Reverse transcriptaza (reversază sau ADN polimerază dependentă de ARN) este o enzimă care catalizează sinteza ADN-ului pe o matriță de ARN într-un proces numit „ transcriere inversă”. Numele procesului reflectă opusul procesului transcrieri efectuat în cealaltă direcție: o transcriere de ARN este sintetizată dintr-o moleculă șablon de ADN.
Aceste enzime au fost izolate din virusurile ARN ( retrovirusuri). Transcriptaza inversă este utilizată de virusurile tumorale pentru a transcrie ARNm într-o catenă complementară de ADN. La studierea retrovirusurilor, al căror genom este reprezentat de molecule de ARN monocatenar, s-a constatat că, în procesul de dezvoltare intracelulară, un retrovirus trece prin etapa de integrare a genomului său sub formă de ADN dublu catenar în cromozomii lui. celula gazdă. În 1964, Temin a prezentat o ipoteză despre existența unei enzime specifice virusului, capabilă să sintetizeze ADN complementar pe un șablon de ARN. Eforturile care vizează izolarea unei astfel de enzime au fost încununate cu succes, iar în 1970 Temin și Mizutani, precum și Baltimore independent de ei, au descoperit enzima dorită într-un preparat de virioni extracelular al virusului sarcomului Rous. Această ADN polimerază dependentă de ARN se numește revers transcriptază sau revertază.
Revertaza retrovirusurilor aviare a fost studiată în cel mai detaliu. Fiecare virion conține aproximativ 50 de molecule din această enzimă. Reverse transcriptaza constă din două subunități - a (65 kDa) și b (95 kDa), prezente în cantități echimolare. Reverse transcriptaza are macar, Trei activitati enzimatice:
1) ADN polimeraza, folosind atât ARN, cât și ADN ca șablon;
2) activitatea RNazei H, care hidrolizează ARN-ul ca parte a unui hibrid ARN-ADN;
3) Activitatea ADN-endonucleazei.
Primele două activități sunt necesare pentru sinteza ADN-ului viral, iar endonucleaza pare a fi importantă pentru integrarea ADN-ului viral în genomul celulei gazdă. Transcriptaza inversă purificată sintetizează ADN-ul atât pe șablonele ARN, cât și pe ADN (Fig. 11).
Orez. 11. Schema pentru sinteza copiilor dublu catenar ale moleculelor de ARN
Pentru a începe sinteza, reversază, ca și alte polimeraze, are nevoie de o regiune dublu catenară scurtă (amors). Primerul poate fi un segment monocatenar atât al ARN-ului, cât și al ADN-ului, care în cursul reacției se leagă covalent de catena de ADN nou sintetizată. În inginerie genetică, sunt utilizați atât primeri oligo-(dT) complementari capetelor 3’-poliA ale ARNm, cât și un set de hexanucleotide „aleatorie” în compoziție și secvență (primeri aleatorii). Adesea pentru moleculele de ARN cu o secvență primară cunoscută care nu au capete 3’-poli (A), utilizați oligonucleotide sintetizate chimic complementare capătului de 3"
Reverse transcriptaza este utilizată în principal pentru a transcrie ARN mesager în ADN complementar (ADNc). Reacția de transcripție inversă este efectuată în condiții special selectate folosind inhibitori puternici ai activității RNazei. În acest caz, este posibil să se obțină copii ADN cu lungime completă ale moleculelor de ARN țintă. După sinteza pe ARNm a catenei complementare de ADN și distrugerea ARN-ului (de obicei se folosește tratamentul alcalin), a doua catenă de ADN este sintetizată. În acest caz, este utilizată capacitatea revertazei de a forma agrafe de păr auto-complementare la capetele 3’ ale ADNc monocatenar, care poate acționa ca primer.
Șablonul este prima catenă de ADNc. Această reacție poate fi catalizată atât de revertază, cât și de ADN polimeraza I de E. coli. S-a demonstrat că combinația acestor două enzime face posibilă creșterea randamentului moleculelor complete de ADNc dublu catenar. După terminarea sintezei, prima și a doua catenă de ADNc rămân legate covalent printr-o buclă în ac de păr, care a servit ca primer în sinteza celei de-a doua catene. Această buclă este scindată cu endonuclează S1, care distruge în mod specific regiunile monocatenar. acizi nucleici. Capetele rezultate nu sunt întotdeauna tocite și pentru a crește eficiența clonării ulterioare, ele sunt reparate pentru a se toci folosind fragmentul Klenow al ADN polimerazei I de E. coli. ADNc-ul dublu catenar rezultat poate fi apoi inserat în vectori de donare, propagat ca molecule de ADN hibrid și utilizat pentru cercetări ulterioare.
Se numește astfel deoarece majoritatea proceselor de transcripție în organismele vii au loc într-o direcție diferită, și anume, un transcript de ARN este sintetizat dintr-o moleculă de ADN.
Poveste
Reverse transcriptaza a fost descoperită de Howard Temin la Universitatea din Wisconsin-Madison și independent de David Baltimore în 1970. Ambii cercetători au împărțit Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicină în 1975 cu Renato Dulbecco.
Acuratețea transcripției
Transcripția inversă de la ARN la ADN este însoțită de nivel inalt erori de traducere, aceasta distinge transcriptaza inversă de alte ADN polimeraze. Aceste erori pot duce la mutații responsabile pentru rezistența la medicamente a virusurilor.
Semnificație pentru viruși
Transcrierea inversă este necesară, în special, pentru implementare ciclu de viață retrovirusuri, cum ar fi virușii imunodeficienței umane și limfomul cu celule T umane tipurile 1 și 2. După ce ARN-ul viral intră în celulă, transcriptaza inversă conținută în particulele virale sintetizează ADN-ul său complementar, iar apoi, pe această catenă de ADN, ca pe o matrice, completează a doua catenă.
Semnificație pentru eucariote
Aplicație
Terapia antiretrovirală
Rolul în ingineria genetică
În inginerie genetică, transcriptaza inversă este utilizată pentru a produce ADNc, o copie a unei gene eucariote care nu conține introni. Pentru a face acest lucru, ARNm matur (codând pentru produsul genetic corespunzător: proteină, ARN) este izolat din organism și se realizează transcripția inversă cu acesta ca șablon. ADNc-ul rezultat poate fi transformat în celule bacteriene pentru a obține un produs transgenic.
Vezi si
Scrieți o recenzie la articolul „Reverse transcriptase”
Note
Un fragment care caracterizează transcriptaza inversă
- O! despre! despre!- Ei bine, la revedere, Bolkonsky! La revedere, prințe; vino la cină mai devreme, - urmară voci. - Avem grijă de tine.
„Încercați pe cât posibil să lăudați ordinea în livrarea proviziilor și a rutelor când vorbiți cu împăratul”, a spus Bilibin, escortându-l pe Bolkonsky pe front.
„Și aș vrea să laud, dar nu pot, din câte știu”, a răspuns Bolkonsky zâmbind.
Ei bine, vorbește cât poți de mult. Pasiunea lui este publicul; dar nu-i place să vorbească și nu știe cum, după cum veți vedea.
La ieșire, împăratul Franz s-a uitat doar cu atenție la fața prințului Andrei, care stătea în locul stabilit între ofițerii austrieci, și dădu din cap spre el. Dar, după ce a părăsit aripa de adjutant de ieri, i-a transmis cu curtență lui Bolkonsky dorința împăratului de a-i oferi audiență.
Împăratul Franz l-a primit, stând în mijlocul încăperii. Înainte de a începe conversația, prințul Andrei a fost uimit de faptul că împăratul părea derutat, neștiind ce să spună, și a roșit.
„Spune-mi, când a început bătălia?” întrebă el în grabă.
a răspuns prințul Andrew. După această întrebare, au urmat alte întrebări la fel de simple: „Este sănătos Kutuzov? cu cât timp în urmă a părăsit Krems?” etc.. Împăratul vorbea cu o asemenea expresie de parcă tot scopul lui ar fi fost doar să pună un anumit număr de întrebări. Răspunsurile la aceste întrebări, pentru că era prea evident, nu l-au putut interesa.
La ce oră a început bătălia? întrebă împăratul.
„Nu pot să-i spun Majestății voastre la ce oră a început bătălia de pe front, dar în Dürenstein, unde mă aflam, armata a lansat un atac la ora 6 seara”, a spus Bolkonsky, însuflețit și în același timp. timp presupunând că va putea prezenta ceea ce era deja gata în capul lui o descriere adevărată a tot ceea ce știa și vedea.
Dar împăratul a zâmbit și l-a întrerupt:
- Câte mile?
„De unde și până unde, Maiestate?”
– De la Dürenstein la Krems?
— La trei mile și jumătate, Maiestate.
Au părăsit francezii malul stâng?
- După cum au relatat cercetașii, ultimii au traversat pe plute noaptea.
– Există suficient furaje în Krems?
- Furajul nu a fost livrat în acea cantitate...
l-a întrerupt împăratul.
„La ce oră a fost ucis generalul Schmit?”
„Cred că la ora șapte.
- La 7:00. Foarte trist! Foarte trist!
Împăratul a spus că este recunoscător și s-a înclinat. Prințul Andrei a ieșit și a fost imediat înconjurat din toate părțile de curteni. Ochi afectuosi l-au privit din toate partile si s-au auzit cuvinte afectuoase. Aripa de adjutant de ieri i-a reproșat că nu s-a oprit la palat și i-a oferit casa lui. Ministrul de Război s-a apropiat de el, felicitându-l pentru Ordinul Maria Tereza de gradul III, pe care împăratul i-l dăruise. Camerelul împărătesei l-a invitat la maiestatea sa. Arhiducesa a vrut să-l vadă și ea. Nu știa cui să răspundă și pentru câteva secunde își aduna gândurile. Trimisul rus l-a luat de umăr, l-a condus la fereastră și a început să vorbească cu el.
Contrar spuselor lui Bilibin, vestea adusă de acesta a fost primită cu bucurie. A fost programată o slujbă de mulțumire. Kutuzov a fost distins cu Marea Cruce de către Maria Tereza și întreaga armată a primit decorații. Bolkonsky a primit invitații din toate părțile și a trebuit să facă vizite la principalii demnitari ai Austriei toată dimineața. După ce și-a încheiat vizitele la ora cinci seara, compunând mental o scrisoare către tatăl său despre bătălie și despre călătoria sa la Brunn, prințul Andrei s-a întors acasă la Bilibin. Pe pridvorul casei ocupate de Bilibin, era o britzka pe jumătate strânsă cu lucruri, iar Franz, servitorul lui Bilibin, târând cu greu valiza, ieși pe uşă.
La studierea retrovirusurilor, al căror genom este reprezentat de molecule de ARN monocatenar, s-a constatat că în procesul de dezvoltare intracelulară trec prin etapa de integrare a genomului lor sub formă de ADN dublu catenar în cromozomii gazdei. celulă. În 1964, X. Temin a prezentat o ipoteză despre existența unei enzime specifice virusului capabilă să sintetizeze ADN complementar pe o matriță de ARN. În 1970, X. Temin și S. Mizutani, precum și în mod independent D. Baltimore, au descoperit o astfel de enzimă într-un preparat de virioni extracelular al virusului sarcomului Rous. Această ADN polimerază dependentă de ARN se numește transcriptază inversă (reverse transcriptază).
Revertaza retrovirusurilor aviare a fost studiată în cel mai detaliu. Fiecare virion conține aproximativ 50 de molecule din această enzimă. Reverse transcriptaza constă din două subunități, ά (65 kDa) și β (95 kDa), prezente în cantități echimolare. Subunitatea ά este porțiunea N-terminală (două treimi) a subunității β.
Reverse transcriptaza are cel puțin trei activități enzimatice:
ADN polimeraza, folosind atât ARN, cât și ADN ca șablon;
activitatea RNazei H, care hidrolizează ARN în hibridul ARN-ADN, dar nu ARN monocatenar sau dublu;
ADN-endonucleaza.
Primele două activități sunt necesare pentru sinteza ADN-ului viral, iar endonucleaza pare a fi importantă pentru integrarea ADN-ului viral în genomul celulei gazdă. Subunitatea β a revertazei are toate cele trei activități, în timp ce subunitatea ά are doar polimerază și RNază H.
Transcriptaza inversă purificată sintetizează ADN-ul atât pe șablonele ARN, cât și pe ADN. Pentru a începe sinteza, reversază, ca și alte polimeraze, are nevoie de o regiune dublu catenară scurtă - un primer. Primerul poate fi un segment monocatenar atât al ARN-ului, cât și al ADN-ului, care în cursul reacției se leagă covalent de catena de ADN nou sintetizată.
Reverse transcriptaza este utilizată în mod predominant pentru a transcrie ARN mesager în ADN complementar (ADNc). Reacția de transcripție inversă este efectuată în prezența unor inhibitori puternici ai activității RNazei. În acest caz, este posibil să se obțină copii ADN cu lungime completă ale moleculelor de ARN țintă. Oligo(dT) este folosit ca primer pentru transcrierea inversă a ARNm care conține poli(A) (Fig.) și pentru moleculele de ARN care nu au capete poli(A) de 3", oligonucleotide sintetizate chimic complementare capătului de 3" ARN studiat. În plus, cel din urmă tip de molecule de ARN pot fi convertite în molecule care conțin poli(A) folosind polimeraza poli(A) de E. coli.
După sinteza pe ARNm a catenei complementare de ADN și distrugerea ARN-ului (de obicei se folosește tratamentul alcalin), a doua catenă de ADN este sintetizată. În acest caz, se folosește capacitatea revertazei de a forma agrafe de păr auto-complementare la capetele de 3" ale ADNc monocatenar, care poate acționa ca primer. Prima catenă de ADNc servește ca șablon. Această reacție poate fi catalizată atât de reversază, cât și de ADN polimeraza E. coli I. Combinația acestor două enzime permite creșterea randamentului moleculelor de ADNc dublu catenar cu drepturi depline.
După terminarea sintezei, prima și a doua catenă de ADNc rămân legate covalent printr-o buclă în ac de păr, care a servit ca primer în sinteza celei de-a doua catene. Această buclă este scindată cu endonuclează S1, care distruge în mod specific regiunile monocatenar ale acizilor nucleici. Capetele rezultate nu sunt întotdeauna tocite și pentru a crește eficiența clonării ulterioare, ele sunt reparate pentru a se toci folosind fragmentul Klenow al ADN polimerazei I de E. coli. ADNc-ul dublu catenar rezultat poate fi apoi inserat în vectori de donare, propagat ca molecule de ADN hibrid și utilizat pentru cercetări ulterioare.
Se încarcă...