikroskop podľa GOST 8074:

Porcelánové mažiare s tĺčikom podľa GOST 9147 alebo homogenizátor podľa GOST ISO/IEC 17025;

Sklíčka podľa GOST 9284:

Sklenené skúmavky podľa GOST 25336;

Petriho misky podľa GOST 25336;

Kyveta podľa GOST 25336;

Pipety s kapacitou 1,0; 2,0 a 10,0 cm 3 podľa GOST 29230;

Automatické pipety s objemom 0,05 až 0,20 cm 3 s hrotmi:

Lekárska pinzeta podľa GOST 21241:

Inzulínové striekačky s objemom 1,0 cm 3 podľa GOST 22967 alebo GOST 24861;

Injekčné ihly podľa GOST 25046:

Kultúrne poháre pre osem otvorov;

Klietky na držanie myší;

Acetón podľa GOST 2603 alebo GOST 2768;

Fluorescenčný imunoglobulín proti besnote (FAG);

globulín proti besnote (AnG);

kontrolný fluorescenčný globulín (CFG);

Nefluorescenčný imerzný olej podľa GOST 13739;

Destilovaná voda podľa GOST 6709;

Fosfátový tlmivý roztok s molárnou koncentráciou 0,01 mol/dm 3 (PBS). pH 7,2 - 7,4;

- sterilný roztok chloridu sodného 0,9% izotonický:

Bunková kultúra myšieho neuroblastómu CC31 alebo neerynómu Gasserovho uzla potkana -

penicilín;

streptomycín;

Medium Needle MEM s dvojitým súborom aminokyselín a vitamínov (DMEM), pH 7,2;

roztok trypsínu 0,25 %;

Sérum embryonálnej krvi hovädzieho dobytka na bunkové kultúry 10 %;

Glutamín 3%;

Peroxid vodíka 3% podľa GOST 177;

Sada prípravkov na laboratórnu diagnostiku besnoty zvierat metódou ELISA;

Roztok kyseliny sírovej s molárnou koncentráciou 2 mol / dm 3 podľa GOST 4204;

Filtračný papier podľa GOST 12026;

Pečiatka na výrobu studní;

merthiolát;

Agar "Difko" alebo podobný;

Roztok metyloranže 1% v 50% etylalkohol:

Pozitívne a negatívne antigény;

sérum alebo imunoglobulín proti besnote;

Klinicky zdravé biele myši s hmotnosťou 6-8 g.

5.2 Je dovolené používať iné meradlá s metrologickými charakteristikami a vybavením Technické špecifikácie nie horšie, rovnako ako reagencie a materiály v kvalite nie nižšej ako tie, ktoré sú uvedené vyššie. Jednorazový riad je povolený.

6 Odber vzoriek

6.1 Na uskutočnenie výskumu prítomnosti vírusu besnoty sa do laboratória posiela patologický materiál – čerstvá mŕtvola alebo hlava malých zvierat, hlava alebo mozog veľkých zvierat.

6.2 Patologický materiál vybraný na výskum je zabalený v obale odolnom voči vlhkosti a dodaný do laboratória v kovových obaloch. Zmrazený materiál sa umiestni do kryonádoby.

6.3 K patologickému materiálu je priložený dokument obsahujúci nasledovné údaje; meno a adresa odosielateľa, druh zvieraťa, anamnestické a klinické a eliootologické údaje.

6.4 Laboratórne štúdie sa vykonávajú ihneď po prijatí patologického materiálu.

6.5 Na výskum sa odoberú kusy tkaniva z veľkých zvierat z každej časti mozgu (Ammonove rohy, mozoček, mozgová kôra, dreň) 0,5 - 1,0 cm veľký Mozog malých zvierat, napríklad myší, sa skúma ako celok.

Na štúdium MFA a metódy izolácie vírusu besnoty v bunkovej kultúre myšieho neuroblastómu CCL-131 (alebo NGUK-1) sú vhodné iba čerstvé alebo čerstvo zmrazené vzorky mozgového tkaniva. Vzorky zvieracieho mozgu, ktoré sa rozkladajú (v štádiu rozkladu), konzervujú glycerolom, fixujú metylalkoholom, formalínom alebo inými prostriedkami, ktoré podporujú výskyt nešpecifickej fluorescencie, nie sú povolené na výskum.

Na prípravu biologického testu je dovolené použiť vzorky mozgu konzervované v 30% -50% * glycerolovom roztoku. Použitie iných konzervačných látok nie je povolené. Na konzerváciu je možné patologický materiál zmraziť pri teplote nepresahujúcej mínus 10 °C.

7 Fluorescenčná protilátková metóda (MFA)

7.1 Podstata metódy

Podstata metódy fluorescenčných protilátok spočíva v špecifickej interakcii fluorescenčných protilátok proti besnote s homológnym antigénom vírusu besnoty. Výsledný komplex antigén-protilátka označený FITC. sa deteguje vizuálne charakteristickou žiarou v zornom poli pri pohľade pod fluorescenčným mikroskopom.

7.2 Príprava na štúdium

7.2.1 Príprava vzorky

7.2.1.1 Z kúskov tkaniva vybraných podľa 6.5 sa na starostlivo odtučnených podložných sklíčkach pripravia najmenej tri preparáty (odtlačky alebo stery) z každej časti mozgu. Ak to stav patologického materiálu umožňuje, potom sa pripravia výtlačky, v iných prípadoch sa urobia šmuhy.

7.2.1.2 Príprava výtlačkov

Kusy látky vybrané podľa 6.5. položte na filtračný papier zložený v štyroch až šiestich vrstvách. Mozog malých zvierat sa rozreže, zachytí sa všetky jeho oddelenia a položí sa reznou stranou nahor na filtračný papier zložený v štyroch až šiestich vrstvách. Rezanej plochy sa dotýkame podložným sklíčkom a mierne ho pritláčame, kým sa na skle nezíska tenký odtlačok.

7.2.1.3 Príprava náterov

Kúsok tkaniva z každej časti mozgu (u malých zvierat celý mozog), vybraný podľa 6.5. trením v porcelánovej mažiari paličkou, kým nevznikne homogénna hmota, z ktorej sa robia šmuhy na podložné sklíčka.

7.2.1.4 Ako kontrola sa robia výtery alebo odtlačky z mozgu zdravých bielych myší bez besnoty a nevakcinovaných, ako je opísané v 7.3.1.2 a 7.3.1.3.

7.2.1.5 Po príprave sa nátery alebo výtlačky sušia na vzduchu 20 – 30 minút. fixovaný vo vychladenom acetóne pri teplote 4'C po dobu 4 - 12 hodín alebo pri teplote mínus 20*C po dobu 1 hodiny, potom sa vyberie z acetónu a suší sa na vzduchu po dobu 10 - 15 mesiacov.

7.2.2 Príprava činidiel

FAG. Ang a KFG sa rozpustia v destilovanej vode na počiatočný objem uvedený na štítku ampulky. Čas použiteľnosti rozpustených FA. AnH a CFG pri teplote (5 ± 2) C - nie viac ako dva týždne.

Priamo na štúdium potrebné množstvo rozpusteného FAG. AnG a KFG sa zriedia FBI na pracovné riedenie uvedené na štítku ampulky. Pracovné riedenia rozpustených FAG. Ang a CFG sa používajú v deň prípravy.

7.3 Vedenie štúdie

Podložné sklíčka s prípravkami (šmuhy alebo odtlačky) podľa 7.2.1 sa umiestnia do vlhkej komory (Petriho misky alebo kyvety s navlhčeným dnom). Potom sa jeden z troch pripravených prípravkov nanesie pomocou pipety FAG v pracovnom riedení rovnomerne po celej ploche náteru alebo odtlačku. Pracovné riedenie KFG sa aplikuje na druhý prípravok. Zatvorte komoru s drogami. umiestnite do termostatu pri teplote (37 ± 1) * C a udržujte 30

min. Kontrolné prípravky sa farbia paralelne. Na konci farbenia sa prípravky trikrát premyjú, pričom sa vždy ponoria na 10 minút do nádoby s PBS. opláchnite destilovanou vodou a vysušte na vzduchu 20-30 minút.

Pracovné riedenie Ang sa aplikuje na tretí prípravok. umiestnili do termostatu pri teplote (37 ± 1) * C a inkubovali 30 minút. Potom sa prípravok trikrát premyje, pričom sa zakaždým ponorí na 10 minút do nádoby s PBS. opláchnutý destilovanou vodou, sušený na vzduchu 20 - 30 min a zafarbený pracovným riedením FAG. ako je opísané vyššie.

7.4 Spracovanie výsledkov

V zafarbených preparátoch slabo žiari mozgové tkanivo, ktoré nie je napadnuté vírusom besnoty. sivožltá.

Antigén vírusu besnoty sa deteguje v neurónoch a vonkajších bunkách vo forme jasne zelených granúl rôznych tvarov a veľkostí - od sotva viditeľných až po priemer 15-20 mikrónov. Niekedy sa vyskytuje veľké množstvo malých svetlozelených častíc (do veľkosti 1 mikrónu) okrúhleho a oválneho tvaru.

Diagnóza besnoty sa považuje za stanovenú, ak sa v skúmanom prípravku nachádzajú typické žltozelené granuly vo viacerých zorných poliach mikroskopu. Súčasne v kontrolných prípravkoch (v náteroch alebo odtlačkoch z mozgu zdravých bielych myší bez besnoty, farbených FAG), ako aj v skúmaných prípravkoch, farbených CFG a vopred ošetrených AnG a farbených FAG. takéto formácie by nemali existovať.

Výsledky štúdie sa oznamujú príslušným orgánom v súlade s postupom platným na území štátu, ktorý normu prijal.

V prípade negatívneho výsledku sa štúdie vykonávajú 8. alebo 9.

8 Spôsob izolácie vírusu besnoty v bunkovej kultúre myšieho neuroblastómu CCL-131

8.1 Podstata metódy

Podstata metódy spočíva v izolácii vírusu besnoty v bunkovej kultúre myší.

neuroblastómu CCL-131 alebo NGUK-1 s jeho následnou identifikáciou metódou fluorescenčných protilátok.

Metóda je alternatívou k biologickému testu na bielych myšiach podľa 9.

8.2 Príprava na štúdium

8.2.1 Príprava vzorky

Rovnaké časti tkaniva sterilne odobraté z každej časti mozgu malého zvieraťa (Ammonove rohy, mozoček, mozgová kôra, predĺžená miecha) alebo kúsky tkaniva z každej časti mozgu veľkého zvieraťa, odobraté podľa 6.5. rozdrví sa nožnicami a rozomelie v mažiari alebo homogenizéri, pričom sa postupne pridáva sterilný 0,9 % izotonický roztok chloridu sodného, kým sa nezíska 10 % suspenzia. Penicilín a streptomycín sa pridajú do mozgovej suspenzie podľa US jednotiek/cm3 a 1 mg/cm3, v danom poradí.

Výsledná suspenzia sa dôkladne premieša a odstreďuje 5 až 10 minút pri rýchlosti 2000 otáčok za minútu. Vyššie uvedená sedimentárna kvapalina sa prenesie do sterilnej skúmavky a až do použitia sa skladuje pri teplote nepresahujúcej 4 °C.

8.2.2 Príprava kultivačných preparátov

Denná kultúra myších neuroblastómových buniek CCL-131 (alebo NGUK-1) sa odstráni z kultivačnej banky pomocou 0,25% roztoku trypsínu a zriedi sa médiom DMEM s 10% fetálnym hovädzím sérom a 3% glutamínom na koncentráciu 2 x 10 s buniek. /cm3. 0,1 cm 3 výslednej bunkovej suspenzie sa pridá do kultivačných sklenených jamiek, zakryje sa viečkom a umiestni sa do vlhkého CO g-inkubátora s obsahom CO 5% pri teplote (37 ± 1) ° C na 18- 20 hodín

8.3 Vedenie štúdie

0,05 cm 3 suspenzie z každej časti mozgu sa pridá do dvoch jamiek kultivačného skla podľa 8.2.2. Na každom sklíčku sú ponechané dve jamky pre pozitívnu a negatívnu kontrolu. Ako pozitívna kontrola sa použije suspenzia mozgu myši infikovanej vírusom besnoty - kmeň CVS. Ako negatívna kontrola sa zavedie suspenzia mozgu klinicky zdravej myši. Kultivačné sklo sa umiestni do vlhkého CO2 inkubátora s obsahom CO2 5 % pri teplote (37 ± 1) *C na 42–48 hodín.

Na konci inkubácie sa médium odstráni z jamiek kultivačného pohára pomocou automatickej pipety, bunky sa raz premyjú PBS (pomocou automatickej pipety sa do každej jamky pridá 0,2 cm3 roztok) a vysušia sa v laminárne prúdenie vzduchu 20 - 30 min. Potom sa do každej jamky pridá 0,1 cm3 acetónu ochladeného na teplotu mínus 20 °C a nechá sa 30 minút pri teplote miestnosti.

Po fixácii buniek sa kultivačné sklo prevráti a pretrepe, aby sa odstránil acetón, a potom sa suší v laminárnom prúde vzduchu počas 20–30 minút. Pomocou skalpela a pinzety odstráňte plastovú trysku a sušte sklo ďalších 5-10 minút. Do každej jamky sa pridá 0,05 - 0,10 cm3 FAG v pracovnom riedení (empiricky vybratom) pripravenom v FBI. umiestnili do mokrej Petriho misky a inkubovali pri (37 ± 1) C počas 30 minút.

Na konci farbenia sa sklíčka trikrát premyjú, pričom sa zakaždým ponoria na 10 minút do nádoby s PBS. Potom sa prípravky opláchnu destilovanou vodou a sušia sa na vzduchu 20-30 minút.

Nefluorescenčný imerzný olej sa aplikuje na farbené prípravky a prezerá sa pod fluorescenčným mikroskopom.

8.4 Spracovanie výsledkov

V zafarbených preparátoch slabo žiari bunková kultúra, ktorá nie je ovplyvnená vírusom besnoty. sivožltá farba (negatívna kontrola). Antigén vírusu besnoty sa deteguje v cytoplazme bunkovej kultúry vo forme svetlozelených granúl rôznych tvarov a veľkostí s jasne definovanými okrajmi (pozitívna kontrola).

Diagnóza besnoty sa považuje za stanovenú, ak sa v testovanom prípravku nachádzajú typické žltozelené granuly vo viacerých zorných poliach mikroskopu.

Ak sa vírus besnoty v bunkovej kultúre nezistí, potom sa stanoví negatívna diagnóza.

Výsledky izolácie vírusu besnoty v bunkovej kultúre sú konečné, ďalšie štúdie sa nevykonávajú.

9 Bistlerob na bielych myšiach

9.1 Podstata metódy

Podstata metódy spočíva v izolácii vírusu besnoty intracerebrálnou injekciou patologického materiálu do bielych myší s následnou identifikáciou vírusu metódou fluorescenčných protilátok podľa 7.

9.2 Príprava vzoriek na vyšetrenie - podľa 6.2.1.

9.3 Vedenie štúdie

Päť až šesť bielych myší sa infikuje 10 % suspenziou patologického materiálu im-tracerebrálne v objeme 0,02 až 0,03 cm3. Infikované myši sa umiestnia do samostatnej klietky, na ktorej je pripevnený štítok s uvedením dátumu infekcie, počtu myší, spôsobu infekcie a čísla vyšetrenia patologického materiálu. Zvieratá sa pozorujú najmenej 30 dní. Do denníka sa zaznamenáva počet zdravých, chorých a mŕtvych myší.

9.4 Spracovanie výsledkov

Pri hodnotení výsledkov sa berie do úvahy prítomnosť klinických príznakov u infikovaných myší (naježená srsť, príjem potravy, zhoršená koordinácia pohybu, ochrnutie, triaška, vyčerpanie). Smrť myší v prvých dvoch dňoch po infekcii sa neberie do úvahy. Vzorky mozgu chorých a mŕtvych zvierat počnúc tretím dňom vyšetruje MZV do 7.

Biotest sa považuje za pozitívny, ak počnúc tretím dňom po infekcii aspoň jedna myš ochorela a uhynula a vo vzorke mozgu boli pomocou MFA detegované špecifické inklúzie vírusu besnoty.

Negatívna diagnóza môže byť stanovená až po 30 dňoch pozorovania za predpokladu, že všetky infikované zvieratá zostanú živé a zdravé.

Výsledky biotestu sa považujú za konečné, ďalší výskum sa nevykonáva.

10 Enzýmová imunoanalytická metóda (ELISA)

10.1 Podstata metódy

8 ELISA je založená na špecifickej interakcii antigénu vírusu besnoty s antihéliom. imobilizovaný na pevnom nosiči. Naviazaný antigén sa deteguje pomocou druhej protilátky proti besnote značenej peroxidázou. ktorého reakčný produkt sa zafarbí po pridaní chromogénu. Intenzita zafarbenia reakčného produktu je priamo úmerná množstvu antigénu.

10.2 Príprava na štúdium

10.2.1 Ako testovací materiál (antigén) sa používajú vzorky mozgového tkaniva mŕtvych, násilne usmrtených zvierat, zvierat podozrivých z choroby besnoty alebo experimentálne infikovaných vírusom besnoty.

10.2.2 Príprava testovacieho antigénu

Vzorky mozgového tkaniva získané podľa 6.5 sa rozdrvia, rozomelú v mažiari a pripraví sa 10 % * suspenzia v C,9 % izotonickom roztoku chloridu sodného, zahrieva sa vo vodnom kúpeli pri teplote 60 * C počas 15 minút a odstredí sa 5-10 minút pri 2000 ot./min. Ako testovací antigén sa použije supernatant.

10.2.3 Príprava činidiel

všetky roztoky a činidlá pred nastavením reakcie sa musia uchovávať najmenej 30 minút pri teplote (22 ± 1) * C.

Príprava komponentov súpravy sa vykonáva podľa návodu na použitie.

10.3 Vedenie štúdie

10.3.1 ELISA sa vykonáva v sendvičovej verzii s použitím komponentov zahrnutých v súprave na detekciu antigénu patogénu besnoty v patologickom materiáli.

Na ELISA sa používajú platne na imunologické reakcie s plochým dnom.

Objem zložiek zavádzaných postupne do jamiek tablety je rovnaký a je

10.3.2 Senzibilizácia platničky

6 jamiek polystyrénovej platne sa naplní ANG v pracovnom riedení uvedenom na štítku. Platňa s ANG sa prikryje viečkom a inkubuje sa v termostate pri teplote (37 ± 0,5) *C počas 3 hodín alebo pri teplote 4 *C počas 18 hodín.Po inkubácii sa jamky platne premyjú trikrát premývacím tlmivým roztokom. Pri každom premytí vytraste obsah jamiek. a zvyšný roztok sa odstráni poklepaním na filtračný papier.

10.3.3 Aplikácia antigénov

Do 8 radov platne A. 8 a C sa pridá premývací pufor. Kontrolné pozitívne (jamka A1) a negatívne (jamka A2) antigény zahrnuté v súprave, ako aj testované vzorky (jamky AZ, A4 atď.) sa vložia do jamiek tablety a titrujú sa vertikálne, čím sa získajú riedenia od 1 : 2 až 1: 8. Pri veľkom počte vzoriek vyplňte ďalšie riadky tablety. Platnička sa prikryje viečkom a inkubuje sa v termostate pri teplote (37 ± 0,5) *C po dobu 1 hodiny Na konci inkubácie sa jamky platne trikrát premyjú od antigénov neviazaných na imunoglobulín, ako je popísané v 10.3.2.

10.3.4 Aplikácia konjugátu leroxidázy besnoty

Pracovné riedenie konjugátu peroxidázy proti besnote sa zavedie do jamiek platne, potom sa prikryje viečkom a inkubuje sa v termostate pri teplote (37 ± 0,5) C počas 1 hodiny. platňa sa trikrát premyje, ako je opísané v 10.3.2.

10.3.5 Nanášanie substrátovej zmesi

Na prejavenie reakcie sa pripravená zmes substrátu pridá do jamiek tablety. Reakcia sa zobrazuje počas 15 - 30 minút pri teplote (22 ± 0,5)*C v tme. Reakcia sa zastaví pridaním roztoku kyseliny sírovej s molárnou koncentráciou 2 mol/DM3.

10.4 Spracovanie výsledkov

Počítanie reakcie sa vykonáva vizuálne alebo na skenovacom spektrofotometri v súlade s návodom na použitie súpravy.

Ak sa OPD používa ako chromogén v substrátovej zmesi. potom sa vykoná meranie optickej hustoty pri 490 nm. ak používate TMB. potom na 450 km.

Reakcia sa počíta len vtedy, ak nie je žiadne špecifické zafarbenie v jamkách s kontrolným negatívnym antigénom, keď je intenzívne zafarbenie v jamkách s kontrolným pozitívnym antigénom. Pri vizuálnom počítaní sa vzorka považuje za pozitívnu, ak aspoň jedno (prvé) riedenie vykazuje špecifické zafarbenie.

Pri spektrofotometrickom zohľadnení výsledku ELISA sa vykoná výpočet koeficientu špecificity Ksp. ktorá sa rovná pomeru optickej hustoty (OD) reakčného produktu v jamkách s kontrolným pozitívnym antigénom alebo testovacím materiálom (OD) k optickej hustote substrátovej zmesi v jamkách s kontrolným negatívnym antigénom (OD) . Reakcia sa považuje za pozitívnu. ak je koeficient špecifickosti vyšší ako 2,1 a negatívny, ak je nižší ako 2,1.

OP1 * 0,641, OPg a 0,120, Ksp \u003d 5,34 - reakcia je pozitívna alebo OP1 \u003d 0,180, OPg pri 0,120 K s „ * 1,5 - reakcia je negatívna.

V prípade pozitívnej reakcie sa diagnóza považuje za stanovenú. Negatívny výsledok musí byť potvrdený inými metódami podľa 7 - 9.

11 Difúzna precipitačná reakcia (RDP)

11.1 Podstata metódy

Podstata metódy RDP spočíva v schopnosti protilátok a vírusového antigénu difundovať v agarovom géli a po špecifickej interakcii vytvárať komplex antigén-protilátka, ktorý je viditeľný voľným okom vo forme precipitačnej čiary.

11.2 Príprava na skúšku

11.2.1 Príprava vzorky

Príprava vzoriek na výskum - podľa 8.2.1.

Zastarané vzorky mozgu zvierat kontaminované bakteriálnou mikroflórou sú povolené na výskum.

11.2.2 Príprava agaru

Na prípravu agaru zmiešajte 1,5 g agaru Difko. 1 cm 3 1 % roztoku metyl oranžovej v 50 % etanole. 0,01 g mertiolátu. 100 cm3 izotonického roztoku chloridu sodného. Výsledná zmes sa varí, kým sa agar úplne neroztopí, naleje sa do skúmaviek, autoklávuje sa pri tlaku 0,5 atm počas 30 minút a uchováva sa v chladničke pri teplote 4 °C.

11.2.3 Príprava podložných sklíčok (Petriho misiek)

Reakcia sa umiestni buď na podložné sklíčka alebo na Petriho misky. Kvapka roztaveného agaru sa nanesie na odtučnené sklo, rovnomerne sa rozloží po skle a nechá sa 20-30 minút pri izbovej teplote, aby agar stuhol. Potom sa na sklo nanesie 2,5 cm 3 roztaveného agaru, čím sa vytvorí vrstva hrubá asi 2 mm. a nechajte 20-30 minút. Otvory sa robia v zamrznutej vrstve agaru pomocou špeciálneho razidla alebo kovovej tenkostennej trubice s priemerom 4–5 mm. Agarové stĺpce sa opatrne odstránia, bez poškodenia alebo umožnenia odlúpnutia tenkej vrstvy agarového gélu zo skla pomocou očnej pinzety alebo iného nástroja.

Petriho misky sa pripravujú podobne, pričom sa do nich pridá 10 - 15 cm 3 roztaveného agaru, aby sa získala vrstva hrubá 2-3 mm.

11.3 Vedenie štúdie

Bezprostredne pred nastavením reakcie sa pripravia riedenia séra proti besnote (imunoglobulínu), na ktoré sa do štyroch skúmaviek pridá 1,0 cm3 izotonického roztoku chloridu sodného. Pridajte 1,0 cm 3 séra proti besnote do prvej skúmavky, čím získate riedenie 1:2.

premiešajte a preneste 1,0 cm3 zmesi do druhej skúmavky atď. Takto sa získajú štyri skúmavky s riedením 1:2,1:4,1:8 a 1:16.

8 pripravených jamiek prispieva 0,05 - 0,07 cm3 vzorky mozgu (každá vzorka do samostatnej jamky), získanej podľa 8.2.1. a riedenia séra alebo imunoglobulínu proti besnote (1:2; 1:4; 1:8:1:16) podľa obrázku 1.

Obrázok 1 - Schéma aplikácie materiálu

Ar - Emmonov roh; Pm - medulla oblongata; A+ - antigén pozitívnej kontroly; M - cerebellum; K - mozgová kôra; A- - negatívny kontrolný antigén.

je možné použiť iné schémy na zavedenie materiálu, ale použitie pozitívnych a negatívnych antigénov je povinné.

Sklíčka s testovaným materiálom sa vložia do Petriho misiek s navlhčeným dnom alebo mokrého exsikátora a potom sa na 48 hodín do termostatu pri teplote (37 ± 1) * C (Petriho misky sa prikryjú vekom a vložia sa do termostat).

Reakcia sa berie do úvahy po 6,24 a 48 hodinách.

11.4 Spracovanie výsledkov

Reakcia sa považuje za pozitívnu, keď sa medzi jamkami obsahujúcimi testovaný materiál a sérum proti besnote (imunoglobulín) objaví čo i len jedna precipitačná čiara akejkoľvek intenzity.

V tomto prípade by medzi pozitívnym antigénom a sérom proti besnote (imunoglobulín) mala byť pozorovateľná línia zrážania a medzi negatívnym antigénom a sérom proti besnote (imunoglobulín) by nemala byť línia zrážania.

V 8 prípadoch pozitívnej reakcie sa diagnóza považuje za preukázanú. Negatívny výsledok musí byť potvrdený inými metódami podľa 7-10.

Bibliografia

Príručka EÚ o správnej výrobnej praxi pre lieky na humánne a veterinárne použitie

MDT 619:616.98:579.852.1:615371 MKS 11.220

Kľúčové slová: besnota, diagnostika, fluorescenčná protilátková metóda, enzýmová imunoanalýza, bioanalýza, difúzna precipitačná reakcia

Podpísané na zverejnenie 04.01.2014. Formát 60x84V

Uel. PVC l. 1,40. Obeh 31 ekv. Zach. 1363.

Vypracované na základe elektronickej verzie poskytnutej tvorcom normy

FSUE "STANDARTINFORM"

123995 Moskva. Granátová ulička, 4.

RÝCHLA DIAGNOSTIKA BESENY

Metódy detekcie antigénov. V prípade besnoty na expresnú diagnostiku možno použiť metódy fluorescenčných protilátok (MFA), precipitačných reakcií (RP) v agarovom géli, metódy enzýmovej imunoanalýzy (ELISA), polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). Na diagnostiku besnoty u ľudí in vivo je potrebných niekoľko testov.

Stanovenie protilátok proti antigénom vírusu besnoty. Detekcia protilátok v krvnom sére alebo cerebrospinálnom moku je dôležitou diagnostickou metódou. Sérologické testovanie protilátok špecifických proti besnote sa vykonáva v krvnom sére, aby sa určila pre- a postexpozičná vakcinácia a určilo sa načasovanie posilňovacej imunizácie s cieľom zvýšiť imunitnú odpoveď.

Izolácia vírusov. Na izoláciu a identifikáciu vírusu sa používa metóda biotestu na bielych myšiach. Testovaný materiál sa suspenduje vo fyziologickom roztoku obsahujúcom antibiotiká a fetálne hovädzie sérum. Suspenzia sa podáva intracerebrálne bielym myšiam s hmotnosťou 5–6 g Na dôkaz rozvoja infekcie sa myši denne pozorujú až do 30. dňa po inokulácii. Myši, u ktorých sa počas tohto obdobia rozvinie choroba, sú okamžite usmrtené a mozgové tkanivá sú vyšetrené priamou MFA.

Výhodou tohto prístupu je schopnosť detekovať malé množstvá vírusu besnoty v materiáli. Nevýhodou metódy je potreba mnohých dní (7–18 dní) čakania medzi očkovaním a prejavením sa prvých príznakov ochorenia. Na skrátenie inkubačnej doby sa používajú dojčiace myši. Myši mladšie ako 3 dni sa môžu použiť na expresnú diagnostiku: u myší zabitých po 3 dňoch je už v mozgu detegovaný vírusový antigén, ktorý je možné detegovať pomocou MFA.

Tento spôsob izolácie vírusu sa praktizuje ako potvrdzujúci diagnostický test na negatívne výsledky na zistenie antigénu a teliesok Babes-Negri a v prípade uhryznutia človeka zvieraťom podozrivým z besnoty. Poskytuje primeranú senzitivitu a špecifickosť, t. j. považuje sa za diagnostickú významnosť priamej imunofluorescenčnej metódy. Okrem toho je táto metóda hlavnou metódou identifikácie vírusových variantov a je sľubná pre vývoj diagnostických činidiel.

Izolácia a identifikácia vírusu v bunkovej kultúre. Hlavnou nevýhodou izolácie vírusu počas infekcie laboratórnych zvierat je dĺžka trvania metódy. Tomu sa dá predísť použitím bunkových kultúr. Zvyčajne sa na tieto účely používa kultúra myších neuroblastómových buniek, ak je potrebné vyšetriť mozgové tkanivá. Mozog sa suspenduje v kultivačnom živnom médiu, suspenzia sa aplikuje na monovrstvu bunkovej kultúry a inkubuje sa jeden až niekoľko dní.

Citlivosť danej kultúry na vírus možno zvýšiť jej ošetrením DEAE dextránom. Bunková monovrstva sa potom premyje, fixuje v chlade acetónom alebo zmesou formalínu a metanolu a skúma imunofluorescenciou. Ak bolo zviera infikované vírusom besnoty, potom sa v monovrstve bunkovej kultúry detegujú cytoplazmatické inklúzie antigénu vírusu besnoty.

Ukázalo sa, že antigén vírusu besnoty možno detegovať na Na C1 300 myších neuroblastómových bunkách v kombinácii s MFA po 2 dňoch. Citlivosť metódy je porovnateľná s izoláciou vírusu u myší.

Hoci má vírus besnoty obligátnu neuropatogenitu in vivo, je schopný infikovať široké spektrum hostiteľských buniek in vitro, čo možno použiť na testovanie iných tkanív a orgánov na prítomnosť vírusu besnoty. Zistilo sa, že vírus besnoty sa množí v bunkách BHK-21 a Vero, v primárnych bunkách kuracích embryí alebo obličkách škrečkov. Ukázalo sa, že k adsorpcii vírusu a jeho zavedeniu do bunky dochádza do 7 hodín. Po 24-48 hodinách sa vo vnútri bunky tvoria nové vírusové častice, po 72 hodinách pučia z bunkovej membrány do medzibunkového priestoru.

Výskumné metódy

Pre expresná diagnostika besnoty môže byť použité:

a) metóda AK- na zistenie antigénu vírusu besnoty v odtlačkoch rohovky alebo zadnej časti krku pacienta s vlasovými folikulmi;
b) metóda PCR- na detekciu vírusovej RNA vo vzorkách tkanivovej biopsie, slinách, cerebrospinálnej alebo slznej tekutine;
c) metóda ELISA- na detekciu špecifických protilátok (antigénu) u pacientov s typickým alebo atypickým priebehom.
d) metóda biotesty- na izoláciu vírusu v počiatočných štádiách ochorenia alebo na zistenie protilátok v krvi alebo mozgomiešnom moku pri neskoré štádiá choroby. Na expresnú diagnostiku sa používa komplexná metóda (biotest + MFA), ktorá spočíva v infikovaní 2-dňových novorodených myší testovaným materiálom a vyšetrení ich mozgu na 3. – 4. deň v MFA.

Výber metód in vivo diagnostiky do značnej miery závisí od štádia ochorenia: metóda založená na detekcii antigénov je spravidla vysoko citlivá na konci inkubačnej doby, počas prvých dní choroby, zatiaľ čo protilátky neutralizujúce vírus sa zvyčajne objavia v mozgovomiechovom moku a sére krvi po 7-10 dňoch od začiatku ochorenia.

Imunofluorescenčná reakcia. Metóda je založená na použití protilátok naviazaných na farbivo, napríklad fluoresceín izotiokyanát. RIF sa široko používa na detekciu vírusových antigénov v materiáli pacientov a na rýchlu diagnostiku.

Metóda má najvyšší stupeň citlivosti, je základom expresnej diagnostiky a umožňuje detekciu vírusových antigénov v priebehu niekoľkých hodín.

Hlavné výhody MFA sú: rýchlosť realizácie, vysoká špecifickosť (100%). Čas strávený diagnostikovaním ochorenia s jeho pomocou je kratší ako jeden deň. Používajú sa priame a nepriame verzie MZV.

Priama imunofluorescencia zostáva preferovanou metódou diagnostiky besnoty. Podložné sklíčka obsahujúce odtlačky mozgových tkanív alebo poháre s monovrstvou tkanivovej kultúry sa fixujú v acetóne počas 1-4 hodín. Prípravky sa potom vysušia a ošetria fluorescenčnými polyklonálnymi anti-nukleokapsidovými protilátkami (imunofluorescenčné činidlo).

Toto činidlo je konjugát pripravený zo špecifických polyklonálnych protilátok triedy IgG proti nukleokapsidovému antigénu vírusu a fluoresceín izokyanátu (FITC). Špecifické protilátky sa získajú hyperimunizáciou zvierat (králikov, škrečkov alebo koní) zmesou vírusových nukleokapsidových epitopov.

V súčasnosti sa na tieto účely čoraz častejšie používajú myšie monoklonálne protilátky proti nukleokapsidu vírusu besnoty. Po 30-minútovej inkubácii pri 37 °C sa diagnostické prípravky opakovane premyjú fyziologickým roztokom a destilovanou vodou.

Protilátky značené FITC sú fixované iba v miestach lokalizácie vírusových nukleoproteínových antigénov. Preparáty sa potom sušia na vzduchu a skúmajú sa svetelnou mikroskopiou s použitím xenónovej lampy a vhodného filtra ako svetelného zdroja.

O nepriama verzia antigén sa najskôr spojí s nezafarbeným špecifickým imunitným sérom. Potom sú vytvorené nefluorescenčné komplexy antigén-protilátka vystavené fluorochrómom označenému imunitnému séru obsahujúcemu protilátky proti špecifickým sérovým proteínom. Nepriama verzia MFA spolu s detekciou antigénu umožňuje kvantifikovať protilátky v testovacom sére jeho vhodným zriedením.

Formácie značené FITC v bunkách rôznych tkanív sa detegujú ako žltozelené fluorescenčné farbenie na tmavom pozadí (vo forme okrúhlych alebo oválnych intracytoplazmatických inklúzií).

Prepojený imunosorbentový test. Metóda je založená na princípe sorpcie proteínu na pevnej fáze s následnou tvorbou komplexov antigén-protilátka detekovaných roztokom substrát-indikátor. Antigén pridaný do jamiek sa špecificky viaže na protilátky. Testovacie séra sa aplikujú na vrstvu antigénu v požadovaných riedeniach. V prítomnosti špecifických protilátok v nich sa tieto viažu na antigén. Na detekciu väzby sa na vrstvu protilátky aplikuje imunoglobulín proti ľudským sérovým globulínom konjugovaným s chrenovou peroxidázou. Množstvo sorbujúceho konjugátu je úmerné množstvu ľudského séra naviazaného na antigén. Dá sa to určiť pomocou indikačného roztoku (ortofenylyléndiamín + peroxid vodíka), ktorého zložky pôsobením konjugovanej peroxidázy sfarbujú kvapalinu do hnedo-žlta. Pri vyšetrovaní nejasných prípadov použitie ELISA popri metódach RP alebo RSK umožňuje zvýšiť spoľahlivosť laboratórnej diagnostiky besnoty, vzhľadom na vysokú citlivosť tejto metódy. Metóda umožňuje odhaliť infekčné a defektné častice.

Na stanovenie protilátok proti besnote počas očkovania môžete použiť nepriama metóda ELISA s použitím purifikovaného vírusu ako antigénu a na stanovenie protilátok triedy IgG v ľudskom sére - Staphylococcus A-proteín spojený s chrenovou peroxidázou. Výsledky ELISA sú porovnateľné s výsledkami získanými v testoch vírusovej neutralizácie u myší. Metóda umožňuje zistiť prítomnosť IgM na začiatku imunizačného procesu.

Imunoenzýmové metódy sú veľmi sľubné na detekciu nukleokapsidového antigénu vírusu pri postmortálnej diagnostike v mozgových tkanivách. Medzi nimi je napríklad rýchla metóda ELISA na diagnostiku besnoty, založená na príprave platní senzibilizovaných protilátkami izotypu IgG proti nukleokapsidu prvého sérotypu, zriedených v uhličitanovom pufri.

Testovaný materiál sa homogenizuje v tlmivom alebo kultivačnom médiu, vyčíri sa centrifugáciou, pridá sa do jamiek a inkubuje sa na platniach. Nukleokapsidový antigén fixovaný špecifickými protilátkami sa identifikuje pridaním peroxidázového konjugátu s antinukleokapsidovými protilátkami proti besnote s odlišnou druhovou špecifickosťou a chromogénnym substrátom. Citlivosť metódy je 0,8–1,0 ng/ml.

Touto metódou je možné detegovať antigény vírusov rôznych sérotypov. Použitie konjugátov nukleokapsidovo špecifických protilátok značených biotínom zvyšuje citlivosť metódy na 0,1–0,2 ng/ml.

Nukleokapsidový antigén je úspešne detegovaný pomocou ELISA, ale materiál, aj keď je rozložený, by nemal byť fixovaný formalínom.

metóda polymerázovej reťazovej reakcie. Na rýchlu diagnostiku vírusu besnoty a identifikáciu lyssavírusov je najvhodnejšou metódou polymerázová reťazová reakcia (PCR). Metóda PCR je najspoľahlivejšia a najrýchlejšia metóda na izoláciu viriónovej RNA z akejkoľvek vzorky obsahujúcej vírus v nízkej koncentrácii. S ním môžete vytvoriť veľa kópií vírusu RNA. Táto metóda sa používa na potvrdenie výsledkov MFA a na detekciu vírusu v slinách, vlasových folikuloch na zadnej strane krku a hlavy.

PCR je založená na princípe prirodzenej replikácie DNA. Podstatou metódy je opakované opakovanie cyklov syntézy (amplifikácie) vírusovo špecifickej DNA sekvencie pomocou termostabilnej Taq DNA polymerázy a dvoch špecifických primerov, tzv.

Každý cyklus pozostáva z troch etáp s rôznymi teplotný režim. V každom cykle sa počet kópií syntetizovanej oblasti zdvojnásobí. Novosyntetizované fragmenty DNA slúžia ako templát pre syntézu nových reťazcov v ďalšom amplifikačnom cykle, čo umožňuje akumulovať dostatočný počet kópií vybranej oblasti DNA v 25–35 cykloch na jej stanovenie, zvyčajne pomocou agarózového gélu. elektroforéza.

Obzvlášť vysoká citlivosť PCR pri použití primerov komplementárnych k N-génu, kedy je možné detegovať vírusovú RNA vo vzorkách obsahujúcich vírus v titri 10 MLD50. Metóda PCR dokáže detekovať vírusovú RNA aj v rozloženom patologickom materiáli.

V súčasnosti boli vyvinuté a v praxi široko používané konfirmačné (potvrdzujúce) testy, ako je PCR s reverznou transkriptázou (RT-PCR). Metóda RT-PCR je vysoko citlivá a najúčinnejšia. RNA sa extrahuje z tkanív orgánu infikovaného vírusom, prepíše sa do cDNA, ktorá sa potom amplifikuje PCR metóda. RT-PCR vyžaduje priméry získané pre konzervatívne oblasti genómu vírusu besnoty. Typicky sa používajú gény kódujúce nukleoproteín alebo N-proteín.

Metóda PCR je vysoko špecifická a veľmi citlivá. Je to jeden z najpresnejších testov na detekciu antigénu besnoty, umožňuje diagnostikovať besnotu aj vtedy, ak je v materiáli aspoň jeden virión. Test je založený na komplementárnom dokončení templátu RNA, uskutočnenom in vitro pomocou enzýmu RNA polymerázy. V posledných rokoch sa PCR stále viac používa na diagnostiku a monitorovanie. vírusové infekcie. Technika je však zložitá, nákladná a ešte nie je dostatočne unifikovaná pre rutinné použitie.

Cytologické metódy majú v súčasnosti obmedzenú diagnostickú hodnotu, ale stále by sa mali používať pri mnohých infekciách. Skúmajú sa pitevné materiály, biopsie, nátery, ktoré sa po vhodnom spracovaní farbia a analyzujú pod mikroskopom. U besnoty je to detekcia inklúzií v cytoplazme buniek (Babes-Negriho telieska).

Izolácia vírusov. Izolácia vírusu môže byť potrebná na potvrdenie výsledkov testov na antigén a na ďalšiu charakterizáciu izolátov. A hoci je táto metóda jednou z najstarších a časovo najnáročnejších diagnostických metód, dnes je izolácia vírusu s následnou identifikáciou pomocou niektorej z moderných metód (ELISA s monoklonálnymi protilátkami alebo PCR) najspoľahlivejšou diagnostickou metódou, tzv. "Zlatý štandard".

Účinnosť diagnostických metód besnoty sa môže meniť v závislosti od množstva faktorov (štádium ochorenia, načasovanie odberu vzoriek materiálu, kvalita získaných vzoriek, podmienky skladovania, skúsenosti personálu, kvalita činidiel atď.). Ak pozitívny výsledok potvrdí besnotu, potom negatívny výsledok nemusí vždy znamenať neprítomnosť choroby. Pri besnote preto odborníci WHO odporúčajú použiť viacero testov, najmä MFA v kombinácii s biotestom na novorodených (2-3 dňových) bielych myšiach.

Opatrenia osobnej prevencie

Všetky práce s materiálom podozrivým z obsahu vírusu besnoty, ako aj so zvieratami podozrivými z besnoty, sa musia vykonávať v súlade s opatreniami osobnej bezpečnosti. zdravotníckych pracovníkov a veterinári by mal pracovať v plášti, rukaviciach, maskách.

Na konci práce sa krabice ošetria 3% roztokom peroxidu vodíka.

Fľaštičky, ampulky a nástroje, ako aj zvyšné materiály obsahujúce vírus besnoty a všetky pomôcky sa po práci dezinfikujú autoklávovaním počas 1 hodiny pri 1,5 atm (režim zabíjania).

Osobné ochranné prostriedky sa dezinfikujú vyvarením alebo autoklávovaním. Pracovná plocha stola a ruky sú dezinfikované dezinfekčným roztokom (0,5% roztok chloramínu).

Besnota (R) je akútne ochorenie teplokrvných živočíchov charakterizované poškodením centrálneho nervového systému. Náchylné sú domáce a voľne žijúce zvieratá každého druhu, ako aj ľudia.

Ochorenie je registrované v rôznych regiónoch sveta. V Austrálii, Veľkej Británii, Japonsku sa nevyskytli žiadne prípady šírenia choroby. Choroba takmer vždy končí smrťou. Existujú skutočne zdokumentované prípady zotavenia sa z besnoty u ľudí a psov po experimentálnej infekcii.

Vírus besnoty (vírus besnoty) patrí do čeľade Rhabdoviridae, rodu Lyssavirus. Teraz sa zistilo, že VB má 4 sérotypy, čo je zrejme spôsobené rozdielom v zložení membránových proteínov. Všetky varianty VB sú imunobiologicky príbuzné, ale líšia sa virulenciou. WB má vlastnosti GA a GAD. Medzi infekčnou a GA aktivitou existuje lineárny vzťah. Zvieratá imunizované proti besnote produkujú VNA, KSA, antiHA a lytické (ničiace bunky infikované vírusom v prítomnosti komplementu) protilátky.

Diagnóza sa robí na základe epidemiologických údajov, príznakov ochorenia, patologických zmien (majú menší význam) a hlavne výsledkov laboratórnych vyšetrení.

Laboratórna diagnostika spočíva v štúdiu mozgu zvierat za účelom detekcie vírusového AG v IF, RDP, detekcii teliesok Babes-Negri a biotestu na bielych myšiach.

V Ruskej federácii je v súčasnosti výroba súprav na diagnostiku B v IF a RDP organizovaná vo VNITIBP a KazNIVI.

Izolácia vírusu.Čerstvé mŕtvoly malých zvierat sa posielajú do laboratória na výskum, z veľkých zvierat - hlavy alebo mozgu. V niektorých prípadoch je povolené konzervovanie mozgu v 50% glyceríne. Mŕtvola alebo hlava musia byť starostlivo zabalené do plastového vrecka, mozog - do nádoby so zábrusom alebo gumenou zátkou, naplnenej parafínom. Materiál je zabalený v nádobe odolnej proti vlhkosti. Na virologické štúdie sú vhodné len nekonzervované mozgy. Je potrebné mať na pamäti, že pitva, extrakcia mozgu a iné operácie s patologickým materiálom by sa mali vykonávať za podmienok sterility a prísneho dodržiavania osobných preventívnych opatrení: pevne fixujte hlavu zvieraťa, chráňte ruky 2 pármi rukavíc ( chirurgické a anatomické), nasaďte si okuliare na ochranu očí a na nos a ústa - 6-vrstvový gázový obväz.

Materiálový laboratórny výskum besnota sa vykonáva mimo poradia; výsledky sa ihneď hlásia farmárskemu lekárovi a hlavnému lekárovi okresu (mesta).

Poradie výskumu: z každej časti mozgu ľavej a pravej strany (Ammonov roh, mozoček, mozgová kôra a oblongata) sa pripravia 4 odtlačky steru na IF a detekciu teliesok Babesh-Negri; s mozgovým tkanivom dať RDP; s negatívnymi výsledkami sa zavedie biotest.

Detekcia špecifických inklúznych teliesok. Nátery z odtlačkov sú zafarbené podľa Sellersa, Muromtseva alebo iných metód. Po zafarbení sa preparáty prezerajú pod svetelným mikroskopom s imerzným systémom. Prítomnosť špecifických teliesok Babesh-Negri sa považuje za pozitívny výsledok (pri farbení podľa Sellersa - jasne definované oválne alebo podlhovasté granulárne útvary ružovo-červenej farby v protoplazme, pri farbení podľa Muromtseva - svetlofialová s tmavomodrými inklúziami Babesh -Negriho telieska, častejšie sa nachádzajú mimo nervových buniek.

Najcharakteristickejšou črtou tiel Babesh - Negri je ich vnútorná štruktúra, ktorá umožňuje ich absolútne presné rozlíšenie. Vo vnútri sú viditeľné malé zrná - bazofilné zrná tmavomodrej, až čiernej farby, veľké 0,2-0,5 mikrónu.

Diagnostická hodnota detekcie inklúznych teliesok na dôkaz infekcie WB je všeobecne uznávaná. U zdravých zvierat, najmä u mačiek a bielych myší, sa však vyskytujú útvary, ktorých prítomnosť môže spôsobiť diagnostické ťažkosti. V niektorých prípadoch v mozgu mačky je možné s istotou odlíšiť takéto inklúzie od telies Babes-Negri a tu sa odporúča použiť metódy identifikácie, najmä IF. Podobne u psov, ktoré zomreli na otravu hadím jedom alebo elektrickým šokom, možno nájsť inklúzne telieska pripomínajúce telá Babes-Negri. Babesh-Negriho telá sú detekované iba v 65-85% prípadov besnoty, takže ich absencia nie je negatívnou odpoveďou a materiál sa skúma v iných testoch (IF, RDP, biotest).

AK. Jeden z hlavných testov v diagnostike B. Pri vysokokvalifikovanom výkone sa získa 99-100% zhoda s metódou biotestu. Zvyčajne sa v diagnostickej praxi používa priama metóda IF, ktorá sa uskutočňuje pomocou fluorescenčných Ig proti besnote. Fixácia preparátov vo vychladenom (8-10°C) acetóne sa uskutočňuje aspoň 4 hodiny. Ako negatívna kontrola sa používajú šmuhy-odtlačky mozgu zdravých bielych myší. Výsledky sa zohľadňujú vizuálne vo fluorescenčnom mikroskope na základe hodnotenia intenzity žiary komplexu AG-AT. AH VB sa deteguje ako jasne žltozelené alebo zelené granuly rôznych tvarov a veľkostí v bunkách (častejšie mimo buniek). Diagnóza sa považuje za stanovenú, ak sa vo viacerých zorných poliach nájde dostatočný počet (aspoň 10) typických granúl so svetlozelenou žiarou alebo množstvom drobných bodiek.V kontrole by takáto žiara nemala byť.

Na preukázanie špecificity fluorescencie komplexu AG-AT sa používa metóda supresie IF, ktorá spočíva v schopnosti AG besnoty asociovanej s nefluorescenčnými AT nerekombinovať sa s fluorescenčne špecifickými AT. Na tento účel sa fixované prípravky pripravené zo skúmaného mozgu potiahnu 5 % nefluorescenčným Ig proti besnote, inkubujú sa 30 minút pri 37 °C vo vlhkej komore, premyjú sa fyziologickým roztokom a potom sa farbia fluorescenčným činidlom proti besnote. Ig konvenčnou priamou metódou. V prípravkoch ošetrených týmto spôsobom by nemala byť žiadna fluorescencia.

Metóda IF umožňuje detegovať WB v bunkách rohovky očí a vykonať predbežnú diagnózu in vivo: počas choroby zvierat, ako aj 1-2 dni alebo viac pred jej klinickým prejavom. Metódu možno použiť na štúdium zvierat podozrivých z choroby B, ako aj klinicky zdravých psov a mačiek, ktoré pohrýzli ľudí a zvieratá. Za týmto účelom pripravte výtlačky z rohovky, dodržujte všetky pravidlá osobnej bezpečnosti, otvorte palpebrálnu štrbinu zvieraťa palcom a ukazovákom a na mierne vyčnievajúcom očná buľva stlačte povrch podložného skla a ustúpte 0,5 cm od konca. Je potrebné zabezpečiť, aby zviera nežmurklo tretím viečkom, pretože epiteliálne bunky sa odstránia zo skla a získa sa nekvalitný náter. Z každého oka sa vyrobia minimálne 2 prípravky obsahujúce 2 odtlačky. Na kontrolu sa podobným spôsobom pripravujú odtlačky rohovky zdravých zvierat. Môžu byť varené na farme. Výtlačky sa sušia na vzduchu, fixujú sa v acetóne 4 hodiny pri 4 °C, zabalia sa a odošlú do laboratória. Prípravky na škvrny, ako v IF, podľa všeobecne uznávanej metódy.

V prípravkoch získaných od chorých zvierat alebo zvierat na konci inkubačnej doby ochorenia sú v cytoplazme mnohých epitelových buniek pozorované jasne svietiace granuly rôznych veľkostí rôznych tvarov - od bodiek podobných prachu až po 2 mikróny alebo viac. Na získanie spoľahlivých výsledkov sa v každom prípravku vyšetrí 50 až 100 buniek a celkovo najmenej 200 až 400 buniek zo zvieraťa. Výsledky mikroskopie sa považujú za pozitívne, ak sa v odtlačkoch rohovky zvieraťa nájde 11 % alebo viac buniek s charakteristickými ohniskami luminiscencie. Treba mať na pamäti, že v prípravkoch od zdravých zvierat (kontrola) sa môžu v dôsledku autofluorescencie vyskytovať jednotlivé bunky s ohniskami podobného tvaru a luminiscencie.

Je dôležité poznamenať, že IF umožňuje urýchliť odpoveď na konečnú diagnózu biotestom, pretože diagnózu B možno stanoviť až na 4. – 8. deň po infekcii myší testovaným materiálom a inkubačná doba choroba u myší môže dosiahnuť 20 dní. IF dokáže detekovať WB v tkanivách submandibulárnej slinnej žľazy. Nátery sa pripravujú z podčeľustných slinných žliaz, pričom sa odoberá materiál najmenej zo 6 rôznych častí žľazy, pretože distribúcia vírusu v nej je nerovnomerná. Často, aby ste získali odtlačok, musíte použiť silný tlak, pretože kvôli množstvu mucínu zostáva na skle málo materiálu.

Bola preukázaná možnosť identifikácie VB v koži metódou IF, na tento účel sa odoberajú vzorky z pokožky hlavy, ako aj senzorických a hmatových vláskov papule alebo laterálnych senzorických papíl (na líci psa). Vzorky sa skladujú pri -20 alebo -70 °C. Vyrábajú sa z nich kryosekcie, ktoré sú ošetrené fluorescenčným globulínom. Výsledky analýzy IF získané z identifikácie VB v koži vo vysokej miere korelujú s údajmi získanými zo štúdie mozgu toho istého zvieraťa. Ukázala sa úzka korelácia medzi detekciou vírusu AH vo vzorkách mozgu a tkaniva pier metódou IF.

PRV. Používa sa na detekciu AH VB v nezakonzervovanom mozgu zvierat, ktoré uhynuli na pouličnú besnotu, alebo myší použitých v biologickom teste. RDP sa umiestni mikrometódou na sklíčka s použitím 1-1,5 % agarového gélu podľa všeobecne akceptovanej metódy. Najvyššie percento pozitívnych výsledkov sa odhalí pri použití nasledujúcej šablóny: A - ammonský roh (pravá strana); B - mozgová kôra (pravá strana); C - cerebellum (pravá strana); D - medulla oblongata (pravá strana); + (plus) - pozitívna kontrola; - (mínus) - negatívna kontrola; 1, 2, 3, 4 - jamky s riedením špecifického imunoglobulínu 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, resp.

Pomocou pinzety sa z každej časti mozgu pripraví homogénna pastovitá hmota, ktorá sa umiestni do príslušných jamiek. U myší sa skúma celý mozog. Z mozgových oblastí ľavej strany sa podobným spôsobom pripraví AG (na každé vyšetrenie sú potrebné celkom 4 podložné sklíčka s agarovým gélom). Reakcia sa berie do úvahy po 6, 24, 48 hodinách Ak sú medzi jamkami obsahujúcimi AG a imunoglobulín 1 alebo 2-3 precipitačné línie, reakcia sa považuje za pozitívnu.

RDP je jednoduché na vykonanie a je špecifický, ale percento detekcie vírusového AG v testovanom materiáli je 45-70. Pri štúdiu mozgu myší získaných pozitívnym biologickým testom RDP odhalí až 100 % prípadov. Neprítomnosť Babesh-Negriho teliesok, špecifická fluorescencia a negatívny RDP v testovanom materiáli nie sú dôvodom na vylúčenie prítomnosti vírusu. V tomto prípade je konečná diagnóza založená na výsledkoch biologického testu na bielych myšiach, po ktorom nasleduje identifikácia vírusu.

Biotest. Všeobecne sa uznáva, že biologický test je viac efektívna metóda ako detekcia Babesh-Negriho teliesok, IF a pod. V niektorých prípadoch však dopadla aj negatívne, napriek potvrdeniu diagnózy B detekciou inklúznych teliesok a IF. Percento negatívnych výsledkov biotestu sa pohybovalo od 1,3 do 12.

Informácie o rozdielnej účinnosti biotestu možno vysvetliť množstvom faktorov: výberom pokusného zvieraťa, jeho počtom v pokuse, spôsobom infekcie, spôsobom a dobou skladovania materiálu pred vstupom do laboratória. Úlohu môže zohrávať aj fenomén interferencie infekčných častíc s neaktívnymi časticami, ak sa na očkovanie použije nedostatočne zriedený materiál.

V mozgu a slinných žľazách líšok a skunkov, ktoré zomreli na besnotu, sa našla látka, ktorá inhibuje infekčnosť vírusu, čo znemožňuje diagnostikovať ochorenie u týchto zvierat intracerebrálnou infekciou myší. Prítomnosť inhibičnej látky v testovanom materiáli nebráni detekcii vírusového AG metódou IF; pre skunky a líšky je to najcitlivejšia diagnostická metóda.

Zo zvierat všetkých druhov (králiky, morčatá, dospelé biele myši a škrečky), ktoré sa používajú na biotest, mnohí uprednostňujú dojčiace myši, pretože sú citlivejšie na rôzne kmene VB a menej nebezpečné pri práci. Sýrske škrečky nie sú horšie ako myši v citlivosti, ale sú menej dostupné.

RSK. Detekcia špecifickej AH v RSK v diagnostike besnoty sa používa menej často ako iné metódy. AG sa pripravuje z mozgu zaslaného na výskum. Na tento účel sa mozgové tkanivo (zvlášť bohaté na komplement viažucu AG, kúsky talamu a mozgový kmeň) trituruje vo veronálnom pufri v pomere 1:10 a nechá sa 1 hodinu pri izbovej teplote, potom sa suspenzia inaktivovaný pri 56°C počas 5 hodín.Takéto ošetrenie zabíja vírus a odstraňuje antikomplementaritu mozgového tkaniva bez poškodenia špecifického antigénu. Suspenzia sa odstreďuje 15 minút pri 3500 min-1 zo supernatantu, čo je materiál na testovanie prítomnosti AG, pripravia sa 2-násobne sa zvyšujúce riedenia od 1:2 do 1:64 a použijú sa na výskum v CSC .

ELISA. V ELISA sa špecifické zafarbenie AG v mozgových bunkách zvierat, ktoré uhynuli na besnotu, zisťuje tak v čerstvo odobratých, skladovaných v glycerole, ako aj vo vzorkách skladovaných bez glycerínu pri teplote 20 ° C počas 8-18 hodín. rutinná diagnostika besnoty u zvierat, na detekciu AG WB v tkanivových parafínových rezoch počas fixácie preparátov 10% formalínovým roztokom s pH 5,3 a následné ošetrenie preparátov zaliatych v parafíne s pepsínom.

Na rozdiel od ROP u myší a v bunkovej kultúre dokáže ELISA detegovať AT u zvierat v priebehu niekoľkých hodín, ELISA je najsľubnejšia laboratórna metóda na detekciu AT a indikáciu samotného vírusu. Expresnou metódou na diagnostiku besnoty je odchytová technika a metóda IF na detekciu AH BB. Bolo dokázané, že metóda detekcie AH VB v parafinizovaných rezoch peroxidázovo-antiperoxidázovou metódou je výrazne lepšia ako metóda ELISA. V roku 1987 bola vytvorená súprava Rapid Enzyme Immunodiagnosis of Rabies (RREID), vhodná na epidemiologické a laboratórne štúdie.

Identifikácia variantu pomocou mAT. Pomocou mAb až WB glykoproteínov boli vybrané AG varianty, medzi ktorými boli identifikované fenotypicky termolabilné (avirulentné) varianty. Pri použití 2 skupín mAb sa ukázalo, že riediace kmene sa líšia od ks. Fixe (Pasteur), CVS, Flury HEP, ERA a "kačacie" kmene pre AH determinanty. Štúdia 7 kmeňov izolovaných od pacientov s B ľuďmi pomocou mAb umožnila identifikovať určité rozdiely medzi nimi a vakcinačným kmeňom vo vzťahu k AH determinantom.

Všeobecne sa uznáva, že rozdiely AT medzi divokými kmeňmi možno detegovať pomocou mAb proti nukleokapsidu ATN, ktoré reagujú s cytoplazmatickými inklúziami buniek infikovaných vírusom; anti-glykoproteín (G AG), ktoré reagujú s membránami infikovaných buniek, lyzujú tieto bunky v prítomnosti komplementu a neutralizujú vírus. V súvislosti s možnou AH variabilitou povrchového glykoproteínu WB z rôznych geografických oblastí bol ako ochranný AG použitý ribonukleoproteín charakterizovaný konzervativitou štruktúry AG. Ochrannú aktivitu má teda nielen G proteín, ale aj RNP VB.

. Tieto metódy nie sú typické pre besnotu, pretože sa používajú len na účely testovania postvakcinačnej imunity. Na detekciu a titráciu postvakcinačných protilátok sa používa pH, ktoré sa nastavuje všeobecne uznávanou metódou. Pevná WB sa používa ako AG. RN na bunkách BHK-21 bola citlivejšia ako nepriama IF pri detekcii AT v sére vakcinovaných líšok. Okrem toho boli navrhnuté RTGA a ELISA.

RTGA. Zatiaľ nenašli široké uplatnenie v diagnostickej praxi v dôsledku prítomnosti nešpecifických inhibítorov v krvných sérach, na ktoré je WB vysoko citlivý, a čo je najdôležitejšie, GA AG, ktoré neboli podrobené dostatočnej purifikácii, mali nízku citlivosť. Na prípravu HA AG WB sa navrhuje použiť ks. Moskva pestovaná v bunkovej kultúre VNK-21 po ošetrení saponínom, po ktorom nasleduje purifikácia a koncentrácia. HA sa oddelí od ostatných zložiek viriónu ultracentrifugáciou. Výsledný prípravok mal stupeň purifikácie 99,92 %, mal vysokú GA aktivitu (1:128), dobre konzervovaný 1 mesiac pri pH 5-9.

Pred nastavením RTGA by sa mala vykonať mierna 2-násobná trypsinizácia husacích erytrocytov na ich senzibilizáciu. Pri použití 0,25 % suspenzie trypsinizovaných erytrocytov (najlepšie 10 7 buniek na 1 ml) sa citlivosť RTGA zvýši 4-krát. Na riedenie AG a séra sa používa roztok boritanovej soli (pH 9) s prídavkom 0,4 % hovädzieho sérového albumínu. Suspenzia erytrocytov sa pripraví vo fyziologickom roztoku s kyslým pH tak, aby po spojení so zmesou vírusu a séra, ktorých pH je 9, bolo konečné pH nastavené do 6,2. Po pridaní suspenzie erytrocytov do jamiek sa panel pretrepe, uzatvorí sa priehľadným filmom a umiestni sa na ľad. Výsledky RTHA sa berú do úvahy po 40-50 minútach a pri erytrocytoch 2-dňových kurčiat alebo opíc rhesus - po 1-1,5 hodine.

Bol vyvinutý rádioimunotest založený na schopnosti AT viazať sa na značenú1251-AG WB. Označený IgG izolovaný z hyperimúnneho séra proti besnote sa môže použiť na detekciu WB AG pomocou RIA na pevnej fáze. Najlepšie výsledky sa dosiahli pri použití roztoku fosforečnanu a soli (pH 6,0) s iónovou silou 0,01 M a značeným IgG s aktivitou 200-250 tisíc pulzov/min.

Kompetitívna RIA na pevnej fáze je použiteľná na detekciu protilátok proti besnote v sére a supernatantoch hybridómov.

Odlišná diagnóza. Je potrebné vylúčiť Aujeszkyho chorobu, pri ktorej choré zvieratá nie sú agresívne, nedochádza k zvrhnutiu chuti do jedla. U psov je vylúčená nervová forma moru. Pri infekčnej encefalomyelitíde koní je podozrenie na besnotu. Komplex laboratórnych testov umožňuje stanoviť presnú diagnózu besnoty. Bol navrhnutý nový spôsob diferenciácie rôznych VB kmeňov založený na restriktázovom štiepení amplifikačných produktov v PCR segmentu N génu.

Laboratórna diagnostika infekčnej bovinnej rinotracheitídy

Infekčná rinotracheitída (IRT, pľuzgierovitá vyrážka, infekčná vulvovaginitída, infekčná nekrotická rinotracheitída, infekčná rinitída, „červený nos“, nákazlivá bronchopneumónia, infekčný katar horných dýchacích ciest) je akútne nákazlivé ochorenie hovädzieho dobytka charakterizované najmä katarálno-nekrotickými léziami dýchacieho traktu, horúčka, celková depresia a konjunktivitída, ako aj rozvoj pustulárnej vulvovaginitídy, keď sa vírus dostane do genitálií zvieraťa a potrat. Choroba je všadeprítomná.

Vírus bovinnej infekčnej rinotracheitídy (IRT) patrí do čeľade Herpesviridae, podčeľade Alphaherpesvirinae, rodu Varicellavirus.

Antigénne nie je bovinný RTI vírus homogénny, existujú varianty. Medzi vírusmi hovädzieho dobytka RTI a AD existuje vzťah AG. U zvierat spôsobuje vírus tvorbu VNA, KSA. Vírus má vlastnosti GA vo vzťahu k myším erytrocytom.

Laboratórna diagnostika zahŕňa: 1) izolácia vírusu z patologického materiálu v bunkovej kultúre a jeho identifikácia v RN alebo RIF; 2) detekcia antigénu vírusu RTI v patologickom materiáli RIF; 3) detekcia protilátok v krvnom sére chorých a uzdravených zvierat (retrospektívna diagnóza) v RN alebo RNGA. Na laboratórnu diagnostiku IRT sa používa súbor diagnostika pre infekčnú rinotracheitídu hovädzieho dobytka a súbor erytrocytového diagnostika pre sérodiagnostiku IRT u hovädzieho dobytka v RNGA.

Diagnostika infekčnej rinotracheitídy sa uskutočňuje súbežne so štúdiom materiálu na parainfluenzu (PG-3), adenovírus (1 a 11), respiračné syncytiálne infekcie a vírusovú hnačku. Schéma laboratórnej diagnostiky IRT je podobná schéme používanej pri diagnostike adenovírusovej infekcie.

Predbežná diagnóza infekčnej bovinnej rinotracheitídy sa robí na základe pozitívnych výsledkov detekcie antigénu v patologickom materiáli RIF, berúc do úvahy epizootologické a klinické údaje, ako aj patologické zmeny.

Konečná diagnóza sa robí na základe zhody výsledkov RIF s izoláciou a identifikáciou vírusu; zhoda výsledkov RIF s detekciou protilátok v 30 % alebo viacerých druhých vzorkách séra v titroch nie nižších ako 1:2 v RN a 1:16 v RNGA a detekcia 4-násobného alebo väčšieho zvýšenia titra protilátok v párových vzorkách séra. Predbežná diagnóza sa vykoná vo veterinárnych laboratóriách do 2-3 dní, konečná - do 15-30 dní.

Izolácia vírusov. Zber a príprava materiálu. Patologický materiál sa odosiela do laboratória, odoberá sa počas prvých 2-3 dní choroby s výrazným klinickým obrazom choroby alebo na diagnostické účely priamo pri porážke zo zvierat v akútnom štádiu choroby.

Od chorých zvierat sa odoberie 15-20 vzoriek: výtery zo sliznice nosnej dutiny, očí, vagíny, predkožky, vzorky spermií. Na umývanie sa používajú sterilné vatové tampóny; výtery z predkožkovej dutiny a spermie sa odoberajú v súlade so Smernicou pre odber vzoriek, prepravu a prípravu na virologické vyšetrenie spermy a výterov z predkožkovej dutiny býkov; vzorky krvi, nie menej ako 5 ml, sa odoberú v prvých 3 dňoch choroby a po 3 týždňoch od tých istých zvierat v sterilných skúmavkách. Tampóny s materiálom sa umiestnia do sterilných penicilínových liekoviek alebo skúmaviek s 2-3 ml sterilného fyziologického roztoku alebo Hankovho roztoku s obsahom 500 až 1000 IU/ml antibiotík (kanamycín, monomycín, neomycín, penicilín, streptomycín atď.).

Po zrážaní krvi sa 2-3 ml séra sterilne vypustia a dodajú do laboratória.

Zo zvierat usmrtených na diagnostické účely kúsky pľúc s bronchom (na hranici postihnutej a zdravej oblasti), sleziny, mediastinálne, bronchiálne a mezenterické lymfatické uzliny, mandle, postihnuté oblasti slizníc nosnej a ústnej dutiny. priedušnice, gastrointestinálneho traktu, ako aj vzorka krvi z potratených plodov - kúskov parenchýmových orgánov. Kusy materiálu s hmotnosťou do 20 g sa umiestnia do sterilnej nádoby.

Konzervácia patologického materiálu, dodanie do laboratória a jeho príprava na vyšetrenie sú rovnaké ako pri diagnostike adenovírusovej infekcie.

Vzorky spermy sa môžu skladovať pri teplote mínus 20 °C najviac 5 dní pred testovaním. Spermie sa vyšetrujú do 24 hodín po rozmrazení. Zriedi sa v pomere 1:10 živným médiom pre bunkovú kultúru s prídavkom vhodných antibiotík (500 IU na 1 ml), zmrazí sa 2-3 krát pri mínus 30 °C, rozmrazí sa pri 37 °C, 10 centrifuguje pri 2000 ot./min. minút . Supernatant sa použije na infekciu bunkovej kultúry. Infekcia bunkových kultúr. Jeho technika je podobná ako pri diagnostike adenovírusovej infekcie. Izolát sa považuje za izolovaný, ak spôsobuje stabilný cytopatogénny účinok rovnakého typu v najmenej troch po sebe nasledujúcich pasážach. V tomto prípade je možná jeho následná identifikácia v nosnej rakete. Cytopatogénny účinok vírusu IRT v bunkovej kultúre je charakterizovaný tvorbou okienok v monovrstve, zaoblením buniek, ich akumuláciou vo forme „zhlukov“ s ich následným odlupovaním z povrchu skla.

Infekcia zvierat. Robia sa veľmi zriedkavo s cieľom identifikovať vírus infekčnej rinotracheitídy. U 6-8-mesačných teliat sa patologický materiál vstrekuje intranazálne do vagíny, pod kožu a aplikuje sa na spojovku. Ak je v testovanom materiáli vírus, u infikovaných zvierat sa vyvinie rinotracheitída s konjunktivitídou. Z chorých teliat sa vírus izoluje najmä z postihnutej priedušnice a hrtana. U infikovaných zvierat sa objavia symptómy podobné tým, ktoré sa vyskytujú pri prirodzenom priebehu ochorenia. Prvé klinické príznaky ochorenia sa objavia 20 hodín po infekcii a zaznamenávajú sa 7-10 dní. Infikované teľatá sa zvyčajne zotavia a zostávajú nosičmi vírusu.

Vírus je možné izolovať z nosovej dutiny, pošvy a spojovky od 5. do 10. dňa a neutralizačné protilátky - od 5. do 8. dňa po infekcii. Vyšší titer protilátok sa pozoruje po 35 dňoch, potom začína pomalý pokles.

Zistilo sa, že maximálne množstvo vírusu sa uvoľňuje počas zvýšenia telesnej teploty na 4. až 7. deň choroby a trvá až 10 až 14 dní.

Indikácia a identifikácia vírusu. Detekcia špecifických inklúznych teliesok. V jadrách epitelových buniek postihnutých slizníc nosovej dutiny, vulvy, vagíny a spojovky sa nachádzajú špecifické inklúzne telieska. 18-20 hodín po infekcii môžu byť detekované aj v bunkách infikovanej tkanivovej kultúry zafarbenej hematoxylínom-eozínom. Biotest.

Sérologická identifikácia

REEF. Technika jej nastavenia je rovnaká ako pri diagnostike adenovírusovej infekcie u hovädzieho dobytka. Dávajte pozor na žiaru antigénu v cytoplazme a perinukleárnej zóne intaktných buniek. Jasne zelená fluorescencia vo forme granúl alebo difúzna luminiscencia cytoplazmy v minimálne 10 % buniek nám umožňuje hodnotiť liek ako pozitívny. Predbežná diagnóza sa robí za prítomnosti aspoň 30 % pozitívnych liekov z celkového počtu vyšetrených vzoriek. V náteroch z vagíny a spojovky bola špecifická fluorescencia zaznamenaná po 24 hodinách, z predkožky - po 48 hodinách, z nosa a priedušnice - 72 hodín po infekcii. Prítomnosť špecifického antigénu môže byť potvrdená infekciou bunkovej kultúry teľacej obličky, v ktorej sa zistí špecifická perinukleárna a difúzna cytoplazmatická fluorescencia charakteristická pre infekciu rinotracheitídou. Použitie kultúry buniek králičích obličiek vám umožňuje zbaviť sa nešpecifickej luminiscencie.

Zhoda medzi výsledkami RIF a histopatologickými zmenami je 87 % a zhoda imunofluorescenčných a virologických štúdií je 44 %. V paralelnej štúdii sér v RN a RIGA sa výsledky zhodovali v 94 % prípadov.

V teréne sa RIF ukázal ako pozitívny v 18,5% a metóda izolácie vírusu - v 15,9% prípadov.

RIF teda možno použiť na rýchlu diagnostiku IRT s následným potvrdením diagnózy virologickými metódami.

RN. V prítomnosti CPE v bunkových kultúrach infikovaných izolátom a pozitívnej nmmunofluorescencii sa uskutoční konečná typizácia vírusu v RN. Špecifické a negatívne séra sa pred vytvrdnutím zriedia v pomere 1:10 Hankovým roztokom alebo živným médiom na kultiváciu buniek s obsahom angiotika a zahrievajú sa vo vodnom kúpeli 30 minút pri 56 °C. pH sa nastavuje konvenčnou metódou v primárnej kultúre PEC alebo transplantovanej bunkovej línie MDVK.

Výsledky RN zohľadňuje CPP vírusu, pre ktorý sa titer typizovaného izolátu stanovuje v prítomnosti špecifických a negatívnych (kontrolných) sér. Titer sa vypočíta podľa metódy Reeda a Mencha a vyjadrí sa v lg TCDso/ml.

Potom sa neutralizačný index (I) vypočíta pomocou vzorca I \u003d T 1: T 2,

kde Ti je titer izolátu v prítomnosti kontrolného séra; T 2 - titer izolátu v prítomnosti špecifického séra.

Druhová príslušnosť izolátu sa určí, keď rozdiel v titroch vírusu je aspoň 2 lg. Keď je neutralizačný index od 1 lg do 2 lg, reakcia sa považuje za pochybnú a v takom prípade sa opakuje. Neutralizačný index nižší ako 1 lg sa považuje za negatívny. Ak sú výsledky pH pozitívne, izolát sa považuje za plne identifikovaný.

Príprava hyperimúnneho séra na ROP. Hyperimúnne sérum neutralizujúce vírus sa pripraví podľa nasledujúcej schémy: králikom sa subkutánne podá 1 ml kultivovaného vírusu s Freundovým adjuvans, po ktorom nasledujú tri intravenózne injekcie vírusu v objeme 1 ml v intervale 7 dní. 10 dní po poslednej inokulácii vírusu sa králikom odoberie krv, sérum sa zmrazí a skladuje pri teplote mínus 30 °C.

RTGA. Mikrometódou ho dali pri 4 °C s 0,5 - 1 % suspenziou erytrocytov bielych myší, riedidlom je Tris tlmivý roztok s 0,2 % hovädzieho sérového albumínu. Ako antigén sa používa kultivačná vakcinovaná kvapalina, ktorá sa koncentruje PEG-6000 alebo ultracentrifugáciou.

Po detekcii hemaglutinačného činidla, stanovení jeho hemaglutinačného titra, sa pripravia 4 HAU a identifikuje sa v RTGA s referenčným pozitívnym sérom.

Imunoenzymatická identifikácia vírusu. Imunoperoxidázová metóda sa môže použiť na štúdium in vivo odobratých nosofaryngeálnych odtlačkov v bunkách získaných z pľúc

Okrem toho sa na laboratórnu identifikáciu vírusu RTI odporúča nepriama antikomplementárna imunoperoxidázová metóda (NAIP). Technika je nasledovná: na krycích sklíčkach, v skúmavkách, sa pripraví citlivá bunková kultúra na IRT vírus (PEC, TB atď.) podľa všeobecne uznávanej metódy. Monovrstva je infikovaná testovaným vírusom. Po 48 hodinách sa sklíčka s infikovanými bunkami odstránia, premyjú sa v roztoku fosfátového pufra s pH 7,2-7,4 a fixujú sa v chladenom acetóne počas 5-10 minút.

Na fixovanú bunkovú monovrstvu sa aplikujú 1-2 kvapky zmesi špecifického imunitného séra a komplementu z morčiat v riedení 1:10. Pred prácou sú antivírusové séra adsorbované skúmanými heterológnymi vírusmi, t. prijímať monoséra. Pri spracovaní kontrolných prípravkov sa na monovrstvu aplikuje zmes komplementu a normálneho séra.

Prípravky sa inkubujú vo vlhkej komore pri 37 °C počas 40-60 minút, potom sa premývajú tečúcou vodou počas 5-10 minút, mierne sa vysušia a ošetria peroxidázou značeným antikomplementárnym sérom (1-2 kvapky), vopred zriedeným 1: 20 s fosfátovým pufrom a opäť umiestnite liek na 40-60 minút do vlhkej komory pri 37 °C. Potom sa premyjú, sušia a na detekciu vytvoreného komplexu (antigén-protilátka-peroxidáza) sa na prípravok aplikuje na 40-60 minút benzidínové činidlo (50 mg benzidínu v 100 ml Tris-HCl-tlmivého roztoku s pH 6,8 s pridaním 6-7 kvapiek 3% peroxidu vodíka na každých 5 ml pracovného roztoku). Liečivo sa uchováva vo vlhkej komore, premyje sa v destilovanej vode, suší sa, upevňuje sa na podložné sklíčko a študuje sa vo svetelnom mikroskope pod ponornou šošovkou.

Nepriama antikomplementárna imunoperoxidázová metóda pomocou svetelnej mikroskopie poskytuje jasnú detekciu vírusového antigénu v cytoplazme infikovaných buniek vo forme zafarbenia Hnedá farbaútvary, ktoré sú viditeľné pri 140-násobnom zväčšení.

Špecifickosť ukazovateľov získaných touto metódou je potvrdená nastavením špeciálnych imunologických kontrol. Pri nastavení skríženej imunoperoxidázovej reakcie s heterológnymi protilátkami má táto reakcia výrazný druhovo špecifický charakter: antigén reaguje iba s homológnym sérom. Endogénna peroxidáza nebola detegovaná v PEC a LF bunkovej kultúre.

Nepriama antikomplementárna imunoperoxidázová metóda je perspektívna v diagnostike akútnych respiračných vírusových infekcií u hovädzieho dobytka.

Pri použití imunoperoxidázovej metódy na indikáciu vírusu RTI v bunkovej kultúre PEC sa antigén deteguje 18, 22 hodín po infekcii. Tri priame sérologické metódy na rýchlu detekciu vírusových antigénov (RIF, imunoperoxidáza a ELISA) sú rovnako použiteľné na detekciu vírusu počas horúčky, nie však v pokročilých štádiách ochorenia.

Vírusový antigén sa deteguje vo výteroch z nosa pomocou ELISA od 3. do 10. dňa po infekcii. Pri výplachoch spojoviek sa zisťuje na 5. deň.

Identifikáciavírus RTI reštrikčnou analýzou vírusovej DNA. Je opísaný spôsob klonovania fragmentov genómu vírusu RTI a izolácia a charakterizácia rekombinantnej DNA sondy, ktorá umožňuje detegovať vírus v klinických vzorkách. Pomocou metódy dot-blot hybridizácie bola DNA vírusu IRT detegovaná vo vzorkách spermií získaných od séropozitívnych zvierat, keď izolácia vírusu v bunkovej kultúre poskytla negatívny výsledok. Dobrý výsledok sa dosiahol aj pri použití infikovaných bunkových kultúr.

Sérodiagnostika a retrospektívna diagnostika. Protilátky proti vírusu RTI možno detegovať v krvných sérach chorých a zotavených zvierat v RN, RNGA atď. Na stanovenie retrospektívnej diagnózy sa používajú párové vzorky séra odoberané v intervaloch 3 týždňov. Výsledok sérodiagnostiky sa berie do úvahy zvýšením titra protilátok v párových vzorkách séra, ako aj počtom séropozitívnych zvierat v špecifikovanom intervale. Pred štúdiou sa séra zahrievajú vo vodnom kúpeli pri teplote 56 °C počas 30 minút.

RN. Stanovuje sa metódou riedenia testovacích sér konštantnou dávkou vírusu v bunkovej kultúre "PEK alebo TB. Vírus sa vopred titruje v bunkovej kultúre. Na tento účel sa suchý vírus RTI z diagnostickej súpravy sterilne zriedený v objeme uvedenom na štítku a pripravia sa z neho desaťnásobné riedenia od 10 - 1 do 10 -6 na živnom médiu (konečný titer suchého vírusu je uvedený na štítku).

Riedenie sa pripraví v celkovom objeme 5 ml, potom sa 4 skúmavky s bunkovou kultúrou vopred premytou z rastového média infikujú každým zriedením vírusu v objeme 1 ml. Infikované a kontrolné bunkové kultúry (4 až 6) sa inkubujú pri 37 °C, denne sa počíta CPE vírusu a nakoniec 5. až 7. deň.

Titer vírusu sa považuje za prevrátenú hodnotu jeho najvyššieho zriedenia, ktoré spôsobuje CPP v 50 % bunkových kultúr, ktorý sa vypočíta podľa metódy Reeda a Mencha alebo Kerbera a vyjadrí sa v TCD 50/ml. Titulky 1:32, 1:64 nájdete len zriedka. V stádach nepriaznivých pre toto ochorenie sú VNA zistené u 12 % klinicky zdravého dobytka. Retrospektívna diagnóza pre IRG sa robí so 4-násobným alebo väčším zvýšením AT vo vzorkách séra rekonvalescentov. V súčasnosti je široko používaná pH mikrometóda.

RNGA. Biologický priemysel našej krajiny produkuje diagnostikum erytrocytov. RNHA sa umiestni podľa pokynov do mikropanelov s jamkami v tvare U mikrotitračných súprav Takachi alebo Titertek podľa všeobecne uznávanej metódy. Výsledky RNGA s použitými sérami sú hodnotené titrami; pozitívne - 1:16 a vyššie, pochybné - 1:8, negatívne - 1:4, 1:2 a nula. Zvýšenie titrov protilátok v párových sérach 2-4 krát indikuje prítomnosť infekcie. Pomocou RNGA je možné detekovať AT vo viacerých skoré obdobie infekcia ako pri ROP. Zhoda výsledkov RNGA a RN bola stanovená v 95 % prípadov. Pomocou tejto reakcie je jednoduchšie a rýchlejšie ako RN vykonať typizáciu protilátok proti vírusu RTI. AT titre boli 7-10 krát vyššie ako tie, ktoré boli zistené v RN.

PRV. V diagnostickej praxi nenašiel široké uplatnenie, výskumníci ho odporúčajú používať pri sérodiagnostike RTI. Prítomnosťou PA je možné zachytiť nedávnu infekciu, pričom VNA cirkuluje v tele dlhodobo a ochorenie je možné zachytiť párovými sérami. Ak sa zistí PA, je lepšie odobrať krv 8. a ďalšie dni choroby.

RTGA. Môže sa použiť na detekciu a kvantifikáciu vírusu AT až RTI. Titer anti-HA koreluje s titrom VNA. Pozitívny výsledok RTGA už v 1. riedení séra (1:4) indikuje prítomnosť AT voči IRG vírusu v tejto vzorke séra. Štvornásobné alebo viacnásobné zvýšenie titrov anti-HA v párových vzorkách séra je indikátorom aktívnej infekcie.

ELISA. Široko používaný v Holandsku, USA, Veľkej Británii, Švédsku, krajinách bývalého ZSSR. Ukázalo sa, že je vhodný na detekciu AT na IRG vírus v mlieku. Na to stačí získať vzorky zmiešaného mlieka od 5-10 kráv. AT sa stanoví po predbežnej koncentrácii Ig v nich. Koincidencia týchto sérologických reakcií vo vzorkách krvného séra a mlieka bola 92,8 %. Pomocou tejto metódy je možné rýchlo zistiť imunologický stav dobytka laktujúcich kráv celého regiónu, ako aj vykonať prieskum vyvážaných a dovážaných zvierat. V Nemecku bola vyvinutá metóda TRACHITEST, ktorá sa používa na ELISA vzoriek odobratého mlieka z pórov za účelom diagnostiky latentných nosičov vírusov.

Na detekciu nedávnej infekcie RTI bola navrhnutá nepriama metóda IgM-ELISA. Včasné AT IgM izolované na 6. deň po infekcii, na 9. deň došlo k zvýšeniu titra AT Ig a na 13. deň - VNA. U teliat očkovaných inaktivovanou vakcínou nebola zaznamenaná skorá imunitná odpoveď – AT IgM neboli zistené a IgM a VNA sa objavili neskôr ako po infekcii. Treba však mať na pamäti, že prítomnosť reumatoidného faktora v sére hovädzieho dobytka môže viesť k falošne pozitívnym diagnostickým výsledkom v IgM-ELISA. V tomto prípade sa predúprava vzoriek séra anti-bovinným IgM vyhne falošne pozitívnym výsledkom. Test IgM-ELISA má veľkú hodnotu v diagnostike IRT, najmä u mladých zvierat. V skupine pozitívnych vzoriek séra bola korelácia medzi ELISA a RNHA 98,3 % a EL1SA s IF 95,7 %.

ELISApomocou monAT. Na základe konkurencie medzi AT hovädzieho séra a neutralizujúcimi myšacími mAb. Na jeho realizáciu sa jamky mikrotitračných panelov ošetria purifikovaným vírusom RTI a po vysušení sa môžu ihneď použiť alebo skladovať pri -20 °C. Neriedené testovacie sérum, IRT-špecifické mAb konjugované s peroxidázou, peroxidázový substrát sa postupne zavádzajú do jamiek panelov ošetrených vírusom. Výsledky reakcie sa berú do úvahy v spektrofotometri pri A405. V prípade pozitívnej reakcie je väzba mAb inhibovaná sérovým AT. Metóda sa ukázala byť oveľa citlivejšia a špecifickejšia ako ROP.

Laboratórna diagnostika rotavírusová infekcia dobytka

Rotavírusová infekcia (RVI) hovädzieho dobytka (hnačka novorodeneckých teliat) je akútne nákazlivé ochorenie novonarodených teliat, charakterizované léziami gastrointestinálneho traktu. Choroba je rozšírená vo všetkých geografických oblastiach zemegule. Prakticky to bolo evidované všade, kde sa výskum realizoval. Bolo dokázané široké rozšírenie rotavírusov (RV) u teliat medzi zvieratami odlišné typy a prítomnosť protilátok u hlodavcov (morčatá, potkany, škrečky, myši).

Na základe epizootologických, klinických a patoanatomických údajov sa stanoví predbežná diagnóza, konečná sa stanoví iba laboratórnymi metódami. Posledne menované sú založené na detekcii vírusu alebo vírusového AG vo výkaloch chorých teliat, črevnom obsahu a bunkách sliznice. tenké črevo uhynutých a násilne zabitých zvierat, ako aj o detekcii protilátok proti RV v krvných sérach chorých a uzdravených teliat a v krvných sérach a kolostre matiek kráv.

Expresné diagnostické metódy. Na detekciu špecifickej AH v RV hovädzieho dobytka bol vyvinutý testovací systém ELISA založený na prasačom RV, ktorý má vysokú citlivosť a špecifickosť. Je vhodné ho použiť v laboratóriu na expresnú diagnostiku. Pretože polypeptid VP5 obsahuje skríženú skupinu AG lokalizovanú v konzervovanej doméne, ktorá je spoločná pre všetky RV skupiny A. Bola preukázaná možnosť indikovania rota- a koronavírusov metódou fluorescenčných sond a protilátok proti nim. Je založená na registrácii skorých štádií interakcie vírusov s bunkovými receptormi.

Izolácia vírusu. Najmenej 10 vzoriek tekutého trusu, tenké črevo s obsahom (najneskôr 2-3 hodiny po uhynutí alebo nútenej porážke teliat), 10-15 vzoriek párových sér chorých a uzdravených zvierat, 6-10 vzoriek krvného séra kráv sa posiela do laboratória na výskum a 6-10 vzoriek kolostra. S najväčšou stálosťou je možné vírus detegovať vo vzorkách výkalov odobratých v prvých dňoch choroby, preto sú výkaly odobraté 2-14-dňovým teľatám s klinickými príznakmi hnačky v 1.-3. deň choroby vhodné na výskumu. Ihneď po dodaní do laboratória sa vzorky spracujú alebo skladujú pri teplote 4°C maximálne jeden deň, pri teplote -20-50°C až 1 mesiac. Krvné séra sa uchovávajú pri teplote 4-10 °C nie dlhšie ako 1 týždeň, pri -20 °C až 1 mesiac; kolostrum - pri 4 ° C nie viac ako 2 dni, pri -20 ° C - do 1 mesiaca. Pre virologické alebo elektrónové mikroskopické štúdie sa v Hankovom roztoku pripraví 10% suspenzia výkalov. Suspenzia sa homogenizuje a centrifuguje 1 hodinu pri 3 000 ot./min., supernatant sa prenesie do sterilnej liekovky, pridá sa penicilín a streptomycín (1 000 U/ml každý), udržiava sa 10-12 hodín (cez noc) pri 4 °C a preskúmaný.

Izolácia RS v bunkovej kultúre. Bola preukázaná korelácia medzi ochorením novonarodených teliat s hnačkou a prítomnosťou RV AG vo výkaloch. Treba mať na pamäti, že vírus sa nekultivuje konvenčnými metódami a použitie ďalších účinkov - chemických (trypsín) a fyzikálnych (centrifugácia vírusu na vrstve buniek) - dáva pozitívne výsledky pri vysokých koncentráciách vírusu. vo výkaloch, čo sa kontroluje elektrónovou mikroskopiou. Na tento účel sa obsah jednej skúmavky po zmrazení a rozmrazení a ošetrení polyetylénglykolom resuspenduje v 0,1 ml destilovanej vody a skúma sa v elektrónový mikroskop. V pozitívnom prípade sa nachádzajú typické častice RV a ich akumulácie. Špecifický charakter častíc je potvrdený imunoelektrónovou mikroskopiou.

Indikácia a identifikácia vírusu. EM a IEM. Metóda elektrónovej mikroskopie (EM) suspenzie vírusu z tekutej časti výkalov sa najčastejšie používa na diagnostiku infekcie, keď koncentrácia vírusu vo výkaloch nie je nižšia ako 10 4 -10 5 častíc/ml kvapalina. Prípravky sa pripravujú z tekutej časti výkalov vyčírenej nízkou centrifugáciou.Najlepšie prípravky však získame zriedením výkalov destilovanou vodou 1:1-1:10 a následným vyčírením suspenzie odstredením pri 4-10 tis. otáčok za minútu počas 15 minút. Jednoduchý spôsob prípravy preparátov z fekálií, ktorý nemá nižšiu citlivosť na ultracentrifugáciu, je nasledujúci. K 4 ml tekutej časti stolice vyčírenej nízkou centrifugáciou sa pridá 60 % nasýteného roztoku (NH 4) 2 SO 4, premieša sa, nechá sa 1 hodinu pri 4 °C a potom sa 10 minút odstreďuje pri 10 000 ot./min. Supernatant sa vypustí a zrazenina sa resuspenduje v 4 kvapkách destilovanej vody a pripravia sa prípravky. Existujú rôzne spôsoby a modifikácie prípravy prípravkov z. Metóda odkvapkávania je najpoužívanejšia. Je vhodnejšie použiť IEM. Na tento účel možno použiť séra z laboratórnych zvierat (králiky, morčatá), opíc imunizovaných RV alebo séra od rekonvalescentov. Obsah a špecifickosť protilátok v sére rekonvalescentov je možné skontrolovať v sérologických reakciách pomocou vírusu SA 11. Keď sa fekálna suspenzia ošetrí imúnnym sérom, ich špecifickosť sa stanoví súčasne s detekciou typických častíc RV, ako naznačuje identifikácia agregátov, v ktorých sú častice RV viazané špecifickými imunoglobulínmi. Najčastejšie sa používajú tri modifikácie imunoelektrónovej mikroskopie.

S pozitívnym výsledkom sa častice RV detegujú v prípravkoch vo forme špecifických akumulácií (imunitných komplexov). Špecifickosť reakcie sa hodnotí spočítaním počtu a veľkosti takýchto zhlukov, ako aj podľa stupňa pokrytia jednotlivých viriónov sérovým AT. Závažnosť tohto účinku s určitou zručnosťou možno posúdiť na škále konvenčných jednotiek od 0 do 4 plus.

AK. Priame a nepriame metódy boli úspešne použité na detekciu vírusového AG v zmrazených častiach tenkého čreva, fekálnych náteroch a bunkovej kultúre. Pri štúdiu kryosekcií čreva a náterov z trusu teliat sa najlepšie výsledky dosiahnu do 4-6 hodín po zistení príznakov hnačky. Epitelové bunky sa rýchlo deskvamujú z povrchu črevných klkov a sú odstránené s výkalmi. Fekálna suspenzia najčastejšie infikuje bunkovú kultúru a identifikuje vírusový AG v reakcii IF. Bola vyvinutá priama metóda IF v MDV bunkách infikovaných kultúrou alebo fekálnym vírusovým materiálom. Metodické odporúčania pre indikáciu RV u hovädzieho dobytka nepriamou metódou IF predpokladajú použitie diagnostickej súpravy, ktorá obsahuje špecifický antigén - kultivovanú suspenziu buniek PEC alebo MA-104 s obsahom vírusu; AH normálna - suspenzia neinfikovaných buniek PEC alebo MA-104; špecifické sérum získané hyperimunizáciou teliat, laboratórnych zvierat; normálne sérum zo zdravého dobytka neobsahujúce protilátky proti RV; protidruhové sérum proti bovinným globulínom konjugované s FITC (vyrobené Inštitútom epidemiológie a mikrobiológie pomenovaným po N. F. Gamaleya). NIF možno použiť na detekciu a identifikáciu RV AG v infikovaných bunkových kultúrach, výkaloch a črevách chorých a mŕtvych teliat na detekciu a kvantifikáciu protilátok proti RV.

PRV. Ide o jednoduchú a cenovo dostupnú metódu na zistenie RV AG v truse chorých teliat, črevnom obsahu a suspenzii črevnej sliznice uhynutých alebo násilne zabitých teliat. Za týmto účelom sa 20% suspenzia výkalov vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku zahrieva vo vodnom kúpeli pri 37 ° C počas 30 minút za občasného miešania. Potom centrifugujte 15 minút pri 8000 g. Supernatant sa prefiltruje cez filter Millipore a filtrát sa 25-krát skoncentruje pomocou dialyzačného koncentrátora. Ako výsledok všetkých krokov spracovania zodpovedá 0,2 ml koncentrátu 1 g fekálneho východiskového materiálu. Zdrojom špecifických protilátok sú séra rekonvalescentov po rotavírusovej gastroenteritíde, predtým testované v iných sérologických testoch.

RDP sa uskutočňuje v agarózovom géli na sklenených platniach s 0,9 % agarózou v tlmivom roztoku obsahujúcom 0,1 M NaCl, 0,01 M tris(hydroxymetyl)-aminometán a 0,001 M etyléndiamíntetraacetát. Reakčné zložky sa umiestnia do jamiek s priemerom 3 mm vyrezaných v agarózovej vrstve, vzdialených od seba 3 mm. Gélové platne sa nechajú cez noc pri teplote miestnosti, potom sa zohľadnia výsledky. Medzi jamkami s AG a AT v pozitívnych prípadoch sa vytvorí jedna jasná precipitačná línia. V RDP sa testuje AG - tekutá časť výkalov alebo supernatant po odstredení suspenzie výkalov alebo čriev, testovacie sérum zo získaných teliat, mledzivo a mlieko v prirodzenej forme (vo forme srvátky) po ošetrení syridlo.

Môže sa použiť imunoprecipitačná reakcia s farbením precipitátov fluorescenčnými protilátkami detekcia ľudskej RV a hnačky RV v stolici. Bola vyvinutá jeho zrýchlená modifikácia. Diagnostikum vrátane špecifického a normálneho AG, špecifického séra sa pripravuje metódou VIEV a ako normálne sérum sa používa fetálne sérum alebo sérum bezteliat. Reakcia sa hodnotí tvorbou charakteristických čiar zrazeniny.

RSK. Na detekciu hypertenzie sa používa menej často ako iné metódy. Je menej citlivá ako elektrónová mikroskopia a RIF, častejšie dáva falošne pozitívne výsledky v dôsledku antikomplementarity mnohých vzoriek stolice. Avšak pri spracovaní stolice komplementom, fetálnym sérom, freónom, purifikáciou PEG 6000 alebo ultracentrifugáciou nie je RSK nižšia v citlivosti na elektrónovú mikroskopiu. Reakcia je nastavená mikrometódou so špecifickým sérom alebo sérom nedávno uzdravených teliat, bez protilátok proti iným vírusom.

WIEF. Počas tejto reakcie sa vytvorí precipitačná línia medzi AG pohybujúcim sa smerom k anóde a AT pohybujúcim sa smerom ku katóde. Kvalita a čistota agarózy je hlavným faktorom pri získavaní reprodukovateľných výsledkov. Väčšina výskumníkov verí, že tento test je rovnako dobrý alebo dokonca lepší ako elektrónová mikroskopia.

VIEF bol navrhnutý na detekciu RV v stolici a patologickom materiáli a na detekciu protilátok v krvnom sére. Na výskum vezmite tekutú časť výkalov. Ak nestačí študovať tekutú časť, potom sa vzorky výkalov odstredia 10-15 minút pri 4 000 ot./min. pri 4-10°C. Skontrolujte supernatant. Črevá sa jemne rozdrvia, pridá sa rovnaký objem fyziologického roztoku, potom sa homogenizuje v trecej miske a skle, odstreďuje sa 10 až 15 minút pri 2 000 otáčkach za minútu pri 4 až 10 °C. V reakcii sa použije supernatant. VIEF vložte do 0,85 % roztoku agarózy, pripraveného v 0,5 M veronal-medinal pufri (pH 8,6).

ELISALE. Citlivosť je vyššia ako EI, IF, RSK, VIEF. Môže byť použitý v priamej a nepriamej verzii, ako aj na latex. Pomocou ELISA je možné zistiť RS vo výkaloch teliat riedením testovanej vzorky až do pomeru 1:5000. Je opísaná ELISA na tuhej fáze na typizáciu a podskupiny ľudských a zvieracích RV. Na tento účel sa používa IgG v koncentrácii 5 μg / ml; riedenie králičieho antiséra na hovädzí IgG až 1:400. Trvanie inkubácie IgG - 4 h, reakcia antiséra RV s IgG - 3 h, reakcia antiséra na RV s komplexom IgG - RV AG - 16 h, pre spojenie s konjugátom - 4 h, pre zmenu farby substrátu (P -nitrofenylfosfát) - 10 min. Pred štúdiou sa výkaly teliat 4-krát zriedia roztokom fosfátového tlmivého roztoku, vyčíria sa centrifugáciou a spracujú sa zmesou Tween-20 s azidom sodným. Indikácie ELISA sa v 100% prípadov zhodujú s výsledkami elektrónovej mikroskopie.

Na detekciu špecifickej AH v RV hovädzieho dobytka bol vyvinutý testovací systém ELISA založený na prasačom RV, ktorý má vysokú citlivosť a špecifickosť. V Ruskej federácii bol vyvinutý enzýmový imunotest, ktorý vyrába VIEV. Súprava obsahuje: špecifické lyofilizované RV AG - suspenzia obsahujúca vírus získaná na bunkovej kultúre MA-104, koncentrovaná PEG 6000 a centrifugovaná pri 6000 g, kontrolné AG, lyofilizované špecifické anti-rotavírusové sérum získané hyperimunizáciou teliat alebo králikov vírus purifikovaný v hustotnom gradiente chloridu rubídia; suché imunoglobulíny izolované z hyperimúnneho anti-rotavírusového séra vysolením nasýteným roztokom (NH4)2S04 a následnou iónovo-výmennou chromatografiou na kolóne s DEAE-celulózou.

Existuje množstvo ďalších metód na zisťovanie RV AG v stolici teliat s hnačkou: reverzná pasívna hemaglutinačná reakcia, imunoagregátová GA metóda, latexový aglutinačný test atď. králičie sérum pre teľatá RV. Metóda je založená na detekcii RS aglutinujúceho stafylokoka v 10% suspenzii vzoriek stolice na sklenených podložných sklíčkach so Staphylococcus aureus zaťaženým RS AT. Stafylokoky ošetrené neimúnnym králičím sérom slúžia ako kontrola. Aglutinácia je viditeľná pod mikroskopom za 2-3 minúty po kruhovom kývaní pohárom. Aby sa predišlo nešpecifickým reakciám, vykonáva sa predbežná úprava vzoriek stolice zahrievaním, filtráciou a N-acetylcysteínom. Takéto spracovanie neznižuje špecifickosť metódy. V porovnaní s ELISA sa táto metóda ukázala ako citlivejšia; jeho výhodami sú rýchlosť, jednoduchosť a nízka cena, čo je veľmi dôležité pre skríning veľkého množstva vzoriek výkalov.

Metóda latexovej aglutinácie pomocou komerčnej súpravy Rotalex na detekciu RV v stolici pacientov je rovnako špecifická a citlivá ako metódy elektrónovej mikroskopie, IF a ELISA. Na diferenciáciu podskupín a sérotypov izolátov RV je opísaný spôsob hybridizácie nukleových kyselín, elektroforéza v PAGE viriónovej RNA vírusov. Metóda bodovej hybridizácie je vysoko špecifická, deteguje 8 ng vírusovej RNA a je 10-100-krát citlivejšia ako ELISA.

Identifikácia variantu pomocou mAT. Prijaté MONAT na ks. RIT4237 (sérotyp I) hovädzí RV. Neutralizácia AG odhalila variabilnú špecifickosť voči skupinovým a podskupinovým determinantom. Použitie mAb proti podskupine hypertenzie v teste ELISA odhalilo dominanciu ľudského RV sérotypu II vo vzorkách stolice chorých detí. Prítomnosť takýchto protilátok zvyšuje citlivosť a špecifickosť testovacích systémov.

Sérodiagnostika a retrospektívna diagnostika. Sérologické vyšetrenie sér z teľacej krvi má veľmi obmedzenú hodnotu. Počas prvých týždňov života nie je možné zistiť zvýšenie AT, napriek prekonanému ochoreniu. Hladina humorálnych protilátok u dospelých zvierat neumožňuje predpovedať výskyt epizoocie v stáde.

RSK. Na diagnostiku RVI bola preukázaná možnosť nastavenia RSC pomocou párových sér získaných zvierat. V prvých dňoch ochorenia CSA u väčšiny zvierat chýba. Do 7. – 10. dňa sa ich hladina zvyšuje, maximum dosiahne do 21. dňa, potom dochádza k poklesu a na 30. – 35. deň dosiahne titer KSA nulu. RSC sa vkladá všeobecne uznávanou metódou v mikro- a makroobjemoch.

RTGA. Nastavte podľa štandardnej metódy používanej diagnostickými virologickými laboratóriami. Používajte sklenené skúmavky a bežné objemy činidiel alebo jednorazové plastové panely s jamkami a mikroobjemy činidiel. Na nastavenie reakcie sa používajú ľudské erytrocyty skupiny O alebo erytrocyty morčiat. Testované séra sa ošetria kaolínom a erytrocytovou hmotou (posledná pri použití ľudských erytrocytov). Všetky riedenia sa pripravujú vo fyziologickom soľnom roztoku s prídavkom 0,04 % hovädzieho sérového albumínu.

Nepriama IF, RN, metóda rádioimunologického testu nastaviť podľa všeobecne uznávaných metód.

Odlišná diagnóza. RVI u novorodených teliat treba odlíšiť od infekcie koronavírusom, kolibacilózy. Je potrebné vylúčiť dyspepsiu novonarodených teliat alimentárneho pôvodu. Na titráciu vírusov skupiny A boli vyvinuté metódy dot a blot hybridizácie RNA so sondami pre DNA genómového segmentu 4, získaného PCR amplifikáciou hyperdivergentných oblastí génu pre proteín VP4 (nukleotidy 211-686) na DNA ks. . IR, IND, NCDV a Cr s použitím oligonukleotidových primérov. Sondy 3 sú typovo špecifické (VP4) a nereagujú skrížene s 2-vláknovými RNA heterológnych P-typov RV.

Laboratórna diagnostikavírusová hnačka

dobytka

Vírusová hnačka - ochorenie slizníc (VD-BS) - infekčné nákazlivé ochorenie hovädzieho dobytka, hlavne mladých zvierat, charakterizované erozívnym a ulceróznym zápalom slizníc tráviaceho traktu, nádchou, zdurením lymfatických uzlín, vysokou horúčkou, celkovým depresia, leukopénia, pretrvávajúca alebo intermitentná hnačka, erozívna a ulcerózna stomatitída hojné slinenie, vzhľad mukopurulentných výtokov z nosnej dutiny. Kravy môžu potratiť. Prvýkrát, ako nezávislé ochorenie, bola VD-BS definovaná v štáte New York (USA) v roku 1946 počas vypuknutia akútneho, často smrteľného ochorenia hovädzieho dobytka, charakterizovaného hnačkou a erozívnymi léziami gastrointestinálneho traktu. V súčasnosti je VD-BS rozšírený na územiach mnohých krajín a spolu s ďalšími 2 pestivírusmi (MCSF a PBO vírus) infikuje 173 druhov domácich a voľne žijúcich prežúvavcov a 11 druhov ošípaných. Existujú publikácie o detekcii AT a AG pestivírusu u ľudí, ale možnosť infekcie sa len predpokladá.

Na základe rozdielov v klinických prejavoch sa vírusová hnačka a ochorenie slizníc hovädzieho dobytka spočiatku považovali za odlišné ochorenia. Neskôr na základe rozboru patologických zmien, čŕt epizootológie a klinických prejavov sa tieto 2 ochorenia začali označovať ako vírusové hnačky - ochorenie slizníc dobytka. . Keďže sa zistila identita pôvodcov týchto ochorení, považujú sa za jednu infekciu s rôznymi klinickými prejavmi, prevládajúcim rozvojom respiračného alebo hnačkového syndrómu, a preto sa ochorenie častejšie nazýva bovinná vírusová hnačka.

Ochorenie bolo zaregistrované vo všetkých krajinách sveta. V niektorých štátoch USA sa nachádza až 70-90% séropozitívnych zvierat.

Diagnóza sa robí na základe klinických, epidemiologických údajov a laboratórnych výskumných metód. Epizootologické údaje, symptómy ochorenia a povaha patologických zmien však dávajú dôvod len na podozrenie z ochorenia. Keďže VD-BS sa podobá mnohým iným ochoreniam (mor, infekčná ulcerózna stomatitída, plesňová stomatitída, PG-3, katarálna horúčka oviec, paratuberkulóza a alimentárne otravy), laboratórne testy sú v diagnostike kľúčové. Pri stanovení diagnózy VD-BS treba brať do úvahy: jednotlivé zvieratá vo veku 3-36 mesiacov ochorejú, typické klinické zmeny sa prejavujú léziami slizníc alebo krvavými hnačkami s eróziou slizníc alebo bez nej, všetky choré zvieratá uhynú v priebehu niekoľkých dní, u pacientov zvieratá nemajú špecifické protilátky v krvi, hoci zvyšok dobytka ich má vo vysokých titroch.

Laboratórna diagnostika VD-BS zahŕňa: 1) detekciu AH v patologickom materiáli (nátery, odtlačky, rezy) získanom od chorých zvierat v REEF; 2) vylúčenie patogénu z patologického materiálu v bunkovej kultúre TB, PEC alebo LEC, identifikácia v RN alebo RIF; 3) detekcia protilátok v krvnom sére chorých a uzdravených zvierat (retrospektívna diagnostika) v RSK a ROP.

Laboratórna diagnostika VD-BS sa vykonáva pomocou sady diagnostických súprav vyrábaných biologickým priemyslom. Vykonáva sa súbežne so štúdiom materiálu pre PG-3, adenovírus (adeno 1 a 2), MS a IRT.

Predbežná diagnóza VD-BS u hovädzieho dobytka sa robí na základe pozitívnych výsledkov detekcie AH v patologickom materiáli v IF a PCR, berúc do úvahy epizootologické a klinické údaje, ako aj patoanatomické zmeny. Konečná diagnóza sa robí na základe: zhody výsledkov IF s PCR, izolácie a identifikácie vírusu; zhoda výsledkov IF s detekciou AT v 30 % alebo viacerých druhých vzorkách párových sér v titroch nie nižších ako 1:4 v RSK a 1:16 v RN; detekcia 4-násobného alebo väčšieho zvýšenia AT v párových vzorkách séra. Predbežná diagnóza sa vykoná vo veterinárnych laboratóriách do 2-3 dní, konečná - do 30 dní.

Izolácia vírusu. Patologický materiál sa do laboratória posiela z chorých zvierat odobratých v prvých 2-3 dňoch s ťažkými príznakmi ochorenia alebo zo zvierat usmrtených na diagnostické účely v akútnom štádiu ochorenia. Od chorých zvierat sa odoberie 15 až 20 vzoriek nasledujúceho materiálu: výtery zo sliznice nosnej dutiny, získané zavedením sterilného tampónu z bavlnenej gázy alebo penovej gumy do nosových priechodov; odbery krvi v prvých 3 dňoch choroby a po 3 týždňoch od tých istých zvierat v súlade s pravidlami asepsie v sterilných skúmavkách s objemom 8-10 ml; zoškraby z ulcerovaných alebo erodovaných oblastí slizníc ústnej dutiny a nosového zrkadla, ktoré sa odoberajú tvrdými vatovými tampónmi alebo skalpelom. Tampóny s odpadovým materiálom sa umiestnia do sterilných penicilínových liekoviek alebo skúmaviek s 2-3 ml sterilného fyziologického roztoku alebo Hanksovho roztoku s obsahom 500-1000 IU/ml antibiotika (kanamycín, monomycín, neomycín, penicilín, streptomycín atď.). Po zrážaní sa 3-4 ml séra sterilne vypustí z krvi a doručí sa do laboratória.

Zo zvierat usmrtených na diagnostické účely odobrať v súlade s pravidlami asepsie kúsky pľúc s bronchom (na hranici postihnutej a zdravej oblasti), sleziny, mediastinálne, bronchiálne a mezenterické lymfatické uzliny, mandle, postihnuté oblasti slizníc nosnej a ústnej dutiny, priedušnica, gastrointestinálny trakt, ako aj vzorka krvi. Kusy materiálu s hmotnosťou do 20 g sa umiestnia do sterilnej, tesne uzavretej nádoby. Vírus je ľahšie izolovať na začiatku ochorenia a v období exacerbácie z krvi, pľúc, rôznych častí tenkého čreva (najmä z buniek sliznice dvanástnika, lymfatických uzlín a sleziny. V chronický priebeh ochorenia, môže byť pravidelne izolovaný z rôznych častí čreva, ale nie z krvi. Štúdium výterov z nosa a výkalov v týchto prípadoch tiež dáva negatívne výsledky, hoci v niektorých prípadoch bol vírus izolovaný z výkaly aj 5 mesiacov po chorobe.sodík alebo gelrin a vložte ich do termosky s ľadom.Vírus bol izolovaný z krvi experimentálne infikovaných zvierat od 1.-14.dňa po infekcii.Izolovaný bol aj z tkanív potratených resp. mŕtvo narodené plody, placenta a plodová voda.

Infekcia bunkových kultúr. Vírus je izolovaný v primárnych subkultúrach bovinných embryonálnych buniek (PEK, LEK, SEK) alebo TB. Izolát sa považuje za izolovaný, ak spôsobuje stabilný CPP rovnakého typu v najmenej 2 po sebe nasledujúcich pasážach. V tomto prípade je možná jeho identifikácia v RN. V primárnych kultúrach bovinných embryonálnych obličkových buniek sa prvé CPI detegujú 2–5 dní po inokulácii. Vyjadrujú sa vo vzhľade jemnozrnnej infiltrácie v bunkách fibroblastoidného typu. Ako infekcia postupuje, bunky sa postupne vylučujú z povrchu skla, ale niektoré zostávajú dlho a vytvárajú ostrovčeky buniek epiteloidného typu. Na skle nakoniec zostane len sieť zrnitého materiálu.

Pri použití sekundárnych bunkových kultúr sa cytopatické zmeny objavujú takmer súčasne vo všetkých bunkách monovrstvy a stávajú sa predĺženými, hranatými a javia sa ako prepletené. V zafarbených preparátoch bunkovej monovrstvy sa v prítomnosti cytopatických zmien nachádza vakuolizácia protoplazmy a zmeny v jadrách, ktoré sa prejavujú v kontrakcii membrány, pyknóze a karyorexii. V niektorých prípadoch je vakuolizácia taká výrazná, že sa pozoruje pod mikroskopom na nezafarbených prípravkoch. Vývoj CPI nezodpovedá zvýšeniu titra vírusu. Do 72-96 hodín po inokulácii, keď titre vírusu dosiahnu maximum (105,5 -106,5 TCD50), sa zaznamená len začiatok CPE. V neprítomnosti CPE v 3 po sebe idúcich pasážach buniek sa uskutoční 4. pasáž s pokusom detegovať vírus v monovrstvovej kultúre na krycích sklíčkach v IF. Pri negatívnej reakcii sa ďalší výskum zastaví. Negatívny výsledok v tomto prípade však nedáva právo na stanovenie diagnózy. Na identifikáciu takýchto kmeňov navrhujú japonskí vedci použiť fenomén exaltácie vírusu ND v prítomnosti patogénu VD-BS. Podstata metódy sa redukuje na výskyt CPI pri spoločnej kultivácii týchto látok v bunkových kultúrach semenníkov hovädzieho dobytka. Metodológia výskumu je nasledovná. Bunky testikulárneho tkaniva hovädzieho dobytka dispergované trypsínom sa suspendujú na koncentráciu 2106 buniek na 1 ml v 0,5 % roztoku GLAH s hovädzím sérom, testujú sa na neprítomnosť VNA na pôvodcu VD-BS. Suspenzia sa rozdelí do 0,5 ml skúmaviek. Každý z nich sa naočkuje 0,5 ml vírusového materiálu (riedený ID) a inkubuje sa pri 37 °C v naklonenej stacionárnej polohe. Ako kontrola sú do každého experimentu zahrnuté nenaočkované kultúry. Po 4 dňoch inkubácie sa kvapalina odstráni a kultúry sa infikujú vírusom ND (106 PFU v 0,5 ml média). Po ďalšej 3-dňovej inkubácii pri 37 °C sa kultúry skúmajú na prítomnosť CPE. V kultúrach pôvodne infikovaných necytopatogénnym kmeňom VD sa jasne exprimovaný CPI objaví po infekcii vírusom ND. V kontrolných kultúrach samotný ND vírus zvyčajne nespôsobuje CPI. Neinfikované kultúry, do ktorých nebolo podané žiadne z vírusových agensov, by mali zostať normálne.

Na pasážovanie necytopatogénnych kmeňov sa kultúry naočkované vírusom hnačky z každej pasáže inkubujú 3 dni pri 37 °C, potom sa odoberie kultivačná kvapalina, ktorá sa použije na ďalšie pasáže, a kultúry sa infikujú ND vírus a dodatočne inkubované na indikáciu VD pomocou fenoménu exaltácie.

Infekcia teliat. Biotest na teľatách sa vykonáva v prípadoch, keď boli pokusy o izoláciu špecifického vírusu neúspešné alebo existujú pochybnosti o jeho prítomnosti v dôsledku skutočnosti, že v infikovaných bunkových kultúrach nie je CPI. Použite teľatá vo veku 2-6 mesiacov, testované na absenciu VNA až VD, alebo teľatá vo veku 4-6 dní, získané z prosperujúcej farmy. Ako materiál na infekciu sa používa kultivačná kvapalina s 3-5 pasážami, z ktorých 5-10 ml sa podáva intravenózne. Ak je v testovanom materiáli vírus hnačky, teľatá na 4. až 7. deň po infekcii zaznamenajú zvýšenie teploty, leukopéniu, výskyt hlienových výtokov z nosnej dutiny a hnačku; niektoré zvieratá môžu mať tenesmus. V prípade pozitívneho výsledku u infikovaných zvierat sa vírus dá pomerne ľahko izolovať z krvi. V najvyššej koncentrácii (10 3 -10 5 ID 50 /ml) je vírus detegovaný 4 dni po infekcii, hoci jeho prítomnosť v krvi je potvrdená 15 dní.

Sérologická identifikácia.

AK. Podobne ako pri diagnostike adenovírusovej infekcie. Touto metódou sa VD AG zisťuje v bunkách sliznice rekta, sleziny, pľúc a lymfatických uzlín experimentálne infikovaných zvierat. Študovala sa distribúcia AH-VD-BS v tkanivách zvierat v akútnom a chronickom priebehu ochorenia. V lymfoidných tkanivách sa AG nachádza v bunkách fagocytárneho mononukleárneho systému. Medzi počiatočnou detekciou hypertenzie v črevnej sliznici, keratinizovaný epitel horné divízie tráviaceho systému a kože a progresie patologických znakov, dochádza k latentnému obdobiu.

IF bioptického materiálu slizníc ústnej a nosnej dutiny je vhodný na včasnú celoživotnú diagnostiku vírusu hnačky. IF na detekciu vírusu antigénu v bunkách z nazofaryngeálnych výterov - spoľahlivé a rýchly spôsob detekciu zvierat trvalo infikovaných vírusom. Pri štúdiu preparátov sa pozornosť venuje luminiscencii AG v cytoplazme nedeštruovaných buniek. Jasne zelená fluorescencia vo forme granúl alebo difúzna luminiscencia cytoplazmy v najmenej 10% buniek umožňuje hodnotiť liek ako pozitívny. Predbežná diagnóza sa robí za prítomnosti aspoň 30 % pozitívnych liekov z celkového počtu vyšetrených vzoriek. Nepriama metóda IF s použitím konjugovaných Pab fragmentov AB z hyperimúnneho prasačieho séra proti hovädziemu VD-BS sa ukázala ako vhodná. V cytoplazme buniek bola zistená špecifická fluorescencia vírusového AG v kultúre bovinných makrofágov. Na identifikáciu necytopatogénnych izolátov je metóda IF prakticky jediná. V prítomnosti CPE v bunkových kultúrach infikovaných izolátom a pozitívnej fluorescencii sa uskutoční konečná typizácia vírusu v RN.

RN. Toto je hlavná metóda identifikácie vírusu. Nové izoláty patogénu VB-BS, ktoré nemajú cytopatogénnu aktivitu, je možné identifikovať pomocou hyperimúnneho séra na vírus hnačky potlačením fenoménu exaltácie vírusu ND, ktorý sa používa na označenie takýchto kmeňov.

PRV. Poskytuje rýchlu a presnú diagnostiku, zatiaľ je však citlivosť metódy nízka a mala by sa používať v kombinácii s inými metódami laboratórnej diagnostiky a identifikácie patogénu. Príprava testovacieho AG a postup nastavenia PRV boli opísané vyššie. Antisérum na RDP sa pripravuje pre hovädzí dobytok. Na imunizáciu zvierat sa používa nitrovaná krv, ktorá sa asepticky odoberá experimentálne infikovaným zvieratám v období zvýšenia teploty. Krv sa podáva intravenózne (niektorým zvieratám sa podáva niekoľko takýchto injekcií). Krv sa odoberá 60-90 dní po očkovaní.

Detekcia vírusu PCR. Táto metóda sa odporúča na rýchlu diagnostiku VD-BS. Po reverznom transkripčnom cykle sa odoberú vzorky tkaniva z infikovanej bunkovej kultúry. podrobené amplifikácii s použitím primérov, ktoré zabezpečujú replikáciu špecifického segmentu génu gp48 VD proteínu. Na detekciu amplifikovaných sekvencií sa využíva elektroforéza v PAAG a hybridizácia s biotinylovanou DNA sondou na sekvenciu genómu vírusu leukémie. Pri identifikácii stád dojníc infikovaných bovinným VD-BS vírusom bola navrhnutá aj metóda PCR pre prácu so vzorkami mlieka. Vírusová DNA sa izoluje zo somatických buniek plnotučného mlieka extrakciou guanidín izotiokyanátom a fenol-chloroformom. Pri akútnej infekcii bola vírusová RNA detegovaná 6–10 dní po infekcii a pri chronickej infekcii s použitím oboch primérov (5'-nepreložená oblasť (S'-HT) a oblasť p80), kým sa mlieko nezriedilo 1:640. PCR bola 14,6-krát citlivejšia ako iné metódy izolácie vírusu. Na stanovenie VD RNA pomocou PCR je potrebných najmenej 580 somatických buniek, zatiaľ čo na izoláciu vírusu je potrebných najmenej 8500 buniek. PCR senzitivita a špecificita potvrdená Souzerenovou hybridizáciou . Citlivosť metódy prevyšuje citlivosť izolácie vírusu v bunkovej kultúre 102 -104 krát. Bola preukázaná možnosť detekcie perzistentnej bovinnej VD-BS infekcie DNA hybridizáciou a PCR.

Biotinylované cDNA sondy sú už široko používané na detekciu pestivírusov (CSV, bovinný VD-BS a PBO). V Belgicku bola vyvinutá metóda na detekciu špecifických protilátok proti VD pomocou ELISA vykonanej s rekombinantnými AG a mAb. ELISA s mAb je vhodná na detekciu virémie u zvierat; bol použitý na detekciu 2 príbuzných neštrukturálnych proteínov (p80K a p120-130K) v leukocytoch. Vírusový AG bol nájdený v B- a T-lymfocytoch, monocytoch. Okrem konvenčnej metódy ELISA bol navrhnutý enzýmový imunosorbentový test na zachytenie VD antigénov hovädzieho dobytka v lymfocytoch periférnej krvi hovädzieho dobytka. V reakcii na zachytenie AG sa mAb použijú na konzervovanú AG doménu neštrukturálneho proteínu (p125/p80) VD.

Okrem ELISA bola vyvinutá a navrhnutá metóda na interakciu špecifického antiséra s vírusovým antigénom VD v lymfocytoch infikovaných zvierat pomocou prietokovej cytometrie. Metóda sa vyznačuje vysokou citlivosťou a špecifickosťou. Na zvýšenie citlivosti reakcie sa lymfocyty fixujú, ich bunkové membrány sa solubilizujú a vírusový AG sa deteguje použitím biotinylovaného Ig z prasačieho antiséra, po čom nasleduje inkubácia s FITC konjugovaným s avidínom.

ELISA. ELISA uľahčuje identifikáciu bunkových kultúr infikovaných VD Identifikácia pomocou mAb nebola vyvinutá v praktických diagnostických aplikáciách. Proti bovinnému VD-BSV s VL aktivitou sa však získalo 5 mAb (XI A9, AEZE2, AM2G5, VT48, VT6G9), čo umožnilo rozdeliť izoláty VD do 4 skupín. Bol získaný a študovaný panel mAb proti Singerovu izolátu, pomocou ktorého sa polypeptidy mol.m. 56-58 kD a je dokázané, že glykoproteín je lokalizovaný na povrchu viriónov a je nosičom neutralizačných epitopov. Analýza s panelom mAb ukázala heterogenitu AH medzi izolátmi tohto vírusu.

Sérodiagnostika ochorenia je ťažká, pretože chronický priebeh Infekcie AT sa detegujú prerušovane a vyskytujú sa v nízkych titroch. Diagnóza prekonanej infekcie, ako aj latentného nosiča vírusu, sa zvyčajne robí pomocou pH v bunkovej kultúre, pričom sa určujú titre protilátok v sére rekonvalescentov. Na tento účel je lepšie skúmať párové séra odobraté v intervaloch 3-4 týždňov. Pri diagnostike latentného priebehu infekcie sa častejšie využívajú krvné séra zo zabitého dobytka, ktoré prichádzajú s klinikou nediagnostikovanej infekcie čriev a dýchacích ciest. Zvyčajne sa v takýchto prípadoch percento pozitívnych sér (titre od 1:16 do 1:128) značne líši a môže dosiahnuť 30-50 (niekedy až 80). U klinicky zdravých zvierat sa percento pozitívnych vzoriek môže pohybovať od 6-8 do 20-30. Dynamika výskytu a zániku titrov VNA nie je dobre pochopená. Pred štúdiou sa séra zahrievajú vo vodnom kúpeli pri teplote 57-58 °C počas 30 minút.

V USA bola vyvinutá rýchla kvantitatívna metóda na titráciu VD dobytka. Pozostáva z mikrotitrácie s použitím cytopatogénnych a necytopatogénnych izolátov vírusu a kontinuálnej bunkovej línie hovädzej obličky – MDVA. Na tento účel sa do jamiek doštičiek Terasaki nalejú sériové riedenia kvapaliny obsahujúcej vírus a suspenzie buniek v koncentrácii 1 až 105 v médiu s 2 % konského krvného séra a uskutoční sa mikrotitracia v NIF, ktorý sa berie do úvahy na dne jamiek platní pomocou objektívu mikroskopu ponoreného do vody. Vírus je tiež titrovaný tvorbou plakov. Špecifická fluorescencia v bunkách bola pozorovaná už 12 hodín po infekcii, konečné výsledky sa posudzovali po 72 hodinách inkubácie. Výsledky titrácie vírusu v plakoch a pri mikrotitráciách sa zhodovali. Vírusová mikrotitracia pomocou IF má oproti štandardnej metóde titrácie plakov množstvo výhod: vyžaduje menej času a materiálov a je obzvlášť nevyhnutná na titráciu necytopatogénnych izolátov VD.

RN. Stanovuje sa zriedením testovacích sér konštantnou dávkou štandardného vírusu v bunkovej kultúre PEC alebo TB. Séra s titrom AT 1:16 a vyšším sa považujú za pozitívne, v párových sérach - zvýšenie titra AT v druhej vzorke o faktor alebo viac. Počas experimentálnej infekcie u všetkých teliat po 15-61 dňoch bola VNA zistená v titri 1:64 - 1:1024. Reakcia, ktorej podstatou je potlačenie tvorby AT plakov v testovanom sére, sa ukázala ako vhodná pre sérologické štúdie vo VD-BS. Po získaní homogénnej vrstvy buniek sa kultúra 1 krát premyje fosfátovým tlmivým roztokom a infikuje sa 15 ml suspenzie vírusu v takom zriedení, že 1 ml obsahuje asi 20 PFU. Po adsorpcii vírusu pri 37 °C počas 30 minút sa sushi odsaje a nanesie na kultúru s 15 ml agaru. Po stuhnutí agaru sa na jeho povrch položia kruhy filtračného papiera nasýteného neriedeným testovacím sérom. Výsledky sa berú do úvahy po 4 dňoch inkubácie pri 37 °C. Dôkazom toho, že študované sérum obsahuje AT, je neprítomnosť poškodenia bunkovej vrstvy okolo kruhu ním nasýteného filtračného papiera, ktorý sa nachádza vo forme žila buniek.

RSK. Sú vložené mikrometódou pomocou mikrotitra Takachi alebo Titertek. V prípade ich neprítomnosti je možné nastaviť RSC do skúmaviek v celkovom objeme 0,5 ml.

PRV. Nenašiel široké uplatnenie vo veterinárnej diagnostickej praxi pri zisťovaní protilátok v sérach zvierat. PA sa objavuje relatívne neskoro (3-4 týždne) po infekcii a môže pretrvávať 4 mesiace (AT titre do 1:16).

ELISALE. 500-krát citlivejšie ako pH, menej časovo náročné a rýchlejšie dokončené. Ako AG sa použil vírus koncentrovaný s PEG a purifikovaný gradientovou rovnováhou ultracentrifugáciou. Optimálna koncentrácia AG bola 1 μg na jamku.

Odlišná diagnóza. Pri stanovení diagnózy VD-PS je potrebné vylúčiť RTI, adenovírusovú infekciu, PG-3, malígnu katarálnu horúčku, slintačku a krívačku, paratuberkulózne vredy atď. Vzhľadom na to, že VD-PS sa môže prejaviť rôznymi formy (od akútnych po latentné), je často spojená s infekciami ako PG-3, adenoinfekcia, chlamýdie a pod., pre konečnú diagnózu sú potrebné laboratórne vyšetrenia. Len ako podozrenie na VD-BS treba považovať rýchle šírenie choroby v stáde sprevádzané horúčkou, hnačkami, eróziami v ústnej dutine a včasnou leukopéniou.

Laboratórna diagnostika parainfluenzy -3 u hovädzieho dobytka

Parainfluenza-3 (PG-3) hovädzieho dobytka (prepravná horúčka dobytka, parainfluenza-3) je akútne nákazlivé vírusové ochorenie hlavne u teliat, charakterizované poškodením dýchacieho systému.

V súčasnosti je PG-3 registrovaný vo všetkých krajinách sveta s rozvinutým chovom zvierat.

Laboratórna diagnostika zahŕňa: a) detekciu AG v patologickom materiáli (nátery, odtlačky, rezy) získanom od chorých zvierat v REEF; b) izolácia patogénu z patologického materiálu v kultúre bovinných embryonálnych obličkových (ECK) alebo fetálnych bovinných pľúcnych (LEK) buniek a jeho identifikácia v RTHA, RIF atď.; c) detekcia protilátok v krvnom sére chorých a uzdravených zvierat (retrospektívna diagnostika) v RTGA. Laboratórna diagnostika PG-3 sa vykonáva pomocou sady diagnostických súprav vyrábaných biologickým priemyslom. Zvyčajne sa vykonáva súbežne so štúdiom materiálu pre adenovírusové a RS infekcie, IRT a VD-BS u hovädzieho dobytka. Schéma na vykonávanie výskumu PG 3 je podobná schéme na diagnostiku adenovírusovej infekcie u hovädzieho dobytka. Predbežná diagnóza: PG-3 je diagnostikovaná do 2-3 dní na základe pozitívnych výsledkov detekcie hypertenzie v patologickom materiáli v RIF, berúc do úvahy epizootologické a klinické údaje a aj patologické zmeny a konečné - do 10-30 dní na základe zhody výsledkov RIF s izoláciou a identifikáciou vírusu. V súčasnosti možno na rýchlu indikáciu vírusu PG-3 použiť PCR; d) detekcia 4-násobného alebo väčšieho zvýšenia AT v párových vzorkách séra.

Izolácia vírusov. Vzhľadom na nízku odolnosť vírusu parainfluenzy sa odporúča umiestniť testovaný materiál do nádob s obyčajným ľadom, ihneď ho dodať do laboratória a ihneď použiť na infikovanie bunkovej kultúry. Ak to nie je možné, materiál by mal byť zmrazený v zmesi suchého ľadu a alkoholu a skladovaný pri teplote -20-60°C až do vyšetrenia.

HSV-3 sa izoluje v primárnych bunkových subkultúrach PEC, LEC, PT, TB atď., ktoré sa pripravujú podľa všeobecne uznávanej metódy. Pre vírusy parainfluenzy je charakteristická difúzna povaha RAd, ktorá sa prejavuje skôr ako CPE vírusu.

Prvý CPI infikovanej kultúry možno niekedy pozorovať 48 hodín po inokulácii. Spočívajú vo vzhľade zaoblených buniek, ktoré silnejšie lámu svetlo, neskôr vzniká syncytium a degenerácia buniek. Ak je výsledok v prvej pasáži negatívny, vykoná sa druhá pasáž na rovnakom type bunkovej kultúry. Súbežne s kultúrami v skúmavkách sa pestuje aj na krycích sklíčkach pre IF. Celkovo sa odporúčajú aspoň 4 „slepé“ pasáže. Izolát sa považuje za izolovaný, ak indukuje stabilný CPP rovnakého typu a pozitívny GAD. V tomto prípade môže byť identifikovaný v RTGAd, RN, RTGA a iných reakciách. Metóda izolácie vírusu na embryách je menej citlivá ako infekcia bunkových kultúr a používa sa pomerne zriedka.

Infekcia prirodzene vnímavých zvierat. Aplikujte zriedkavo kvôli; vysoká cena a veľké ťažkosti pri výbere teliat vnímavých na PG-3, ktoré nemajú špecifické protilátky. Infekcia vnímavých zvierat vírusom PG-3 sa najlepšie aplikuje na sliznicu nosnej dutiny a priedušnice. Z experimentálne infikovaných teliat je možné vírus izolovať z výpotku nosovej dutiny pri zvýšení teploty alebo z krvi na 4. – 6. deň po intranazálnej aplikácii a na 2. deň po intravenóznej infekcii. Pri výdychu nosom sa vírus zvyčajne vylučuje od 2. do 10. dňa.

Indikácia a vírus. V bunkách HeLa a KB sa vírus množí menej aktívne ako v bunkách teľacích obličiek. V kultúre týchto buniek, ako aj buniek opičích obličiek, okrem syncýtia spôsobuje vírus tvorbu cytoplazmatických a niekedy aj intranukleárnych inklúzií. Nachádzajú sa aj v epitelových bunkách priedušiek a priedušiek.

Na urýchlenú indikáciu vírusov RTI sa stafylokoky PG-3 liečia imunitným sérom. Pripraví sa náter, na ktorý sa nanesie testovaný materiál s obsahom vírusu, ošetrí sa imunitným antivírusovým sérom a vírusovo špecifickým imunoglobulínom značeným FITC. Podľa špecifického lesku na povrchu stafylokoka je vírus indikovaný. Pri použití zrýchleného spôsobu indikácie sa doba indikácie skracuje na 3-4 hodiny.

Sérologická identifikácia

REEF. AG je v podstate lokalizovaný v cytoplazme buniek, avšak v skorých štádiách infekcie sa súčasne pozoruje luminiscencia jadierok. Hypertenzia parainfluenzy sa zisťuje v prvých dňoch choroby a až do 10-14 dní. Pri komplikovaných formách ochorenia sa hypertenzia zisťuje dlhší čas. V niektorých prípadoch sa dá zistiť aj počas inkubačnej doby, 1-2 dni pred nástupom klinických príznakov. Špecifickosť IF je 94 % v porovnaní s výsledkami sérologickej štúdie. O väčšej senzitivite IF v porovnaní s RGAD v indikácii vírusov parainfluenzy panuje jednoznačný názor, čo ho robí perspektívnym pre rýchlu diagnostiku.

RTGAd. Je to rýchla metóda na identifikáciu izolovaného vírusu. Na to sa používajú imúnne séra králikov alebo morčiat. RTGAd sa stanovuje všeobecne akceptovanou metódou s erytrocytmi morčiat. Skúmaný vírus sa považuje za identifikovaný, ak imunitné sérum na PG-3 blokuje hemadsorpciu.

RNGAad. Používa sa 100 GAd vírusových jednotiek. Podľa hemadsorpčnej reakcie môže byť vírus PG-3 titrovaný v tkanivovej kultúre s použitím sériových 10-násobných riedení, aby sa kultúra infikovala. Po 3 dňoch inkubácie sa umiestni RHAd s obsahom všetkých skúmaviek a zaznamená sa prítomnosť hemadsorpcie. Jedna jednotka GAd sa považuje za konečné riedenie vírusu, ktorý spôsobil hemadsorpciu. Pozitívny RGAd v kontrolných skúmavkách, neprítomnosť reakcie v skúmavkách so zmesou vírusu a séra indikuje identitu izolovaného vírusu s týmto typom séra.

RTGA. Používa sa na typizáciu izolovaného vírusu v prítomnosti hemaglutinínu v tekutej frakcii infikovaných bunkových kultúr v titri dostatočnom na výber 4 HAU. Treba mať na pamäti, že vírus parainfluenzy pestovaný v kultúre buniek obličiek hovädzieho dobytka aglutinuje erytrocyty husí, moriek a morčiat, na rozdiel od erytrocytov kurčiat a kačíc. Aglutinácia sa vyvíja v nasledujúcich termínoch: husacie erytrocyty za 1-3 minúty, morky za 2-5 minút, morčatá za 60-90 minút. Najvyššie a najstabilnejšie titre sa detegujú s morčacími erytrocytmi a pri hodnotách pH: husacie erytrocyty pri 5,7; morka 5,7-7,2; morča 6,8-7,2. Imunitné séra používané v RTGA musia byť zbavené termolabilných a termostabilných inhibítorov, na tento účel sa séra zahrievajú na 56 °C počas 30 minút a spracujú sa kaolínom alebo filtrátom Vibrio cholerae. RTGA sa nastavuje všeobecne akceptovanou metódou.

Identifikácia ELISA. Zamestnanci VNITIBP vyvinuli metódu na identifikáciu vírusu PG-3 v ELISA.

Imunodifúzia (ID) môže byť úspešne použitá na diagnostiku infekcie PG-3. ID odhalilo 2 línie zrážok, čo zodpovedá 2. AG PG-3.

Sérodiagnostika a retrospektívna diagnostika. Pri sérologickej diagnostike PG-3 u hovädzieho dobytka sa vyšetrujú párové séra teliat alebo dospelých zvierat, aby sa zistilo zvýšenie protilátok. Interval medzi odbermi vzoriek je 2-3 týždne. RGA, RN, RZGAd a RSK poskytujú vo všeobecnosti identické výsledky pri štúdiu protilátok počas vývoja ochorenia a rekonvalescencie. RTGA je však najcitlivejší a najjednoduchší. Okrem štúdie párových krvných sér sa pri sérodiagnostike PG-3 odporúča metóda na detekciu sekrečných protilátok pri RTHA. Na tento účel odoberte párové vzorky nazálnych sekrétov od 8-10 zvierat, ktoré vykazovali klinické príznaky ochorenia (horúčka, výtok z nosovej dutiny atď.), a po 6-8 dňoch štúdiu zopakujte.

Pred RTGA sa vzorky rozmrazia, 10 minút centrifugujú pri 2000 min-1, potom sa spracujú nasledovne: 0,2 ml 20 % suspenzie erytrocytov morčiat sa pridá k 0,2 ml supernatantu, pretrepe sa a inkubuje sa 30 minút pri 4 °C, 10 minút odstreďovanie pri 1500 min-1; supernatant v objeme 0,3 ml sa zmieša s 25% suspenziou kaolínu vo fyziologickom roztoku, pretrepáva 25 minút, 15 minút centrifuguje pri 2000 min-1. Potom sa supernatant použije v RTGA.

Pozitívny výsledok štúdie na PG-3 sa považuje v prípade zistenia AT v 2. vzorke nazálneho sekrétu v titri 1:16 a viac (pri absencii titrov AT v 1. vzorke) alebo 4. -násobné alebo väčšie zvýšenie titra AT v 2. vzorke nazálnych sekrétov v porovnaní s 1. vzorkou.

Ak je RNGAd pozitívny v kontrolách vírusu (skúmavky s bunkovou kultúrou, kde bol vírus zavedený v pracovnom riedení s rovnakým objemom živného média), jeho neprítomnosť v skúmavkách, kde je zmes jedného alebo druhého riedenia sérum a vírus sa nalial, sa berie do úvahy. Diagnostické nie je menšie ako 4-násobné zvýšenie neutralizujúcich hemadsorpčných protilátok v rekonvalescentnom sére v porovnaní so sérom odobratým na začiatku ochorenia. RSK nenašiel široké uplatnenie vo veterinárnej diagnostickej praxi.

Maximálne obdobie detekcie protilátok v krvnom sére teliat po infekcii vírusom PG-3 nebolo presne stanovené. Mnohí vedci sa domnievajú, že protilátky pretrvávajú 4-6 mesiacov. Úroveň tvorby VNA a anti-HA dosiahla vrchol 1:320 a vyššiu 14-21 dní po infekcii. ELISA je v zahraničí široko používaná na indikáciu a titráciu protilátok. Je 4-64 krát citlivejší ako RTGA.

Odlišná diagnóza. Pri stanovení diagnózy PG-3 je potrebné vylúčiť RTI, VD-BS, adeno- a RS-infekcie, ktoré majú veľmi podobné epizootologické, klinické a patologické údaje. Preto sa materiál prijatý s podozrením na PG-3 paralelne v laboratóriu vyšetruje na všetky vyššie uvedené infekcie.

laboratórium diagnóza leukémie

Bovinná leukémia je chronické infekčné ochorenie nádorového charakteru, ktorého hlavným príznakom je zhubné množenie buniek krvotvorných orgánov s porušením ich dozrievania, následkom čoho dochádza k difúznej infiltrácii orgánov týmito bunkami alebo sa objavujú nádory.

Zvieracie leukémie sú diagnostikované takmer vo všetkých krajinách sveta. Najrozšírenejšie sú v Spojených štátoch amerických, mnohých krajinách strednej Európy, Dánsku, Švédsku a krajinách Blízkeho východu.

U nás je výskyt leukémie spojený s dovozom plemenných zvierat v rokoch 1940, 1945-1947. z Nemecka na farmy západnej Sibíri, Moskvy, Leningradu, Kaliningradskej oblasti, ako aj Ukrajiny, Lotyšska a Litvy. Následne sa leukémia rozšírila do Tadžikistanu, Pskova, Novgorodu.

V prírodných podmienkach sa VLKRS bežne vyskytuje u hovädzieho dobytka, oviec, zebu a byvolov.

Vírus bovinnej leukémie (BLV) patrí do čeľade Retroviridae, rodu retrovírusov bovinnej leukémie a ľudskej T-bunkovej leukémie. VLKRS má výraznú antigénnu aktivitu a indukuje syntézu VNA a KSA. vlastnosti GA. VLKRS aglutinuje iba myšie erytrocyty

Diagnóza leukémie sa robí na základe epidemiologických údajov, klinických príznakov, patologických zmien a laboratórnych výsledkov, ktoré zahŕňajú hematologické a histologické, ako aj sérologické štúdie.

Hlavné charakteristiky niektorých retrovírusov

Všetky formy leukémie sú charakterizované nárastom lymfatických uzlín rôzneho stupňa. Pri lymfocytárnej leukémii sú rovnomerne zväčšené, nie sú spojené s okolitými tkanivami, kapsula sa ľahko odstráni, na reze sú uzliny sivobiele, šťavnaté a mastné. Lymfatické uzliny s lymfogranulomatózou, lymfosarkómom a histiocytovým sarkómom sú tuberózne, puzdro je zrastené s parenchýmom, na reze sa často nachádzajú krvácania a nekrózy; v orgánoch brušnej dutiny, panvových dutín, na seróznych membránach sú zaznamenané nádorové rasty uzlín vo forme šedo-bielych, žlto-sivých konglomerátov. Slezina je zväčšená pri lymfoidnej a myeloidnej leukémii. Pri prvých 2 formách je hnedočervenej farby s výraznou červeno-bielou dužinou v dôsledku folikulárnej hyperplázie. V neskoršom štádiu ochorenia sa hranica medzi bielou a červenou buničinou vymaže. Pri myeloidnej leukémii má slezina červeno-karmínovú farbu, folikuly sú zle viditeľné a v niektorých oblastiach chýbajú, tkanivo je uvoľnené v konzistencii s krvácaním. Pri lymforetikulosarkóme nie je slezina zväčšená. Pri všetkých formách leukémie sú ložiskové alebo difúzne výrastky šedo-bielej alebo šedo-ružovej farby zaznamenané v pečeni, obličkách, hrubšom srdcovom svale, tráviacich orgánoch, maternici, kostrovom svalstve, bránici a iných orgánoch.

Odber a príprava materiálu. Na hematologické vyšetrenie sa odoberá krv z dočasnej žily do skúmaviek s antikoagulantom - 10% roztokom disodnej soli kyseliny etyléndiamíntetraoctovej (EDTA, Trilon B) v množstve 0,02 ml roztoku na 1 ml krvi. Nie je dovolené odoberať krv zvieratám 15 dní pred otelením a 15 dní po ňom. Na sérologické vyšetrenie sa krv odoberá zvieratám vo veku 6 mesiacov a starším. 5-6 ml séra sa posiela do laboratória v termoske s ľadom. Na histologické vyšetrenie sa kúsky postihnutých orgánov (slezina, lymfatické uzliny, hrudná kosť, pečeň, obličky, pľúca, srdce a pravá ušnica srdcového svalu, stena slezu, maternica a kostrové svalstvo) posielajú čerstvé v termoske s ľadom alebo v 10 % r -re formalínu.