Бешенство (лат. - Lyssa; англ. - Rabies; водобоязнь, гидрофобия) - особо опасная острая зооантропонозная болезнь теплокровных животных всех видов и человека, характеризующаяся тяжелым поражением центральной нервной системы, необычным поведением, агрессивностью, параличами и летальным исходом.

Историческая справка, распространение, степень опасности и ущерб . Болезнь описана около 5000 тыс. лет назад. Сообщения о ней имеются в кодексе законов Вавилона, произведениях древних греков, в частности Аристотеля. Даже названия «Rabies», «Lyssa» отражают главный клинический признак болезни и переводятся как неистовство, безумная ярость. Врачи древности сумели определить передачу болезни через слюну «взбесившихся» собак. Еще во II в. н. э. врачи применяли как профилактическую меру против бешенства хирургическое удаление тканей в месте укуса и прижигание ран раскаленным железом.
Период открытий Л. Пастера - это следующий этап в истории изучения бешенства (1881-1903 гг.). Пастер выяснил вирусную этиологию бешенства. В 1890 г. ученики Пастера Э. Ру и Э. Нокар установили, что слюна больных животных становится заразительной за 3-8 дней до клинического проявления болезни. Л. Пастер доказал возможность воспроизведения заболевания путем интрацеребрального введения материала, причем в ходе таких пассажей через мозг кроликов можно изменить биологические свойства вируса. В 1885 г. были сделаны первые прививки людям, что стало венцом всей деятельности Л. Пастера по спасению человечества от бешенства. Введение в практику пастеровских прививок привело к снижению смертности от бешенства в 10 раз и более.

В настоящее время бешенство регистрируется в большинстве стран мира. По данным ВОЗ, несмотря на то что в мире каждый год более 5 млн человек и десятки миллионов животных вакцинируют против бешенства, ежегодно регистрируется около 50 тыс. случаев гибели людей от этой болезни, а общее число заболевших продуктивных животных составляет сотни тысяч.

Несмотря на достигнутые успехи, проблема бешенства далеко не решена, она стала очень актуальной в связи с прогрессирующим распространением болезни среди диких животных - так называемое природное бешенство. Эпизоотия среди диких животных привела к росту заболеваемости сельскохозяйственных животных, прежде всего крупного рогатого скота.

Возбудитель болезни . Бешенство вызывает пулевидный РНК-вирус семейства Rhabdoviridae, рода Lyssavirus.

Рис. 1 - модель вируса бешенства:
а - уменьшающиеся витки нуклеокапсида; б - относительная позиция шипов и подлежащего мицеллярного белка (вид сверху); в - шипы; г - мицеллярный белок; д - внутренний мембраноподобный слой; е - участок вириона, показывающий отношение липидов к мицеллярному слою, нити шипов могут простираться глубже в оболочку. Лишенная шипов часть оболочки может формировать пустоты внутри нуклеопротеиновой спирали.

Ранее все штаммы вируса бешенства рассматривались как единые в антигенном отношении. В настоящее время установлено, что вирус бешенства имеет четыре серотипа: вирус 1-го серотипа выделен в разных частях света; вирус 2-го серотипа выделен из костного мозга летучей мыши в Нигерии; вирус 3-го серотипа выделен от землеройки и человека; вирус 4-го серотипа выделен от лошадей, комаров и москитов в Нигерии и еще не классифицирован. Все варианты вируса в иммунологическом отношении родственны.

Центральная нервная система является избирательным местом нахождения возбудителя бешенства. В наибольшем титре вирус обнаруживали в головном мозге (аммоновых рогах, мозжечке и продолговатом мозге). После поражения центральной нервной системы возбудитель проникает во все внутренние органы и кровь, кроме сальника, селезенки и желчного пузыря. Вирус постоянно обнаруживают в слюнных железах и тканях глаз. Культивируют путем интрацеребральных пассажей на кроликах и белых мышах и в ряде культур клеток.

По устойчивости к химическим дезинфицирующим средствам возбудитель бешенства относится к устойчивым (вторая группа). Низкие температуры консервируют вирус, и в течение всей зимы он сохраняется в мозге зарытых в землю трупов животных. Вирус термолабилен: при 60 о С инактивируется через 10 мин, а при 100°С - моментально. Ультрафиолетовые лучи убивают его за 5-10 мин. В гниющем материале сохраняется в течение 2-3нед. Аутолитические процессы и гниение вызывают гибель возбудителя в головном мозге трупов в зависимости от температуры через 5-90 дней.
Наиболее эффективны следующие дезинфицирующие средства: 2%-ные растворы хлорамина, щелочей или формалина, 1%-ный йодез, 4%-ный раствор пероксида водорода, Виркон С 1:200 и др. Они быстро инактивируют вирус.

Эпизоотология . Основные эпизоотологические данные бешенства:

Восприимчивые виды животных : теплокровные животные всех видов. Наиболее чувствительны лисица, койот, шакал, волк, сумчатая хлопковая крыса, полевка. К высокочувствительным отнесены хомяк, суслик, скунс, енот-полоскун, домашняя кошка, летучая мышь, рысь, мангуст, морская свинка и другие грызуны, а также кролик.
Чувствительность к вирусу бешенства человека, собаки, овцы, лошади, крупного рогатого скота признана умеренной, а птиц - слабой.
Молодые животные более чувствительны к вирусу, чем старые.

Источники и резервуары возбудителя инфекции . Резервуаром и главными источниками возбудителя бешенства служат дикие хищники, собаки и кошки, а в некоторых странах мира -летучие мыши. При эпизоотиях городского типа основные распространители болезни - бродячие и безнадзорные собаки, а при эпизоотиях природного типа - дикие хищники (лисица, енотовидная собака, песец, волк, корсак, шакал).

Способ заражения и механизм передачи возбудителя . Заражение человека и животных происходит при непосредственном контакте с источниками возбудителя бешенства в результате укуса или ослюнения поврежденных кожных покровов или слизистых оболочек.

Рис. 2. Распространение вируса в организме животных и человека

Возможно заражение бешенством через слизистые оболочки глаз и носа, алиментарно и аэрогенно, а также трансмиссивно.
Аэрогенный механизм передачи инфекции лисицам и другим диким плотоядным животным в пещерах, где находились миллионы летучих мышей, наблюдали в условиях эксперимента. Плотоядные животные были инфицированы вирусом летучих мышей с помощью генератора аэрозолей. Зараженные аэрозольным путем дикие животные, содержащиеся в отдельном помещении и в изолированных клетках, заразили лисиц и других животных: в течение более чем 6 мес пали от бешенства 37 лисиц и других плотоядных животных. Эти опыты подтвердили респираторную передачу рабической инфекции среди диких плотоядных животных. Из воздуха наблюдаемых пещер удалось выделить вирус бешенства путем интерацеребрального заражения мышей (Winkler, 1968). Constantine (1967) отмечено также заболевание гидрофобией двух санитаров в результате предполагаемого аэрогенного заражения в пещерном очаге летучих мышей. Winkler с соавт. (1972) в лабораторной колонии койотов, лисиц, енотов выявили вспышку бешенства, вероятно, в результате аэрогенной передачи вируса, адаптированного к летучим мышам. Необходимо отметить, что аэрогенный механизм передачи инфекции воспроизведен главным образом с вирусом бешенства, поддерживаемым летучими мышами.
У мышей, хомяков, летучих мышей, кроликов, скунсов бешенство воспроизводили в экспериментальных условиях при заражении интраназальным путем.

Интенсивность проявления эпизоотического процесса. При высокой плотности расселения лисиц, корсаков, енотовидных собак, волков, шакалов, песцов болезнь быстро распространяется, при средней плотности их расселения бешенство проявляется единичными случаями. При низкой плотности популяций диких плотоядных эпизоотия затухает.

Сезонность проявления болезни, периодичность . Максимальный подъем заболеваемости осенью и в зимне-весенний период. Установлена трех-четырехлетняя цикличность бешенства, что связано с динамикой численности основных резервуаров.

Факторы, способствующие возникновению и распространению бешенства . Наличие безнадзорно содержащихся собак и кошек, а также
больных диких животных.

Заболеваемость, летальность . Заболеваемость из числа непривитых животных, покусанных бешеными собаками, составляет 30-35 %, летальность - 100%.

По эпизоотологической классификации возбудитель бешенства входит в группу природно-очаговых инфекций.

На территории России в настоящее время существует три типа рабической инфекции:

арктический (резервуар - песцы);
природно-очаговый лесостепной (резервуар - лисы);
антропоургический (резервуар - кошки, собаки).

С учетом характера резервуара возбудителя различают эпизоотии бешенства городского и природного типов. При эпизоотиях городского типа основными источниками возбудителя и распространителями болезни являются бродячие и безнадзорные собаки. От их численности зависят масштабы эпизоотии. При эпизоотиях природного типа болезнь распространяют в основном дикие хищники. Локализация природных очагов болезни соответствует особенностям расселения лисиц, корсаков, енотовидных собак, волков, шакалов, песцов. Они очень чувствительны к вирусу, агрессивны, зачастую склонны к дальним миграциям, а при заболевании интенсивно выделяют вирус со слюной. Эти обстоятельства наряду со значительной плотностью популяций некоторых хищников (лисица, енотовидная собака), быстрой сменой их поколений и длительностью инкубационного периода при бешенстве обеспечивают непрерывность эпизоотического процесса, несмотря на сравнительно скорую гибель каждого отдельного заболевшего животного.

Патогенез . Возможность развития рабической инфекции, возбудитель которой обычно передается при укусе, зависит от количества проникшего в организм вируса, его вирулентности и других биологических свойств, а также локализации и характера нанесенных бешеным животным повреждений. Чем богаче нервными окончаниями ткань в области ворот инфекции, тем больше возможность развития болезни. Имеет значение и степень естественной резистентности организма, зависящая от вида и возраста животного. В основном вирус проникает в организм животного через поврежденную кожу или слизистую оболочку.

Появление вируса в крови чаще отмечается до проявления клинических признаков заболевания и совпадает с повышением температуры тела.

В патогенезе болезни можно условно выделить три основные фазы:

I - экстраневральную, без видимого размножения вируса в месте инокуляции (до 2 нед),
II - интраневральную, центростремительное распространение инфекции,
III - диссеминацию вируса по всему организму, сопровождающуюся появлением симптомов болезни и, как правило, гибелью животного.

Размножение вируса в сером веществе мозга обусловливает развитие диффузного негнойного энцефалита. Из мозга по центробежным нервным путям вирус попадает в слюнные железы, где размножается в клетках нервных узлов и после их дегенерации выходит в протоки желез, инфицируя слюну. Выделение вируса со слюной начинается за 10 дней до появления клинических признаков. При инкубационном периоде вирус из мозга нейрогенным путем транспортируется также в слезные железы, сетчатку и роговую оболочку глаза, в надпочечники, где, видимо, тоже репродуцируется. Воздействие возбудителя вначале обусловливает раздражение клеток важнейших отделов центральной нервной системы, что ведет к повышению рефлекторной возбудимости и агрессивности заболевшего животного, вызывает судороги мышц. Затем происходит дегенерация нервных клеток. Смерть наступает вследствие паралича дыхательных мышц.

Течение и клиническое проявление симптомов бешенства . Инкубационный период варьируется от нескольких дней до 1 года и составляет в среднем 3-6 нед. Его продолжительность зависит от вида, возраста, резистентности животного, количества проникшего вируса и его вирулентности, места локализации и характера раны. Чем рана ближе к головному мозгу, тем быстрее проявляется клиника бешенства.

Болезнь чаще протекает остро. Клиническая картина сходна у животных всех видов, но лучше изучена у собак. Бешенство у них обычно проявляется в двух формах: буйной и тихой.

При буйном бешенстве различают три периода: продромальный, возбуждения и параличей.
Продромальный период (стадия предвестников) продолжается от 12 ч до 3 сут. Этот период начинается с незначительного изменения поведения. Заболевшие животные становятся апатичными, скучными, избегают людей, стараются спрятаться в темное место, неохотно идут на зов хозяина. В других случаях собака становится ласковой к хозяину и знакомым, пытается облизывать руки и лицо. Затем беспокойство и возбудимость постепенно нарастают. Животное часто ложится и вскакивает, лает без причины, отмечается повышенная рефлекторная возбудимость (на свет, шум, шорох, прикосновение и др.), появляется одышка, зрачки расширены. Иногда на месте укуса возникает сильный зуд, животное вылизывает, расчесывает, грызет это место. С развитием болезни часто появляется извращенный аппетит. Собака поедает несъедобные предметы (камни, стекло, дерево, землю, собственный кал и др.). В этот период развивается парез мускулатуры глотки. Отмечают затрудненное глотание (создается впечатление, что собака чем-то подавилась), слюнотечение, хриплый и отрывистый лай, неуверенную походку, иногда косоглазие.

Второй период - возбуждения - продолжается 3-4 дня и характеризуется усилением описанных выше симптомов. Нарастает агрессивность, собака без повода может укусить другое животное или человека, даже своего хозяина, грызет железо, палки, землю, часто при этом ломает зубы, а иногда нижнюю челюсть. У больных собак усиливается стремление сорваться с цепи и убежать, за сутки бешеная собака пробегает десятки километров, по пути кусает и заражает других собак и людей. Характерно, что собака молча подбегает к животным и людям и кусает их. Приступы буйства, длящиеся несколько часов, сменяются периодами угнетения. Постепенно развиваются параличи отдельных групп мышц. Особенно заметно изменение голоса собаки вследствие паралича мускулатуры гортани. Лай звучит хрипло, напоминая вой. Этот признак имеет диагностическое значение. Полностью парализуется нижняя челюсть, она отвисает. Ротовая полость все время открыта, язык наполовину выпадает, наблюдается обильное слюноотделение. Одновременно наступает паралич глотательных мышц и мышц языка, вследствие чего животные не могут поедать корм. Появляется косоглазие.

Третий период - паралитический - длится 1-4 дня. Помимо паралича нижней челюсти парализуются задние конечности, мускулатура хвоста, мочевого пузыря и прямой кишки, затем мышцы туловища и передних конечностей. Температура тела в стадии возбуждения повышается до 40-41°С, а в паралитической - снижается ниже нормы. В крови отмечают полиморфно-ядерный лейкоцитоз, уменьшено число лейкоцитов, в моче увеличено содержание сахара до 3%. Общая продолжительность болезни 8-10 дней, но часто смерть может наступить через 3-4 дня.

При тихой (паралитической) форме бешенства (чаще отмечается при заражении собак от лисиц) возбуждение выражено слабо или вообще не выражено. У животного при полном отсутствии агрессивности отмечаются сильное слюнотечение и затрудненное глотание. У несведущих людей эти явления нередко вызывают попытку удалить несуществующую кость, и при этом они могут заразиться бешенством. Затем у собак наступает паралич нижней челюсти, мышц конечностей и туловища. Болезнь длится 2-4 дня.

Атипичная форма бешенства не имеет стадии возбуждения. Отмечаются истощение и атрофия мускулатуры. Зарегистрированы случаи бешенства, которые протекали только при явлениях геморрагического гастроэнтерита: рвота, полужидкий кал, содержащий кроваво-слизистые массы. Еще реже регистрируют абортивное течение болезни, завершающееся выздоровлением, и возвратное бешенство (после кажущегося выздоровления вновь развиваются клинические признаки болезни).

При бешенстве у кошек клинические признаки в основном такие же, как у собак, болезнь протекает преимущественно в буйной форме. Часто зараженное животное старается спрятаться в тихом темном месте. Больные кошки отличаются большой агрессивностью в отношении людей и собак. Они наносят глубокие повреждения, вонзая свои когти, стараясь укусить в лицо. У них изменяется голос. В стадии возбуждения кошки стремятся, так же как и собаки, убежать из дома. В дальнейшем развивается паралич глотки и конечностей. Смерть наступает через 2-5 дней после проявления клинических признаков. При паралитическом бешенстве агрессивность выражена слабо.

Лисицы при заболевании настораживают необычным поведением: они теряют чувство страха, нападают на собак, сельскохозяйственных животных, людей. Больные животные быстро худеют, часто возникает зуд в области инфицирования.

При бешенстве крупного рогатого скота инкубационный период более 2 мес, чаще от 15 до 24 дней. В некоторых случаях с момента укуса и до появления первых признаков заболевания может пройти 1-3 года. Бешенство протекает в основном в двух формах: буйной и тихой. При буйной форме заболевание начинается с возбуждения. Животное часто ложится, вскакивает, бьет хвостом, топает, бросается на стену, наносит удары рогами. Агрессивность особенно выражена по отношению к собакам и кошкам. Отмечают слюнотечение, потливость, частые позывы к мочеиспусканию и дефекации, половое возбуждение. Через 2-3дня развиваются параличи мышц глотки (невозможность глотания), нижней челюсти (слюнотечение), задних и передних конечностей. На 3-6-й день болезни наступает смерть.
При тихой форме признаки возбуждения выражены слабо или отсутствуют. Наблюдаются угнетение, отказ от корма. У коров прекращаются секреция молока и жвачка. Затем появляются параличи гортани, глотки, нижней челюсти (хриплое мычание, слюнотечение, невозможность глотания), а затем задних и передних конечностей. Смерть наступает на 2-4-й день.

У овец и коз симптомы такие же, как и у крупного рогатого скота: агрессивность, особенно к собакам, повышенная половая возбудимость. Быстро развиваются параличи, и на 3-5-й день животные погибают. При паралитической форме бешенства возбуждение и агрессивность не отмечают.

Бешенство у лошадей вначале проявляется беспокойством, пугливостью, возбудимостью. Часто возможен зуд на месте укуса. Проявляется агрессивность к животным, а иногда к людям. В период возбуждения лошади бросаются на стену, разбивают голову, грызут кормушки, двери, иногда, наоборот, впадают в состояние депрессии, упираясь головой в стену. Отмечаются судороги мускулатуры губ, щек, шеи, грудной клетки. При дальнейшем развитии болезни развиваются параличи глотательных мышц, а затем конечностей. Животное погибает на 3-4-й день болезни. Но иногда летальный исход наступает уже через 1 сут. При паралитической форме бешенства стадия возбуждения выпадает.

Бешенство у свиней часто протекает остро и в буйной форме. Свиньи мечутся в станке, отказываются от корма, грызут кормушки, перегородки, место укуса. Наблюдается сильное слюнотечение. Проявляется агрессивность к другим животным и людям. Свиноматки набрасываются на собственных поросят. Вскоре развиваются параличи, и через 1-2 сут после их появления животные погибают. Продолжительность болезни не более 6 дней.
При паралитической форме бешенства (регистрируют редко) отмечают угнетение, отказ от корма и воды, незначительное слюнотечение, запор, быстро прогрессирующие параличи. Животные погибают через 5-6 дней после появления признаков заболевания.

Патологоанатомические признаки . Патологоанатомические изменения в целом неспецифичны. При осмотре трупов отмечают истощение, следы укусов и расчесы, повреждение губ, языка, зубов. Видимые слизистые оболочки цианотичные. При вскрытии устанавливают синюшность и сухость серозных покровов и слизистых оболочек, застойное полнокровие внутренних органов; кровь темная, густая, дегтеобразная, плохо свернута; мышцы темно-красного цвета. Желудок часто бывает пустым или содержит различные несъедобные предметы: куски дерева, камни, тряпки, подстилку и т. п. Слизистая оболочка желудка обычно гиперемирована, отечная, с мелкими кровоизлияниями. Твердая мозговая оболочка напряжена. Кровеносные сосуды инъецированы. Головной мозг и его мягкая оболочка отечные, нередко с точечными кровоизлияниями, локализующимися в основном в мозжечке и продолговатом мозге. Мозговые извилины сглажены, ткань мозга дряблая.
Гистологические изменения характеризуются развитием диссеминированного негнойного полиэнцефаломиелита лимфоцитарного типа.

Важное диагностическое значение при бешенстве имеет образование в цитоплазме ганглиозных клеток специфических телец-включений Бабеша-Негри округлой или овальной формы, содержащих базофильные зернистые образования вирусных нуклеокапсидов различной структуры.

Диагностика и дифференциальная диагностика бешенства . Диагноз на бешенство ставят на основании комплекса эпизоотических, клинических, патолого-анатомических данных и результатов лабораторных исследований (окончательный диагноз).
Для исследования на бешенство в лабораторию направляют свежий труп или голову, от крупных животных - голову. Материал для лабораторных исследований необходимо брать и пересылать согласно Инструкции о мероприятиях по борьбе с бешенством животных.

Общая схема диагностики болезни представлена на рисунке 3:

В последние годы разработаны новые методы диагностики бешенства: радиоиммунный метод, иммуноферментный анализ (ИФА), твердофазный иммуноферментный анализ (ТФ-ИФА), идентификация вируса при помощи моноклональных антител, ПЦР.

При дифференциальной диагностике необходимо исключить болезнь Ауески, листериоз, ботулизм. У собак - нервную форму чумы, у лошадей - инфекционный энцефаломиелит, у крупного рогатого скота - злокачественную катаральную горячку. Подозрение на бешенство также может возникнуть при отравлениях, коликах, тяжелых формах кетоза и других незаразных болезнях, а также при наличии инородных тел в ротовой полости или глотке, закупорке пищевода.

Иммунитет, специфическая профилактика . Животные, вакцинированные против бешенства, продуцируют вируснейтрализующие, комплемент-связывающие, преципитирующие, антигемагглютинирующие и литические (разрушающие клетки, зараженные вирусом в присутствии комплемента) антитела. Механизм поствакцинального иммунитета окончательно не расшифрован. Полагают, что вакцинация вызывает биохимические изменения, снижающие чувствительность нервных клеток к вирусу. Сущность искусственной иммунизации при бешенстве сводится к активной выработке антител, которые нейтрализуют вирус в месте проникновения его в организм до внедрения в нервные элементы или при вынужденной иммунизации нейтрализуют вирус на пути к центральной нервной системе. Активизируются также Т-лимфоциты, ответственные за продукцию интерферона. Поэтому при данной болезни возможна постинфекционная вакцинация: вакцинный штамм, проникая в нервные клетки раньше, чем полевой, заставляет их вырабатывать интерферон, который инактивирует вирус дикого бешенства, и антитела, блокирующие специфические клеточные рецепторы.

В ветеринарной практике в настоящее время применяют как живые тканевые и культуральные, так и инактивированные вакцины против бешенства (антирабические вакцины) - до 84 разновидностей антирабических вакцин в 41 стране мира.

Антирабические вакцины классифицируют на три группы: мозговые, которые изготавливают из мозговой ткани животных, инфицированных фиксированным вирусом бешенства; эмбриональные, в которых вируссодержащим компонентом является ткань куриных и утиных эмбрионов; культуральные антирабические вакцины, изготавливаемые из вируса бешенства, репродуцированного в первично-трипсинизированных или перевиваемых клетках ВНК-21/13.

В РФ разработана инактивированная антирабическая вакцина из штамма Щелково-51, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21, обладающая высокой иммунизирующей активностью.
Для профилактических и вынужденных прививок крупного и мелкого рогатого скота, лошадей, свиней применяют жидкую культуральную («Рабиков») антирабическую вакцину.
Для профилактических прививок собакам и кошкам применяют сухую культуральную антирабическую инактивированную вакцину из штамма Щелково-51 («Рабикан »). Разработана универсальная вакцина - для крупного рогатого скота, лошадей, овец, свиней, собак, кошек.
Импортные вакцины широко представлены на российском рынке. Ветеринарные врачи применяют антирабические вакцины Нобивак Рабиес , Нобивак RL , Дефенсор-3 , Рабизин , Рабиген Моно и другие.
Для пероральной вакцинации диких и бродячих животных разработаны методы вакцинации, основанные на поедании животными различных приманок с вакциной «Лисвульпен», «Синраб» и др. В настоящее время ведется работа над созданием генно-инженерных (рекомбинантных) вакцин.

Профилактика . С целью профилактики бешенства осуществляют регистрацию имеющихся у населения собак, контроль над соблюдением правил содержания домашних животных, отлов бродячих собак и кошек, ежегодную профилактическую вакцинацию собак, а в необходимых случаях и кошек. Невакцинированных собак запрещается использовать на охоте и для охраны ферм и стад.
Работники органов лесного и охотничьего хозяйства обязаны сообщать о подозрении на бешенство у диких животных, доставлять их трупы для исследования, проводить мероприятия по снижению численности диких хищников в неблагополучных и угрожаемых по бешенству зонах. Профилактика бешенства сельскохозяйственных животных осуществляется путем их охраны от нападения хищников, а также профилактической вакцинации в зонах заражения.
Продажа, покупка, а также перевозка собак в другие города или регионы разрешается только при наличии ветеринарного свидетельства с отметкой о том, что собака вакцинирована против бешенства не более чем за 12 мес и не менее чем за 30 дней до вывоза.

Лечение бешенства . Эффективных средств терапии нет. Заболевших животных немедленно изолируют и убивают, так как их передержка связана с риском заражения людей.

Меры борьбы . При организации мероприятий по борьбе с бешенством следует различать эпизоотический очаг, неблагополучный пункт и угрожаемую зону.
Эпизоотические очаги бешенства - это квартиры, жилые дома, личные подворья граждан, животноводческие помещения, скотобазы, летние лагеря, участки пастбищ, лесных массивов и другие объекты, где обнаружены больные бешенством животные.
Неблагополучный по бешенству пункт - это населенный пункт или часть крупного населенного пункта, отдельная животноводческая ферма, фермерское хозяйство, пастбище, лесной массив, на территории которых выявлен эпизоотический очаг бешенства.
В угрожаемую зону входят населенные пункты, животноводческие хозяйства, пастбища и другие территории, где существует угроза заноса бешенства или активизации природных очагов болезни.

Мероприятия по ликвидации бешенства представлены на рисунке 4:

Меры по охране людей от заражения бешенством . Лица, которые постоянно подвергаются опасности заражения (лабораторный персонал, работающий с вирусом бешенства, собаководы и т. д.), должны быть профилактически иммунизированы.

Все люди, покусанные, оцарапанные, ослюненные любым животным, даже внешне здоровым, считаются подозрительными на заражение бешенством .

После контакта развитие инфекции можно предупредить путем незамедлительной обработки раны и соответствующего профилактического лечения пострадавшего. Пострадавшему лицу следует некоторое время подождать, чтобы из раны вытекла небольшая порция крови. Затем рану рекомендуется обильно промыть водой с мылом, обработать спиртом, настойкой или водным раствором йода и наложить повязку. Промывать рану следует осторожно, чтобы избежать дальнейшего повреждения тканей. Местная обработка ран приносит наибольшую пользу, если она проводится сразу же после нападения животного (по возможности в пределах 1 часа). Пострадавшего направляют в медпункт и проводят курс лечебно-профилактической иммунизации антирабическим гамма-глобулином и антирабической вакциной. Лиц, больных бешенством, госпитализируют.

Анализ на бешенство у собак подразумевает проведение специальных экспресс-тестов на наличие в крови специфических антирабических антител. Иногда его применяют в комплексной диагностике при подозрении на заражение домашних питомцев вирусом бешенства. Данное заболевание представляет угрозу для жизни животных, человека, поэтому заводчики собак должны иметь понятие о том, как проявляется данный недуг. Если есть подозрение на заражение, если питомец имел контакт с возможным бактерионосителем, нужно сразу отвезти питомца в ветлечебницу, для проведения лабораторной диагностики, без которой невозможно установить точный диагноз.

(rabies) – остропротекающее заболевание теплокровных животных инфекционной этиологии, вызываемое вирусом, который поражает ЦНС, провоцируя серьезные нарушения в организме. К сожалению, эффективного лечения на данный момент не разработано, поэтому инфекция всегда заканчивается летальным исходом.

Возбудитель инфекционного недуга – РНК-содержащий вирус (рабдовирус). Поражает домашних и диких животных. Существует так называемый «природный» вирус и «лабораторный».

ВАЖНО! БЕШЕНСТВО ОТНОСЯТ К ЗООАНТРОПОЗООНОЗНЫМ БОЛЕЗНЯМ, ТО ЕСТЬ ИНФЕКЦИЯ ПЕРЕДАЕТСЯ ЧЕЛОВЕКУ. ВСПЫШКИ ИНФЕКЦИИ ОТМЕЧАЮТ ВЕЗДЕ. БОЛЕЗНЬ ИМЕЕТ ПРИРОДНО-ОЧАГОВЫЙ ХАРАКТЕР.

Природным резервуаром рабдовируса являются инфицированные плотоядные хищники. Смертельно опасный вирус содержится в слюне инфицированных особей. Инфицирование происходит контактным путем, при укусах, проникновении слюны в ссадины, ранки на дерме.

Проникнув в организм, вирус по нервным путям мгновенно перемещается в головной, спинной мозг, слюнные железы, где в дальнейшем он размножается.

В слюне инфицированных животных рабдовирус появляется примерно за три-семь дней до момента проявления первых симптомов. При этом инфицированная особь уже является вирусуносителем, представляя реальную угрозу для человека, других домашних животных. Поэтому заражение бешенством может произойти даже в том случае, если вас или вашего питомца укусило внешне здоровое животное.

Формы, стадии бешенства

Инкубационный период длиться от 2-7-ми суток до нескольких недель. Интенсивность проявления симптоматики зависит от возраста, резистентности, иммунной защиты, вирулентности, концентрации рабдовируса в организме. Смертельно опасный недуг у животных протекает в тихой, буйной, реже в атипической формах.

У собак отмечают преимущественно буйную форму инфекции, продолжительность которой составляет от шести до десяти суток. Имеет три стадии проявлении:

Продромальную. Срок протекания меланхолической стадии - не более двух суток. На этом этапе развития инфекции отмечают изменение поведенческих манер собаки. Животные сильно угнетены, выглядят подавленными, прячутся в темных укромных местах, неохотно идут на контакт, неадекватно реагируют на раздражители.
Маниакальную (стадия возбуждения). Продолжительность течения не более трех-четырех суток. Больные животные проявляют беспричинную агрессию к своим собратьям, другим домашним питомцам, человеку, включая хозяина. Агрессия сменяется ласковым поведением. Питомец требует внимания, лижет руки, лицо человека. Больные питомцы поедают несъедобные предметы. Нередко собаки убегают из дома и могут пробежать без устали 20-30 км.
Паралитическую (депрессивную). Для данной стадии, продолжительность которой составляет не более шести суток, характерны тяжелые сбои в функционировании ЦНС. Отмечают паралич глотки, гортани, мышечные судороги, спазмы. Нижняя челюсть отвисает. Отсутствует глотательный рефлекс. Из пасти постоянно течет слюна. Громкие звуки, шум воды вызывает сильнейшую панику. Координация движения нарушена. Питомец впадает в кому, погибает от истощения, нарушения дыхательной, сердечной функции.

Стоит отметить, что бешеная собака, независимо от формы и стадии заболевания кусает человека, животных не предупреждая о нападении лаем.

Тихая, атипичная формы

Для тихой формы болезни характерно отсутствие стадии возбуждения. Продолжительность - от двух до пяти суток. Характеризуется общим угнетением, меланхоличностью, отсутствием реакции на внешние раздражители. Животные гибнут из-за паралича мышечных структур тела, глотки. Болезнь всегда заканчивается летальным исходом.

Реже у собак отмечают атипичную форму болезни, которая проявляется нетипичными, нехарактерными для данной инфекции проявлениями. Протекает остро, подостро, реже хронически (два-три месяца). У животных отмечают изменение поведения, сбои в работе ЦНС, ЖКТ.

Заметив нехарактерное поведение своего домашнего любимца, изменение повадок, проявление агрессии, а также если собака имела контакт или была укушена бездомными, дикими животными, обязательно нужно отвезти питомца в ветлечебницу, проверить собаку на бешенство. Не стоит забывать, что симптоматика нарастает спонтанно в определенной последовательности.

Диагностические методики

При постановке предварительного диагноза должны быть учтены данные анамнеза, паталагоанатомические результаты, эпизоотологическая ситуация, симптомы. Проводится серия лабораторных, гистологических, микроскопических, бактрериологических исследований, экспресс-тесты.

Учитывая схожесть симптоматики с другими инфекциями, проводится дифференциальная диагностика (ИФА, ПЦР). Необходимо исключить болезнь Ауески, чуму плотоядных, энцефаломиелит.

Важно! Если есть подозрение на инфекцию, животное покусало человека, собаку помещают в специальные изолированные боксы и в течение десяти дней, пока не будут готовы результаты анализов, наблюдают за ее состоянием. Если диагноз подтвердился, к сожалению, проводится эвтаназия. Животных усыпляют, поскольку лечения от данной инфекции нет.

Точный диагноз удается установить только после смерти животных. Полученный патматериал исследуют различными методами.

Основные диагностические исследования

Наиболее достоверный метод, который всегда подтверждает болезнь – микроскопические исследования биоматериала на наличие специфических включений в мозге – телец Бабеша-Негри. Расположеные в аммоновых рогах.

Для обнаружения специфического антигена в мозге применяют реакцию диффузной преципитации, иммунофлуоресцентный анализ отпечатка роговицы.

Иммунофлуоресцентный метод позволяет максимально быстро диагностировать наличие вируса в организме собак. Метод определяет вирусный антиген в 93-97% случаях.

Анализ крови на антитела

Учитывая то, что вирус перемещается по нервным стволам, его крайне редко удается определить в кровеносном русле. Как правило, при подозрении на заражение для анализов исследуют спинномозговую жидкость.

Серологические исследования заключаются в проведении общего, биохимического анализа крови. Отмечают изменение лейкоцитарной формулы (лейкоцитоз), олигурию, альбуминурию, глюкозурию, увеличение концентрации моноцитов.

Протестировать своего питомца на бешенство, определить напряженность поствакцинального иммунитета позволит тест на наличие специфических антирабических антител в крови . Проводится данная процедура только в аккредитованных лабораториях, некоторых ветклиниках. Стоит отметить, что стоимость данного анализа довольно высока. Результаты после проведения процедуры будут готовы через 10-20 суток.

Сегодня проводится два вида тестов на антирабические антитела – RFFIT (тест быстрого торможения фокуса флюоресценции) и FAVN – тест флуоресцентных вируснейтрализующих антител, который определяет титр антител в МЕ/мл. Данные методики выполняют на живых культурах клеточных структур с добавлением в реакцию возбудителя инфекции. У собак берется 0.5- 1 мл сыворотки крови.

Тест проводят преимущественно в том случае, если вы хотите вывезти своего питомца заграницу. Многие страны ЕС запрещают ввозить на свою территорию не привитых от бешенства животных, а также собак, котов, у которых нет результатов по данному анализу.

Сдавать тест на антитела нужно тогда, когда в крови собаки выработаются антитела к данной инфекции. Специфический иммунитет после иммунизации формируется через месяц после прививки . С этого момента можно везти питомца в лабораторию для прохождения теста на антитела к бешенству. При этом после иммунизации, если возникает потребность в проведении данного теста, от даты прививки не должно пройти более года. Тест нужно сдать не позднее месяца до срока проведения ревакцинации.

Если титр антирабических антител составляет менее 0,50 МЕ/мл – собаку ревакцинируют. Через месяц сдается повторный анализ. На продуцирование защитных антител после иммунизации влияют некоторые факторы: порода, возраст, индивидуальные особенности организма, кратность антирабической иммунизации. Ветврачи рекомендуют проводить мониторинг титра антител у собак, кошек после вакцинации, даже в том случае, если не планируется выезд за границу.

Многие владельцы вывозят своих питомцев на дачу, на природу, в лес, на охоту. Не стоит забывать, что собаку могут покусать дикие звери, которые могут быть инфицированы или являются вирусоносителями.

Единственный способ защитить собаку от смертельно опасной инфекции – своевременно проведенная вакцинация.

В дальнейшем, в зависимости от выбранного препарата, раз год проводится ревакцинация. Некоторые вакцины формируют иммунную защиту сроком на три года. Оптимальную схему вакцинаций, ревакцинаций подберет ветврач.

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ. МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION. METROLOGY AND CERTIFICATION

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

ЖИВОТНЫЕ

Издание официальное

Стандартмнформ

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 - 92 «Межгосударственная система стандартизации. Основ* ныв положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки. принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 июня 2013 г. № 57-П)

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166)004-97	Код страны no МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
		Минэкономики Республики Армения
Беларусь		Госстандарт Республики Беларусь
Киргизия		Кыргызстандарт
		Молдова-Стандарт
		Госстандарт
Узбекистан		Узсгандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 сентября 2013 г. № 1127-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 26075-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2015 год

5 ВЗАМЕН ГОСТ 26075-54

Информация об изменениях х настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ЖИВОТНЫЕ

Методы лабораторной диагностики бешенства

Methods of Laboratory Diagnostic of Rabies

Дата введения - 2015 - 01 - 01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы лабораторной диагностики бешенства:

Метод флуоресцирующих антител (МФА);

Метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1);

Биопроба на белых мышах:

Метод иммукоферментного анализа (ИФА);

Реакция диффузионной преципитации (РДП).

Примечания

1 Данные методы применимы ко всем представителям рода Lyssavwus.

2 Уличный вирус бешенства относится к микроорганизмам 2 класса патогенности (представляет смертельную опасность для человека и животных).

3 При необходимости генотипирования вируса бешенства с помощью готовых тест- систем применяют метод обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (от-ПЦР).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ ИСО/МЭК 17025 - 2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 12.0.004 - 90 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения

ГОСТ 12.1.005-68 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.008 - 76 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.4.011 - 89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация

ГОСТ 17.0.0.01 - 76 Система стандартов в области охраны природы и улучшения использования природных ресурсов. Основные положения

ГОСТ 177-88 Водорода перекись. Технические условия ГОСТ 2603 - 79 Реактивы. Ацетон. Технические условия ГОСТ 2768 - 84 Ацетон технический. Технические условия ГОСТ 4204 - 77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия ГОСТ 6709 - 72 Вода дистиллированная. Технические условия.

ГОСТ ISO 7218 - 2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ 8074 - 82 Микроскопы инструментальные. Типы, основные параметры и размеры. Технические требования.

ГОСТ 9147 - 80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрелзратое. Технические условия ГОСТ 12026 - 76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 13739-78 Масло иммерсионное для микроскопии. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 21241-69 Пинцеты медицинские. Общие технические условия.

ГОСТ 22967 - 90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 24661 - 91 (ИСО 7866 84) Шприцы инъекционные однократного применения

ГОСТ 25046 - 81 (ИСО 7864-81) Иглы инъекционные однократного применения. Основные размеры. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 25336 - 82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29230 - 91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и ло выпускам ежемесячного информационного указателя «На-циональные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины, определения и сокращения

3.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1.1 бешенство: Инфекционное заболевание человека и животных, вызываемое представителями семейства Rhabdoviridae рода Lyssavirus (рабДовирус), и приводящее к летальному исходу в 100 % случаев.

3.1.2 вирус бешенства: Возбудитель инфекционного заболевания человека и животных.

3.1.3 антиген вируса бешенства: Поверхностные белковые структуры вируса бешенства, на которые вырабатываются антитела.

3.1.2 метод флуоресцирующих антител (МФА): Метод выявления антигена вируса бешенства меченными флуоресцеиниэотиоциаиатом антирабическими антителами, с образованием характерных светящихся комплексов-включений, обнаруживаемых в поле зрения люминесцентного микроскопа.

3.1.3 метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1): Метод выделения антигена вируса бешенства. основанный на размножении вируса в культуре клеток и его идентификации методом флуоресцирующих антител.

3.1.3 биопроба: Метод выделения вируса бешенства на белых мышах путем введения им суспензии патологического материала с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител.

3.1.4 метод иммуноферментного анализа (ИФА): Метод выявления антигена вируса бешенства. основанный на его специфическом взаимодействии с антирабическим антителом, иммобилизованном на твердом носителе, с последующим выявлением связавшегося антигена с помощью второго меченного ферментом антитела путем окрашивания продукта реакции хромогеном.

3.1.5 реакция диффузионной преципитации (РДП): Метод выявления вируса бешенства, основанный на способности антител и вирусного антигена бешенства диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс «антиген-антитело», наблюдаемый невооруженным глазом в виде линии преципитации.

3.1.6 метод обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (от-ПЦР): Метод выявления генома вируса бешенства путем перевода специфической последовательности РНК вируса в ДНК с последующим многократным копированием полученной ДНК и обнаружением продуктов реакции, осуществляемый in vitro.

3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:

ФАГ- флуоресцирующий антирабический иммуноглобулин;

АнГ- антирабический глобулин;

КФГ - контрольный флуоресцирующий глобулин;

ФБР - фосфатно-буферный раствор;

НГУК-1-невринома Гассерова узла крысы;

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцинат:

РНК - рибонуклеиновая кислота:

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота:

ССЫ31 - культура клеток мышиной нейробластомы:

ОФД -ортофенилдиамин;

ТМБ - тетраметилбензидин.

4 Условия выполнения исследований и требования безопасности

4.1 Условия выполнения исследований

4.1.1 Общие требования проведения микробиологического анализа и работы с микроорганизмами I - II групп патогенности - ло ГОСТ ISO 7218.

4.1.2 Общие требования к помещениям - по ГОСТ ISO 7218.

4.1.3 Требования к персоналу - по ГОСТ ISO 7218, ГОСТ ИСО/МЭК 17025. (1).

К проведению исследований допускаются квалифицированные сотрудники, имеющие опыт работы с микроорганизмами I - II групп патогенности, изучившие методики микробиологических работ. вакцинированные против бешенства.

4.2 Требования безопасности

4.2.1 Общие требования безопасности при проведении работ согласно ГОСТ 12.1.008.

4.2.2 Средства защиты работающих должны соответствовать требованиям ГОСТ 12.4.011.

4.2.3 Воздух рабочей зоны должен соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.005.

4.2.4 Обучение персонала безопасности труда в соответствии с ГОСТ 12.0.004.

4.2.5 Утилизацию полученного для исследования материала, а также использованных индивидуальных средств защиты, инструментов и т.д. проводят путем кипячения в течение 30 мин или автоклавирования в течение 15 мин при давлении (0.11 ± 0.20) МПа.

5 Средства измерений, оборудование, материалы, реактивы и животные

5.1 Для проведения исследований используют:

Спектрофотометр сканирующий со спектральным диапазоном измерения длин волн от 190 до 1100 нм с погрешностью не более ± 0,5 нм и диапазоном измерения оптической плотности (ОП) от 0.1 до 3.0;

Планшеты для иммунологических реакций 96-луночные:

Термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20 "-С до 50 °С:

Холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от О °С до 10 °С по ГОСТ 16317:

Центрифугу лабораторную;

Баню водяную;

Микроскоп люминесцентный инвертированный по ГОСТ 8074:

Ступки фарфоровые с пестиком по ГОСТ 9147 или гомогенизатор по ГОСТ ИСО/МЭК 17025;

Стекла предметные по ГОСТ 9284:

Пробирки стеклянные по ГОСТ 25336;

Чашки Петри по ГОСТ 25336;

Кювету по ГОСТ 25336;

Пипетки вместимостью 1.0; 2,0 и 10.0 см 3 по ГОСТ 29230;

Пипетки автоматические вместимостью от 0,05 до 0,20 см 3 с наконечниками:

Пинцеты медицинские по ГОСТ 21241:

Шприцы инсулиновые вместимостью 1,0 см 3 по ГОСТ 22967 или ГОСТ 24861;

Иглы инъекционные ло ГОСТ 25046:

Стекла культуральные на восемь лунок;

Клетки для содержания мышей;

Ацетон по ГОСТ 2603 или ГОСТ 2768;

Флуоресцирующий антирабический иммуноглобулин (ФАГ);

Антирабический глобулин (АнГ);

Контрольный флуоресцирующий глобулин (КФГ);

Масло нефлуоресцирующее иммерсионное ло ГОСТ 13739;

Воду дистиллированную по ГОСТ 6709;

Раствор фосфатно-буферный молярной концентрации 0.01моль/дм 3 (ФБР). pH 7,2 - 7.4;

- раствор натрия хлорида стерильный 0.9 %-ный изотонический:

Культуру клеток мышиной нейробластомы ССЫ31 или неериномы Гассерова узла крысы -

Пенициллин;

Стрептомицин;

Среду Игла МЕМ с двойным набором аминокислот и витаминов (ДМЕМ), pH 7,2;

Раствор трипсина 0,25 %-ный;

Сыворотку эмбриональную крови крупного рогатого скота для культур клеток 10 %-ную;

Глютамин 3 %-ный;

Перекись водорода 3 %-ную по ГОСТ 177;

Набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом ИФА;

Раствор серной кислоты молярной концентрации 2 моль/дм 3 по ГОСТ 4204;

Бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026;

Штамп для приготовления лунок;

Мертиолят;

Агар «Дифко» или аналогичный;

Раствор метилового оранжевого 1 %-ный в 50 %-ном этиловом спирте:

Антигены положительный и отрицательный;

Сыворотку антирабическую или иммуноглобулин;

Мышей белых клинически здоровых массой 6 - 8 г.

5.2 Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов и материалов по качеству не ниже указанных выше. Допускается использование посуды одноразового применения.

6 Отбор проб

6.1 Для проведения исследований на наличие вируса бешенства в лабораторию направляют патологический материал - свежий труп или голову мелких животных, голову или головной мозг крупных животных.

6.2 Отобранный для исследований патологический материал упаковывают во влагонепроницаемую тару и доставляют в лабораторию в металлических контейнерах. Замороженный материал помещают в криоконтейнер.

6.3 Патологический материал сопровождают документом, содержащим следующие данные; наименование и адрес отправителя, вид животного, анамнестические и клинико-элиэоотологические данные.

6.4 Пабораторные исследования проводят сразу же при получении патологического материала.

6.5 Для исследования отбирают от крупных животных кусочки ткани из каждого отдела головного мозга (аммоновы рога, мозжечок, кору больших полушарий, продолговатый мозг) размером 0.5 - 1.0 см. мозг мелких животных, например мышей, исследуют целиком.

Для исследования МФА и методом выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или НГУК-1) пригодны только свежие или свежезамороженные пробы ткани головного мозга. Не допускаются для исследований пробы мозга животных, разлагающиеся (в стадии загнивания), консервированные глицерином, фиксированные метиловым спиртом, формалином или другими средствами, способствующими возникновению неслецифической флуоресценции.

Для постановки биопробы допускается использовать пробы мозга, консервированные в 30 % -50 %*ном растворе глицерина. Использование других консервантов не допускается. Для сохранности патологический материал может быть заморожен при температуре не выше минус 10 в С.

7 Метод флуоресцирующих антител (МФА)

7.1 Сущность метода

Сущность метода флуоресцирующих антител заключается в специфическом взаимодействии флуоресцирующих антирабических антител с гомологичным антигеном вируса бешенства. Образующийся при этом комплекс «антиген-антитело», меченный ФИТЦ. обнаруживается визуально по характерному свечению в поле зрения при рассмотрении под люминесцентным микроскопом.

7.2 Подготовка к исследованию

7.2.1 Подготовка проб

7.2.1.1 Из кусочков ткани, отобранных по 6.5, готовят не менее трех препаратов (отпечатков или мазков) из каждого отдела мозга на тщательно обезжиренных предметных стеклах. Если состояние патолсгического материала позволяет, то готовят отпечатки, в остальных случаях делают мазки.

7.2.1.2 Приготовление отпечатков

Кусочки ткани, отобранные по 6.5. кладут на фильтровальную бумагу, сложенную в четыре -шесть слоев. Мозг мелких животных разрезают поперек, захватывая все его отделы, и кладут его пиниетом срезом вверх на фильтровальную бумагу, сложенную в четыре - шесть слоев. К поверхности среза прикасаются предметным стеклом, слегка надавливая его до получения на стекле тонкого отпечатка.

7.2.1.3 Приготовление мазков

Кусочек ткани из каждого отдела мозга (у мелких животных весь мозг целиком), отобранный по 6.5. растирают в фарфоровой ступке пестиком до образования гомогенной массы, из которой делают мазки на предметных стеклах.

7.2.1.4 Для контроля делают мазки или отпечатки из мозга здоровых, не болевших бешенством и не вакцинированных против бешенства, белых мышей, какописано в 7.3.1.2 и 7.3.1.3.

7.2.1.5 После приготовления мазки или отпечатки высушивают на воздухе в течение 20-30 мин. фиксируют в охлажденном ацетоне при температуре 4’Св течение 4 - 12 ч или при температуре минус 20 *С в течение 1 ч. после чего извлекают из ацетона и высушивают на воздухе в течение 10 - 15 мж.

7.2.2 Подготовка реактивов

ФАГ. АнГ и КФГ растворяют дистиллированной водой до указанного на этикетке ампулы первоначального объема. Срок хранения растворенных ФАГ. АнГ и КФГ при температуре (5 ± 2) в С - не более двух недель.

Непосредственно для исследования необходимое количество растворенных ФАГ. АнГ и КФГ разводят ФБР до рабочего разведения, указанного на этикетке ампулы. Рабочие разведения растворенных ФАГ. АнГ и КФГ используют в день приготовления.

7.3 Проведение исследования

Предметные стекла с препаратами (мазками или отпечатками) по 7.2.1 помещают во влажную камеру (чашку Петри или кювету с увлажненным дном). Затем на один из трех приготовленных препаратов наносят ФАГ в рабочем разведении равномерно на всю поверхность мазка или отпечатка при помощи пипетки. На второй препарат наносят рабочее разведение КФГ. Закрывают камеру с препаратами. помещают в термостат при температуре (37 ± 1) *С и выдерживают в течение 30

мин. Параллельно окрашивают контрольные препараты. По окончании окрашивания препараты трехкратно промывают, погружая их каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР. ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе в течение 20 - 30 мин.

На третий препарат наносят рабочее разведение АнГ. помещают в термостат при температуре (37 ± 1) *С и выдерживают в течение 30 мин. Затем препарат трехкратно промывают, погружая каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР. ополаскивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе в течение 20 - 30 мин и окрашивают рабочим разведением ФАГ. как описано выше.

7.4 Обработка результатов

8 окрашенных препаратах не пораженная вирусом бешенства мозговая ткань светится тусклым. серовато-желтым цветом.

Антиген вируса бешенства выявляется в нейронах и вне клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы и величины - от едва заметных до имеющих размер в диаметре 15 - 20 мкм. Иногда отмечается большое количество мелких ярких зеленых частиц (размером до 1 мкм) округлой и овальной формы.

Диагноз бешенство считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа в исследуемом препарате обнаруживают типичные желтовато-зеленые гранулы. При этом в контрольных препаратах (в мазках или отпечатках из мозга здоровых не болевших бешенством белых мышей, окрашенных ФАГ), а также в исследуемых препаратах, окрашенных КФГ и предварительно обработанных АнГ и окрашенных ФАГ. подобных образований быть не должно.

О результатах исследования сообщают компетентным органам в соответствии с порядком, действующим на территории государства, принявшего стандарт.

8 случае отрицательного результата проводят исследования по 8 или 9.

8 Метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1)

8.1 Сущность метода

Сущность метода заключается е выделении вируса бешенства в культуре клеток мышиной

нейробластомы CCL-131 или НГУК-1 с последующей его идентификацией методом флуоресцирующих антител.

Метод является альтернативным биопробе на белых мышах по 9.

8.2 Подготовка к исследованию

8.2.1 Подготовка проб

Равные части ткани, стерильно отобранные из каждого участка головного мозга мелкого животного (аммоновы рога, мозжечок, кора больших полушарий, продолговатый мозг), или кусочки ткани из каждого отдела головного мозга крупного животного, отобранные по 6.5. измельчают ножницами и растирают в ступке или гомогенизаторе, постепенно добавляя стерильный 0.9 %-ный изотонический раствор натрия хлорида до получения 10 %-ной суспензии. В суспензию мозга добавляют пенициллин и стрептомицин по ЮС ЕД/см 3 и 1 мг/см 3 соответственно.

Полученную суспензию тщательно перемешивают и центрифугируют в течение 5-10 мин при скорости 2000 об/мин. Над осадочную жидкость переносят в стерильную пробирку и хранят при температуре не выше 4 °С до использования.

8.2.2 Подготовка культуральных стекол

Суточную культуру клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или НГУК-1) снимают с культурального флакона при помощи 0,25 %-ного раствора трипсина и разводят средой ДМЕМ с 10 %-ной эмбриональной сывороткой крови крупного рогатого скота и 3 %-ным глютамином до концентрации 2 * 10 s клеток/см 3 . В лунки культурального стекла вносят по 0.1 см 3 полученной суспензии клеток, накрывают крышкой и помещают во влажный СО г -инкубатор с содержанием СО г 5 % при температуре (37±1)°С на 18-20ч

8.3 Проведение исследования

В две лунки культурального стекла по 8.2.2 вносят по 0.05 см 3 суспензии из каждого отдела головного мозга. На каждом стекле оставляют две лунки для положительного и отрицательного контроля. В качестве положительного контроля используют суспензию мозга мыши, зараженной вирусом бешенства - штаммом CVS. В качестве отрицательного контроля вносят суспензию мозга клинически здоровой мыши. Культуральное стекло помещают во влажный СОг-инкубатор с содержанием СОг 5 % при температуре (37 ± 1) *С на 42 - 48 ч.

По окончании инкубации с помощью автоматической пипетки из лунок культурального стекла удаляют среду, один раз промывают клетки ФБР (с помощью автоматической пипетки вносят по 0.2 см 3 раствора е каждую лунку) и подсушивают в ламинарном потоке воздуха в течение 20 - 30 мин. Затем в каждую лунку вносят по 0.1 см 3 охлажденного до температуры минус 20 *С ацетона и оставляют при комнатной температуре на 30 мин.

После фиксации клеток культуральное стекло переворачивают и встряхивают для удаления ацетона, а затем высушивают в ламинарном потоке воздуха в течение 20 - 30 мин. С помощью скальпеля и пинцета удаляют пластиковую насадку и подсушивают стекло еще в течение 5-10 мин. В каждую лунку добавляют по 0.05 - 0.10 см 3 ФАГ в рабочем разведении (подбирают опытным путем), приготовленном в ФБР. помещают во влажную чашку Петри и инкубируют при температуре (37 ± 1) в С в течение 30 мин.

По окончании окрашивания стекла трехкратно промывают, погружая их каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР. Затем препараты ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе в течение 20-30 мин.

На окрашенные препараты наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают в люминесцентном микроскопе.

8.4 Обработка результатов

В окрашенных препаратах не пораженная вирусом бешенства культура клеток светится тусклым. серовато-желтым цветом (отрицательный контроль). Антиген вируса бешенства выявляется в цитоплазме культуры клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы и величины с четкими очерченными краями (положительный контроль).

Диагноз на бешенство считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа в исследуемом препарате обнаруживают типичные желто-зеленые гранулы.

Если в культуре клеток вирус бешенства не выявлен, то ставится отрицательный диагноз.

Результаты выделения вируса бешенства в культуре клеток окончательные, дальнейшие исследования не проводят.

9 Бислроба на белых мышах

9.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в выделении вируса бешенства путем интрацеребрального введения патологического материала белым мышам с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител по 7.

9.2 Подготовка проб к исследованию - по 6.2.1.

9.3 Проведение исследования

Пять - шесть белых мышей заражают 10 %*ной суспензией патологического материала им-трацеребрально в объеме 0.02 - 0,03 см 3 . Зараженных мышей помещают в отдельную клетку, на ко* торую наклеивают этикетку с указанием даты заражения, количества мышей, способа заражения и номера экспертизы патологического материала. Наблюдение за животными проводят не менее 30 дней. Количество здоровых, больных и погибших мышей регистрируют в журнале.

9.4 Обработка результатов

При оценке результатов учитывают наличие клинических признаков у зараженных мышей (взьерошенность шерсти, поедаемость корма, нарушение координации движения, параличи, тремор, прострация). Гибель мышей в первые двое суток после заражения не учитывают. Пробы мозга от больных и погибших животных, начиная с третьих суток, исследуют МФА по 7.

Биопробу считают положительной, если, начиная с третьих суток после заражения, заболела и погибла хотя бы одна мышь и в пробе мозга с помощью МФА обнаружены специфические включе* кия вируса бешенства.

Отрицательный диагноз может быть дан только по истечении 30 сут наблюдения при условии, что все зараженные животные останутся живыми и здоровыми.

Результаты биопробы считаются окончательными, дальнейшие исследования не проводят.

10 Метод иммуноферментного анализа (ИФА)

10.1 Сущность метода

8 основе ИФА лежит специфическое взаимодействие антигена вируса бешенства с антиге* лом. иммобилизованным на твердом носителе. Связанный антиген выявляется с помощью второго антирабического антитела, меченного пероксидазой. продукт реакции которой окрашивается при до* бавлении хромогена. Интенсивность окрашивания продукта реакции прямо пропорциональна количеству антигена.

10.2 Подготовка к исследованию

10.2.1 В качестве исследуемого материала (антиген) используют пробы ткани головного мозга павших, вынужденно убитых, подозреваемых в заболевании бешенством или экспериментально зараженных вирусом бешенства животных.

10.2.2 Приготовление исследуемого антигена

Пробы ткани головного мозга, полученные по 6.5, измельчают, растирают в ступке и готовят 10 %*ные суспензии в С.9 %-ном изотоническом растворе хлористого натрия, прогревают в водяной бане при температуре 60 *С в течение 15 мин и центрифугируют в течение 5-10 мин при скорости 2000 об/мин. Надосадочную жидкость используют в качестве исследуемого антигена.

10.2.3 Подготовка реагентов

все растворы и реагенты перед постановкой реакции необходимо выдержать не менее 30 мин при температуре (22 ± 1) *С.

Подготовку компонентов набора проводят согласно инструкции по применению.

10.3 Проведение исследования

10.3.1 ИФА проводят в сэндвич-варианте с использованием компонентов, входящих в набор для выявления антигена возбудителя бешенства в патологическом материале.

Для проведения ИФА используют планшеты для иммунологических реакций с плоским дном.

Объем ингредиентов, вносимых поэтапно в лунки планшета, равен между собой и составляет

10.3.2 Сенсибилизация планшета

6 лунки полистиролового планшета вносят АнГ в рабочем разведении, указанном на этикетке. Планшет с АнГ накрывают крышкой и инкубируют в термостате при температуре (37 ± 0.5) *С в течение 3 ч или при температуре 4 *С в течение 18 ч. По окончании инкубации лунки планшета трехкратно промывают отмывающим буферным раствором. При каждой отмывке содержимое лунок вытряхивают. а остатки раствора удаляют постукиванием о фильтровальную бумагу.

10.3.3 Внесение антигенов

8 ряды планшета А. 8 и С вносят отмывающий буфер. В лунки планшета вносят контрольные положительный (лунка А1) и отрицательный (лунка А2) антигены, входящие в состав набора, а также исследуемые пробы (лунки АЗ. А4 и тщ.) и титруют по вертикали, получая разведения от 1: 2 до 1: 8. При большом количестве проб заполняют и другие ряды планшета. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в гермостате при температуре (37 ± 0.5) *С в течение 1 ч. По окончании инкубации проводят трехкратную отмывку лунок планшета от не связавшихся с иммуноглобулином антигенов, как описано в 10.3.2.

10.3.4 Внесение антирабического лероксидазного конъюгата

В лунки планшета вносят антирабический пероксидазный конъюгат в рабочем разведении, после чего накрывают крышкой и инкубируют в термостате при температуре (37 ± 0.5) в С в течение 1 ч. Затем лунки планшета трехкратно отмывают, как описано в 10.3.2.

10.3.5 Внесение субстратной смеси

Для проявления реакции в лунки планшета вносят готовую субстратную смесь. Реакцию проявляют в течение 15 - 30 мин при температуре (22 ± 0.5) *С в темноте. Реакцию останавливают добавлением раствора серной кислоты молярной концентрации 2 моль/дм 3 .

10.4 Обработка результатов

Учет реакции проводят визуально или на сканирующем спектрофотометре в соответствии с инструкцией по применению набора.

Если в субстратной смеси в качестве хромогена используют ОФД. то измерение оптической плотности проводят при 490 нм. если используют ТМБ. то при 450 км.

Реакцию учитывают только в том случае, если в лунках с контрольным отрицательным антигеном специфическое окрашивание отсутствует при интенсивном окрашивании в лунках с контрольным положительным антигеном. При визуальном учете пробу считают положительной, если хотя бы в одном (первом) разведении наблюдается специфическое окрашивание.

При спектрофотометрическом учете результата ИФА проводят расчет коэффициента специфичности К сп. который равен отношению оптической плотности (ОП) продукта реакции в лунках с контрольным положительным антигеном или исследуемым материалом (ОП«) к оптической плотности субстратной смеси в лунках с контрольным отрицательным антигеном (ОПг). Реакцию считают положительной. если коэффициент специфичности более 2.1 и отрицательной, если менее 2.1.

ОП1 * 0,641, ОПг а 0,120, К сп = 5,34 - реакция положительная или ОП1 = 0,180, ОПг в 0,120 К с „ * 1,5 - реакция отрицательная.

В случае положительной реакции диагноз считают установленным. Отрицательный результат должен быть подтвержден другими методами по 7 - 9.

11 Реакция диффузионной преципитации (РДП)

11.1 Сущность метода

Сущность метода РДП заключается в способности антител и вирусного антигена диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс «антиген-антитело», наблюдаемый невооруженным глазом в виде линии преципитации.

11.2 Подготовка к исследованию

11.2.1 Подготовка проб

Подготовка проб к исследованию - по 8.2.1.

Для исследования допускаются несвежие пробы мозга животных, контаминированные бактериальной микрофлорой.

11.2.2 Подготовка агара

Для приготовления агара смешивают 1.5 г агара «Дифко». 1 см 3 1 %-ного раствора метилового оранжевого в 50 %-ном этиловом спирте. 0.01 г мертиолята. 100 см 3 изотонического раствора натрия хлорида. Полученную смесь кипятят до полного расплавления агара, разливают по пробиркам, автоклавируют при давлении 0.5 атм в течение 30 мин и хранят в холодильнике при температуре 4 в С.

11.2.3 Подготовка предметных стекол (чашек Петри)

Реакцию ставят либо на предметных стеклах, либо на чашках Петри. На обезжиренное стекло наносят каплю расплавленного агара, равномерно распределяют ее по стеклу и оставляют при комнатной температуре на 20 - 30 мин для застывания агара. Затем наносят на стекло 2.5 см 3 расплавленного агара, образуя слой толщиной около 2 мм. и оставляют на 20 - 30 мин. 8 застывшем слое агара с помощью специального штампа или металлической тонкостенной трубочки диаметром 4 - 5 мм делают лунки. Столбики агара осторожно извлекают, не повреждая и не допуская отслаивания от стекла тонкого слоя агарового геля, с помощью глазного пинцета или другого инструмента.

Чашки Петри готовят аналогично, внося в них 10 - 15 см 3 расплавленного агара для получения слоя толщиной 2-3 мм.

11.3 Проведение исследования

Непосредственно перед постановкой реакции готовят разведения антирабической сыворотки (иммуноглобулина), для чего в четыре пробирки вносят по 1.0 см 3 изотонического раствора натрия хлорида. В первую пробирку добавляют 1.0 см 3 антирабической сыворотки, получая разведение 1: 2.

перемешивают, и переносят 1.0 см 3 смеси во вторую пробирку и т. д. Таким образом, получают четыре пробирки с разведениями 1: 2.1:4.1: 8 и 1:16.

8 приготовленные лунки вносят по 0.05 - 0,07 см 3 пробы мозга (каждую пробу в отдельную лунку), полученной по 8.2.1. и разведения антирабической сыворотки или иммуноглобулина (1: 2; 1: 4; 1: 8:1:16) согласно рисунку 1.

Рисунок 1 - Схема внесения материала

Ар - эммонов рог; Пм - продолговатый мозг; А+ - положительный контрольный антиген; М -мозжечок; К - кора больших полушарий; А- - отрицательный контрольный антиген.

возможно применение других схем внесения материала, но при этом обязательно использование положительного и отрицательного антигенов.

Предметные стекла с исследуемым материалом помещают в чашки Петри с увлажненным дном или влажный эксикатор, а затем в термостат при температуре (37 ± 1) *С на 48 ч (чашки Петри накрывают крышкой и помещают в термостат).

Реакцию учитывают через 6. 24 и 48 ч.

11.4 Обработка результатов

Реакцию считают положительной при появлении даже одной линии преципитации любой интенсивности между лунками, содержащими исследуемый материал и антирабическую сыворотку (иммуноглобулин).

При этом между положительным антигеном и антирабической сывороткой (иммуноглобулином) должна наблюдаться заметная линия преципитации, а между отрицательным антигеном и антирабической сывороткой (иммуноглобулином) линии преципитации быть не должно.

8 случае положительной реакции диагноз считают установленным. Отрицательный результат должен быть подтвержден другими методами по 7 -10.

библиография

ЕС Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products for Human and Veterinary Use

УДК 619:616.98:579.852.1:615371 МКС 11.220

Ключевые слова: бешенство, диагностика, метод флуоресцирующих антител, иммуноферментный анализ, биопроба, реакция диффузионной преципитации

Подписано в печать 01.04.2014. Формат 60x84V

Уел. пвч. л. 1,40. Тираж 31 экэ. Зак. 1363.

Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ»

123995 Москва. Гранатный пер., 4.

ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА БЕШЕНСТВА

Методы выявления антигенов . При бешенстве для экспресс-диагностики можно использовать методы флуоресцирующих антител (МФА), реакции преципитации (РП) в агаровом геле, методы иммуноферментного анализа (ИФА), полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для прижизненной диагностики бешенства у человека требуется несколько тестов.

Определение антител к антигенам вируса бешенства . Выявление антител в сыворотке крови или в цереброспинальной жидкости - важный метод диагностики. Серологическое исследование рабиес-специфических антител проводится в сыворотке крови для определения пред- и постэкспозиционной вакцинации и определения времени бустерной иммунизации с целью повышения иммунного ответа.

Выделение вируса . Для выделения и идентификации вируса используют метод биопробы на белых мышах. Исследуемый материал суспендируют в физиологическом растворе, содержащем антибиотики и эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота. Суспензия вводится интрацеребрально белым мышам массой 5–6 г. Для доказательства развития инфекции за мышами ежедневно наблюдают до 30-го дня после инокуляции. Мыши, у которых за этот период развивается заболевание, немедленно подвергаются эвтаназии, и ткани мозга исследуются методом прямой МФА.

Преимущество данного подхода состоит в возможности определить малые количества вируса бешенства в материале. Недостаток метода - необходимость многодневного (7–18 суток) ожидания между инокуляцией и проявлением первых признаков заболевания. Для сокращения инкубационного периода применяют мышей-сосунков. Для экспресс-диагностики можно использовать мышей в возрасте менее 3 дней: у мышей, забитых через 3 дня, уже выявляется антиген вируса в мозге, который можно выявить методом МФА.

Такой метод выделения вируса практикуется в качестве подтверждающего диагностического теста при отрицательных результатах по выявлению антигена и телец Бабеша – Негри и в случае укуса человека подозрительным на бешенство животным. Он обеспечивает надлежащую чувствительность и специфичность, т. е. расценивается на уровне диагностической значимости метода прямой иммунофлуоресценции. Кроме того, этот метод является основным для идентификации вариантов вируса и перспективен для разработки диагностических реагентов.

Выделение и идентификация вируса на культуре клеток . Основным недостатком выделения вируса при инфицировании лабораторных животных является длительность метода. Избежать этого можно при использовании культур клеток. Обычно для этих целей используют культуру клеток нейробластомы мышей, если нужно исследовать ткани головного мозга. Мозг суспендируют в культуральной питательной среде, суспензию наносят на монослой культуры клеток и инкубируют от одного до нескольких дней.

Чувствительность данной культуры к вирусу можно повысить обработкой ее ДЕАЕ декстраном. Монослой клеток затем отмывают, фиксируют на холоде ацетоном или смесью формалина с метанолом и исследуют методом иммунофлюоресценции. Если животное было инфицировано вирусом бешенства, то в монослое культуры клеток выявляются цитоплазматические включения антигена вируса бешенства.

Показано, что на клетках мышиной нейробластомы линии Na C1 300 в сочетании с МФА антиген вируса бешенства можно выявить через 2 дня. Чувствительность метода сравнима с методом изоляции вируса на мышах.

Хотя вирус бешенства обладает облигатной нейропатогенностью in vivo, он способен инфицировать широкий круг клеток-хозяев in vitro, что можно использовать для исследования других тканей и органов на наличие вируса бешенства. Установлено, что вирус бешенства размножается в клетках ВНК-21 и Vero, в первичных клетках куриных эмбрионов или почек хомяка. Показано, что адсорбция вируса и внедрение его в клетку происходят в течение 7 часов. Через 24–48 часов внутри клетки образуются новые вирусные частицы, через 72 часов происходит почкование их из клеточной оболочки в межклеточное пространство.

Методы исследования

Для экспресс-диагностики бешенства могут быть использованы:

а) метод МФА - для выявления антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы или заднего отдела шеи больного, содержащего луковицы волос;
б) метод ПЦР - для выявления РНК вируса в биоптатах тканей, слюне, спинномозговой или слезной жидкости;
в) метод ИФА - для выявления специфических антител (антигена) у больных с типичным или атипичным течением.
г) метод биопробы - для выделения вируса на ранних этапах заболевания или для выявления антител в крови или спинномозговой жидкости на поздних стадиях заболевания. Для экспресс-диагностики используется комплексный метод (биопроба + МФА), заключающийся в заражении исследуемым материалом 2-дневных новорожденных мышей и исследования их мозга на 3–4-е сутки в МФА.

Выбор методов прижизненной диагностики в значительной мере зависит от стадии болезни: метод, основанный на выявлении антигенов, как правило, обладает высокой чувствительностью в конце инкубационного периода, в течение первых нескольких дней заболевания, в то время как вируснейтрализующие антитела обычно появляются в спинномозговой жидкости и сыворотке крови после 7-10 дней от начала болезни.

Реакция иммунофлюоресценции . Метод основан на использовании антител, связанных с красителем, например, флюоресцеинизотиоцианатом. РИФ широко применяется для выявления вирусных антигенов в материале больных и для быстрой диагностики.

Метод обладает наиболее высокой степенью чувствительности, он положен в основу экспресс-диагностики и позволяет обнаруживать вирусные антигены в течение нескольких часов

Основные достоинство МФА: быстрота выполнения, высокая специфичность (100%). Затрачиваемое время на диагностику заболевания с его помощью - менее одного дня. Применяются прямой и непрямой варианты МФА.

Прямая иммунофлуоресценция остается наиболее предпочитаемым методом диагностики бешенства. Предметные стекла, содержащие мазки-отпечатки тканей мозга, или стекла с монослоем культуры тканей фиксируют в ацетоне в течение 1–4 часов. Затем препараты высушивают и обрабатывают флуоресцирующими поликлональными антинуклеокапсидными антителами (иммунофлуоресцентный реагент).

Этот реагент представляет собой конъюгат, приготовленный из специфических поликлональных антител IgG класса к нуклеокапсидному антигену вируса и флуоресцеина изоцианата (ФИТЦ). Специфические антитела получают путем гипериммунизации животных (кроликов, хомяков или лошадей) смесью эпитопов нуклеокапсида вируса.

В настоящее время для этих целей все шире используют мышиные моноклональные антитела к нуклеокапсиду вируса бешенства. После 30-минутной инкубации при 37° С диагностические препараты многократно отмывают физиологическим раствором и дистиллированной водой.

Антитела, меченные ФИТЦ, фиксируются только в местах локализации вирусных нуклеопротеидных антигенов. Затем препараты высушивают на воздухе и исследуют методом световой микроскопии, используя в качестве источника света ксеноновую лампу и соответствующий фильтр.

При непрямом варианте антиген сначала соединяют с неокрашенной специфической иммунной сывороткой. Затем на образовавшиеся нефлуоресцирующие комплексы антиген-антитело воздействуют меченой флуорохромом иммунной сывороткой, содержащей антитела к белкам специфической сыворотки. Непрямой вариант МФА наряду с выявлением антигена позволяет количественно определять антитела в исследуемой сыворотке путем соответствующего ее разведения.

Меченые ФИТЦ образования в клетках разных тканей выявляются в виде желто-зеленого флуоресцентного окрашивания на темном фоне (в виде округлой или овальной формы внутрицитоплазматических включений).

Иммуноферментный анализ . Метод основан на принципе сорбции белков на твердой фазе с последующим образованием комплексов антиген-антитело, выявляемых субстрат-индикаторным раствором. Добавляемый в лунки антиген специфически связывается с антителами. На слой антигена наносят исследуемые сыворотки в нужных разведениях. При наличии в них специфических антител последние связываются с антигеном. Для выявления связывания на слой антител наносят иммуноглобулин против глобулинов сыворотки людей, коньюгированный с пероксидазой хрена. Количество сорбирующего коньюгата пропорционально количеству связавшихся с антигеном антител сывороток людей. Это можно определить, используя индикаторный раствор (ортофенилилендиамин + перекись водорода), компоненты которого в результате действия пероксидазы коньюгата окрашивают жидкость в коричнево-желтый цвет. При обследовании неясных случаев применение ИФА дополнительно к методам РП или РСК позволяет увеличить достоверность лабораторной диагностики бешенства, благодаря большой чувствительности этого метода. Метод позволяет обнаруживать инфекционные и дефектные частицы.

Для определения антирабических антител в процессе вакцинации можно применять непрямой метод ИФА, используя в качестве антигена очищенный вирус, а для определения антител класса IgG в человеческой сыворотке - А-белок стафилококка, связанный с пероксидазой хрена. Результаты ИФА сравнимы с полученными в тестах вирусной нейтрализации на мышах. Метод позволяет выявлять присутствие IgМ в начале процесса иммунизации.

Иммуноферментные методы - весьма перспективны для выявления нуклеокапсидного антигена вируса при посмертной диагностике в тканях головного мозга. В их числе, например, быстрый иммуноферментный метод диагностики бешенства, основанный на приготовлении плашек сенсибилизированных антителами IgG изотипа к нуклеокапсиду первого серотипа, разведенных в карбонатном буфере.

Материал для исследования гомогенезируют в буфере или культуральной среде, осветляют центрифугированием, вносят в лунки и инкубируют в плашках. Фиксированный специфическими антителами нуклеокапсидный антиген идентифицируют добавлением пероксидазного конъюгата с антинуклеокапсидными противорабическими антителами иной видоспецифичности и хромогенного субстрата. Чувствительность метода составляет 0,8–1,0 нг/мл.

Этим методом можно выявлять антигены вирусов различных серотипов. Применение конъюгатов нуклеокапсидспецифичных антител, меченых биотином, повышает чувствительность метода до 0,1–0,2 нг/мл.

Методом ИФА успешно выявляется антиген нуклеокапсида , но материал, даже разложившийся, не должен фиксироваться формалином.

Метод полимеразной цепной реакции . Для экспресс-диагностики вируса бешенства и идентификации лиссавирусов наиболее удобен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР - самый надежный и быстрый для выделения вирионной РНК из любых проб, содержащих вирус в низкой концентрации. С его помощью можно создать много копий РНК вируса. Этот метод используется для подтверждения результатов МФА и для определения вируса в слюне, луковицах волос заднего отдела шеи и головы.

ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусоспецифической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок, так называемых праймеров.

Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25–35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для ее определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле.

Особенно высокая чувствительность ПЦР при использовании праймеров, комплементарных N-гену, когда удается выявлять РНК вируса в пробах, содержащих вирус в титре 10 МЛД50. Методом ПЦР можно выявлять РНК вируса даже в разложившемся патологическом материале.

В настоящее время разработаны и широко используются на практике подтверждающие (конфирматорные) тесты, такие как ПЦР в обратно-транскриптазном исполнении (ОТ-ПЦР). Метод ОТ-ПЦР - высокочувствительный и наиболее эффективный. РНК экстрагируется из тканей инфицированного вирусом органа, транскрибируется в кДНК, которая затем амплифицируется методом ПЦР. Для постановки ОТ-ПЦР необходимы праймеры, полученные к консервативным областям генома вируса бешенства. Обычно используются гены, кодирующие нуклеопротеин или N-белок.

Метод ПЦР высокоспецифичен и очень чувствителен. Является одним из наиболее точных тестов детекции рабического антигена, позволяет диагностировать бешенство даже при наличии в материале хотя бы одного вириона. В основе теста лежит комплементарное достраивание РНК-матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента РНК-полимеразы. В последние годы ПЦР находит все более широкое применение для диагностики и мониторинга вирусных инфекций. Однако методика проведения сложна, дорогостояща и пока недостаточно унифицирована для рутинного применения.

Цитологические методы в настоящее время имеют ограниченное диагностическое значение, но при ряде инфекций по-прежнему должны применяться. Исследуются материалы аутопсии, биопсии, мазки, которые после соответствующей обработки окрашиваются и анализируются под микроскопом. При бешенстве - это выявление включений в цитоплазме клеток (тельца Бабеша – Негри).

Выделение вируса . Выделение вируса может быть необходимым для подтверждения результатов тестов по определению антигена и для более детальной характеристики изолятов. И хотя этот метод является одним из самых старых и трудоемких методов диагностики, сегодня выделение вируса с последующей идентификацией с помощью одного из современных методов (ИФА с моноклональными антителами или ПЦР) является наиболее достоверным методом диагностики, т. н. «золотой стандарт».

Результативность методов диагностики бешенства может варьировать в зависимости от ряда факторов (стадии болезни, сроков забора материала, качества полученных проб, условий их хранения, опытности персонала, качества реактивов и др.). Если положительный результат подтверждает бешенство, то отрицательный не всегда свидетельствует об отсутствии болезни. Поэтому при бешенстве эксперты ВОЗ рекомендуют использовать несколько тестов, особенно МФА в сочетании с биопробой на новорожденных (2–3 дневных) белых мышах.

Меры личной профилактики

Все работы с материалом, предположительно содержащим вирус бешенства, равно как и с животными, подозрительными на бешенство, должны проводиться с соблюдением мер личной безопасности. Медицинские работники и ветеринарные врачи должны работать в халатах, перчатках, масках.

По окончанию работы боксы обрабатывают 3% раствором перекиси водорода.

Флаконы, ампулы и инструменты, а также оставшиеся материалы, содержащие вирус бешенства, и всю посуду после работы обеззараживают автоклавированием в течение 1 часов при 1,5 атм (режим «убивки»).

Средства индивидуальной защиты обеззараживают кипячением или автоклавированием. Рабочую поверхность стола и руки обеззараживают дезраствором (0,5% раствор хлорамина).

Бешенство (Б) – остро протекающая болезнь теплокровных животных, характеризующаяся поражением ЦНС. Восприимчивы домашние и дикие животные всех видов, а также человек.

Болезнь регистрируется в различных регионах земного шара. Не отмечено случаев распространения болезни в Австралии, Великобритании, Японии. Заболевание почти всегда заканчивается смертью. Имеются фактически документированные случаи выздоровления от бешенства человека и собак после экспериментальной инфекции.

Вирус бешенства (ВБ) относится к семейству Rhabdoviridae, роду Lyssavirus. В настоящее время установлено, что ВБ имеет 4 серотипа, что обусловлено, видимо, различием в составе мембранных белков. Все варианты ВБ в иммунобиологическом отношении родственны, но различаются по вирулентности. ВБ обладает ГА и ГАД свойствами. Между инфекционной и ГА активностью существует линейная зависимость. Животные, иммунизированные против бешенства, продуцируют ВНА, КСА, антиГА и литические (разрушающие клетки, зараженные вирусом в присутствии комплемента) АТ.

Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, симптомов болезни, патологоанатомических изменений (они имеют меньшее значение) и, главным образом, результатов лабораторных исследований.

Лабораторная диагностика заключается в исследовании головного мозга животных с целью выявления вирусного АГ в ИФ, РДП, обнаружении телец Бабеша - Негри и биопробе на белых мышах.

В Российской Федерации в настоящее время организовано производство наборов для диагностики Б в ИФ и РДП в ВНИТИБП и КазНИВИ.

Выделение вируса. В лабораторию для исследования направляют свежие трупы мелких животных, от крупных животных - голову или головной мозг. В некоторых случаях допускается консервирование головного мозга в 50%-ном глицерине. Труп или голова должны быть тщательно упакованы в полиэтиленовый мешок, мозг - в банку с притертой стеклянной или резиновой пробкой, залитой парафином. Материал упаковывается во влагонепроницаемую тару. Для вирусологических исследований пригоден только не консервированный мозг. Необходимо помнить, что вскрытие трупа, извлечение мозга и другие операции с патологическим материалом следует проводить в условиях стерильности и строгого соблюдения мер личной профилактики: прочно фиксируют голову животного, защищают руки 2-мя парами перчаток (хирургические и анатомические), для защиты глаз надевают очки, а на нос и рот-6-слойную марлевую повязку.

Лабораторные исследования материала на бешенство проводят вне всякой очереди; результаты немедленно сообщают врачу хозяйства и главному врачу района (города).

Порядок проведения исследований: из каждого отдела головного мозга левой и правой сторон (аммонова рога, мозжечка, коры полушарий и продолговатого) готовят по 4 мазка-отпечатки для ИФ и обнаружения телец Бабеша - Негри; с мозговой тканью ставят РДП; при отрицательных результатах ставят биопробу.

Обнаружение специфических телец-включений . Мазки-отпечатки окрашивают по Селлерсу, Муромцеву или другими методами. После окрашивания препараты просматривают в световом микроскопе с иммерсионной системой. Положительным результатом считают наличие специфических телец Бабеша - Негри (при окраске по Селлерсу - четко очерченные овальные или продолговатые гранулярные образования розово-красного цвета в протоплазме, при окраске по Муромцеву - светло-фиолетовые с темно-синими включениями тельца Бабеша - Негри, чаще они расположены вне нервных клеток.

Наиболее характерная особенность телец Бабеша - Негри - их внутренняя структура, позволяющая абсолютно точно дифференцировать их. Внутри видны маленькие зернышки - базофильные зернистости темно-голубого, даже черного цвета величиной 0,2-0,5 мкм.

Диагностическая ценность обнаружения телец-включений для доказательства заражения ВБ общепризнана. Однако и у здоровых животных, в особенности у кошек и белых мышей, имеются образования, присутствие которых может вызвать диагностические затруднения. В отдельных случаях в мозге кошки можно с уверенностью дифференцировать подобные включения от телец Бабеша - Негри, и здесь рекомендуется воспользоваться методами идентификации, в особенности ИФ. Равным образом и у собак, погибших в результате отравления змеиным ядом или поражения электрическим током, можно найти тельца-включения, напоминающие тельца Бабеша – Негри. Тельца Бабеша - Негри выявляют лишь в 65-85% случаев бешенства, поэтому отсутствие их не является отрицательным ответом, и материал исследуется в других тестах (ИФ, РДП, биопроба).

ИФ. Один из основных тестов при диагностике Б. При высококвалифицированном выполнении получают в 99-100% совпадения с методом биопробы. Обычно в диагностической практике используют прямой метод ИФ, который проводят с применением антирабического флюоресцирующего Ig. Фиксацию препаратов в охлажденном (8-10°С) ацетоне проводят не менее 4-х ч. В качестве отрицательного контроля используют мазки-отпечатки головного мозга здоровых белых мышей. Учитывают результаты визуально в люминесцентном микроскопе на основе оценки интенсивности свечения комплекса АГ-АТ. АГ ВБ выявляется в виде ярких желто-зеленых или зеленых гранул различной формы и величины в клетках (чаще вне клеток). Диагноз считают установленным, если в нескольких полях зрения обнаруживают достаточное количество (не менее 10) типичных гранул с ярким зеленым свечением или множество мельчайших точек, В контроле подобного свечения не должно быть.

Для доказательства специфичности свечения комплекса АГ-АТ используют метод подавления ИФ, который заключается в способности рабического АГ, связанного с нефлюоресцирующими AT, вторично не вступать в соединение с флюоресцирующими специфическими AT. Для этого на фиксированные препараты, приготовленные из исследуемого головного мозга, наносят 5%-ный антирабический нефлюоресцирующий Ig, выдерживают 30 мин при 37°С во влажной камере, промывают физраствором, а затем окрашивают флюоресцирующим антирабическим Ig общепринятым прямым методом. В обработанных таким образом препаратах флюоресценции не должно быть.

Метод ИФ дает возможность обнаруживать ВБ в клетках роговицы глаз и предварительно поставить диагноз прижизненно: во время болезни животных, а также за 1-2 дня и более до клинического её проявления. Метод может быть использован для исследования подозреваемых в заболевании Б животных, а также клинически здоровых собак и кошек, покусавших людей и животных. Для этого готовят отпечатки с роговицы, соблюдая все правила личной безопасности, раскрывают глазную щель животного большим и указательным пальцами и на слегка выпяченное глазное яблоко надавливают поверхностью предметного стекла, отступив 0,5 см от конца. Нужно следить, чтобы животное не моргало третьим веком, так как со стекла удаляются эпителиальные клетки и получается некачественный мазок. С каждого глаза делают не менее 2 препаратов, содержащих по 2 отпечатка. Для контроля аналогичным образом готовят отпечатки роговицы от здоровых животных. Их можно приготовить в хозяйстве. Отпечатки высушивают на воздухе, фиксируют в ацетоне в течение 4 ч при 4°С, упаковывают и отправляют в лабораторию. Окрашивают препараты, как при ИФ, по общепринятой методике.

В препаратах, полученных от больных животных или находящихся в конце инкубационного периода болезни, в цитоплазме многих эпителиальных клеток наблюдаются разной формы ярко светящиеся гранулы разного размера - от пылевидных точек до 2 мкм и более. С целью получения достоверных результатов в каждом препарате просматривают по 50-100 клеток, а всего от животного - не менее 200-400 клеток. Результаты микроскопии считают положительными, если в отпечатках роговицы животного обнаруживают 11% и более клеток с характерными очажками свечения. Необходимо иметь в виду, что в препаратах от здоровых животных (контроль), вследствие аутофлюоресценции, могут встречаться единичные клетки с подобными по форме и свечению очажками.

Важно отметить, что ИФ дает возможность ускорить ответ при окончательной постановке диагноза путем биопробы, поскольку диагноз при Б может быть установлен только на 4-8-й день после заражения мышей исследуемым материалом, а инкубационный период заболевания мышей может достигать и 20 дн. ИФ может выявлять ВБ в тканях подчелюстной слюнной железы. Из подчелюстных слюнных желез готовят препараты-мазки, беря материал не менее чем из 6 разных участков железы, так как распределение в ней вируса неравномерно. Часто, чтобы получить отпечаток, приходится делать сильный нажим, поскольку из-за обилия муцина на стекле остается мало материала.

Показана возможность идентификации ВБ в коже методом ИФ, С этой целью берут пробы кожи головы, а также фолликулы сенсорных и тактильных волос морды или латеральных сенсорных сосочков (на щеке собаки). Пробы хранят при -20 или -70°С. Из них делают криосрезы, которые обрабатывают флюоресцирующим глобулином. Результаты ИФ анализа, полученные при идентификации ВБ в коже, в высокой степени коррелируют с данными, полученными при исследовании мозга того же животного. Показана близкая корреляция между обнаружением АГ вируса в пробах мозга и тканях губы методом ИФ.

РДП. Применяют для обнаружения АГ ВБ в неконсервированном головном мозге животных, павших от уличного бешенства, или мышат, используемых в биопробе. РДП ставят микрометодом на предметных стеклах, используя 1-1,5%-ныЙ агаровый гель по общепринятой методике. Наибольший процент положительных результатов выявляют при использовании следующего трафарета: А - аммонов рог (правая сторона); В - кора головного мозга (правая сторона); С - мозжечок (правая сторона); Д - продолговатый мозг (правая сторона); + (плюс) - положительный контроль; - (минус) - отрицательный контроль; 1, 2, 3, 4 - лунки с разведением специфического иммуноглобулина 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 соответственно

Из каждого отдела головного мозга с помощью пинцета готовят гомогенную пастообразную массу, которую и помещают в соответствующие лунки. От мышей исследуют весь головной мозг. Из отделов головного мозга левой стороны готовят АГ аналогичным образом (на каждую экспертизу в общей сложности требуется 4 предметных стекла с агаровьм гелем). Реакцию учитывают через 6, 24, 48 ч. При наличии 1 или 2-3 линий преципитации между лунками, содержащими АГ и иммуноглобулин, реакцию считают положительной.

РДП проста по выполнению и специфична, но процент выявления вирусного АГ в исследуемом материале составляет 45-70. При исследовании головного мозга мышей, полученного при положительной биопробе, РДП выявляет до 100% случаев. Отсутствие в исследуемом материале телец Бабеша - Негри, специфической флюоресценции и отрицательная РДП не дают основания исключить наличие вируса. В этом случае окончательный диагноз ставят по результатам биопробы на белых мышах с последующей идентификацией вируса.

Биопроба. Принято считать, что биопроба является более эффективным методом, чем обнаружение телец Бабеша - Негри, ИФ и др. Однако и она в отдельных случаях оказывалась отрицательной, несмотря на подтверждение диагноза Б путем обнаружения телец-включении и ИФ. Процент отрицательных результатов по биопробе колебался от 1,3 до 12.

Сведения о различной эффективности биопробы могут быть объяснены рядом факторов: выбора экспериментального животного, количества их в опыте, способа заражения, способа и срока хранения материала до поступления в лабораторию. Может играть роль и явление интерференции инфекционных частиц неактивными частицами, если для инокуляции используют недостаточно разведенный материал.

В мозге и слюнных железах лисиц и скунсов, павших от бешенства, обнаружено вещество, ингибирующее инфекционность вируса, что не позволяет провести диагностику болезни у этих животных методом внутримозгового заражения мышей. Наличие ингибирующего вещества в исследуемом материале не препятствует выявлению вирусного АГ методом ИФ; для скунсов и лисиц это самый чувствительный метод диагностики.

Из животных всех видов (кролики, морские свинки, взрослые белые мыши и хомячки), использованных для биопробы, многие отдают предпочтение мышам-сосунам, поскольку они более чувствительны к разным штаммам ВБ и менее опасны в работе. Сирийские хомячки по чувствительности не уступают мышам, но они менее доступны.

РСК. Выявление специфического АГ в РСК при диагностике бешенства применяется реже, чем другие методы. Из присланного для исследования мозга готовят АГ. Для этого мозговую ткань (особенно богаты АГ, связывающим комплемент, кусочки таламуса и стволового отдела мозга) растирают в вероналовом буфере в соотношении 1:10 и оставляют при комнатной температуре на 1 ч, после чего суспензию инактивируют при 56°С в течение 5 ч. Такая обработка убивает вирус и снимает антикомплементарность мозговой ткани, не повреждая специфический АГ. Суспензию центрифугируют 15 мин при 3500 мин- 1 из надосадочной жидкости, которая представляет собой материал для исследования на наличие АГ, готовят 2-кратно возрастающие разведения от 1:2 до 1:64 и используют для исследования в РСК.

ИФА. В ИФА специфическое окрашивание АГ в клетках мозга павших от бешенства животных выявляют как в свежевзятых, хранившихся в глицерине, а также в пробах, хранившихся без глицерина при 20°С 8-18 ч. Данный тест пригоден для рутинной диагностики бешенства у животных, для выявления АГ ВБ в тканевых парафиновых срезах при фиксации препаратов 10%-ным р-ром формалина с рН 5,3 и последующей обработки препаратов, заключенных в парафин, пепсином.

В отличие от РН на мышах и в культуре клеток ИФА позволяет выявить AT у животных в течение нескольких часов, ИФА - наиболее перспективный лабораторный метод обнаружения AT и индикации самого вируса. Экспресс-методом диагностики бешенства является техника захвата и метод ИФ для выявления АГ ВВ. Доказано, что метод выявления АГ ВБ в парафинизированных срезах пероксидазо-антиперокисдазным методом значительно превосходит метод ИФА. В 1987 г. создан набор для быстрой энзимиммунодиагностики бешенства (RREID), приемлемый для эпидемиологических и лабораторных исследований.

Вариантная идентификация с помощью монАТ. С помощью монАТ к гликопротеинам ВБ селектированы АГ варианты, среди которых выделены фенотипически термолабильные (авирулентные) варианты. При использовании 2-х групп монАТ показано, что штаммы дикования отличаются от шт. Fixe (Пастера), CVS, Flury HEP, ERA и "утиных" штаммов по АГ детерминантам. Изучение с помощью монАТ 7-ми штаммов, выделенных от больных Б людей, позволило выявить определенные отличия их от вакцинного штамма в отношении АГ детерминант.

Общепризнано, что AT отличия между дикими штаммами удается обнаружить, используя монАТ против нуклеокапсидного AT N, которые реагируют с цитоплазматическими включениями зараженных вирусом клеток; против гликопротеина (G АГ), которые реагируют с мембранами инфицированных клеток, лизируют эти клетки в присутствии комплемента и нейтрализуют вирус. В связи с возможной АГ вариабельностью поверхностного гликопротеина ВБ из различных географических зон в качестве протективного АГ использовали рибонуклеопротеин, характеризующийся консервативностью АГ структуры. Таким образом, не только G белок, но и РНП ВБ обладают протективной активностью.

. Эти методы для бешенства нетипичны, поскольку используются только с целью проверки поствакцинального иммунитета. Для обнаружения и титрования поствакцинальных AT используют РН, которую ставят общепринятым методом. В качестве АГ используют фиксированный ВБ. РН на клетках ВНК-21 была более чувствительной, чем непрямая ИФ при выявлении AT в сыворотках вакцинированных лис. Кроме того, предложены РТГА и ELISA.

РТГА. Пока еще не нашла широкого применения в диагностической практике из-за наличия в сыворотках крови неспецифических ингибиторов, к которым ВБ высокочувствителен, а главное, ГА АГ, не подвергавшиеся достаточной очистке, обладали низкой чувствительностью. Для приготовления ГА АГ ВБ предложено использовать шт. Москва, выращенный в культуре клеток ВНК-21, после его обработки сапонином с последующей очисткой и концентрированием. ГА отделяют от других компонентов вириона ультрацентрифугированием. Полученный препарат имел степень очистки 99,92%, обладал высокой ГА активностью (1:128), хорошо сохраняющейся в течение 1 мес при рН 5-9.

Перед постановкой РТГА следует проводить умеренную 2-кратную трипсинизацию гусиных эритроцитов для их сенсибилизации. При использовании 0,25%-ной взвеси трипси-низированных эритроцитов (лучше 10 7 клеток в 1 мл) чувствительность РТГА повышается в 4 раза. Для разбавления АГ и сывороток применяют боратно-солевой р-р (рН 9) с добавлением 0,4% бычьего сывороточного альбумина. Взвесь эритроцитов готовят в солевом р-ре с кислым рН, чтобы после соединения со смесью вируса и сывороток, рН которой 9, окончательный рН установился бы в пределах 6,2. После внесения в лунки суспензии эритроцитов панель встряхивают, заклеивают прозрачной пленкой и ставят на лед. Результаты РТГА учитывают через 40-50 мин, а с эритроцитами 2-дн цыплят или макаки-резус - через 1-1,5 ч.

Разработан радиоиммунологический анализ, основанный на способности AT связываться с меченым 125 1-АГ ВБ. Меченый IgG, выделенный из антирабической гипериммунной сыворотки, можно применять для обнаружения АГ ВБ твердофазным РИА. Лучшие результаты получены при использовании фосфатно-солевого р-ра (рН 6,0) с ионной силой 0,01 М и меченого IgG с активностью 200-250 тыс. имп./мин.

Твердофазный конкурентный РИА применим для выявления антирабических AT в сыворотке и гибридомных супернатантах.

Дифференциальная диагностика . Необходимо исключить болезнь Ауески, при которой больные животные неагрессивны, не бывает извращения аппетита. У собак исключают нервную форму чумы. Подозрение на бешенство может возникнуть при инфекционном энцефаломиелите лошадей. Комплекс лабораторных исследований позволяет поставить точный диагноз на бешенство. Предложен новый метод дифференциации различных штаммов ВБ, основанный на рестриктазном расщеплении продуктов амплификации в ПЦР сегмента гена N.

Лабораторная диагностика инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

Инфекционный ринотрахеит (ИРТ, пузырьковая сыпь, инфекционный вульвовагинит, инфекционный некротический ринотрахеит, инфекционный ринит, «красный нос», контагиозная бронхопневмония, инфекционный катар верхних дыхательных путей) – остропротекающая контагиозная болезнь КРС, характеризующаяся преимущественно катарально-некротическими поражениями дыхательного тракта, лихорадкой, общим угнетением и конъюнктивитом, а также развитием пустулезного вульвовагинита при попадании вируса в половые органы животного и абортами. Болезнь распространена повсеместно.

Вирус инфекционного ринотрахеита (ИРТ) КРС относится к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesvirinae, роду Varicellavirus.

В антигенном отношении вирус ИРТ КРС не однороден, существуют варианты. Между вирусами ИРТ КРС и БА существует АГ родство. В организме животных вирус вызывает образование ВНА, КСА. Вирус обладает ГА свойствами в отношении мышиных эритроцитов.

Лабораторная диагностика влючает : 1) выделение вируса из патологического материала в культуре клеток и его идентификации в РН или РИФ; 2) обнаружение антигена вируса ИРТ в патологическом материале РИФ; 3) выявление антител в сыворотке крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в РН или РНГА. Для лабораторной диагностики ИРТ используют набор диагностикумов инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и набор эритроцитарного диагностикума для серодиагностики ИРТ крупного рогатого скота в РНГА.

Диагностику инфекционного ринотрахеита проводят параллельно с исследованием материала на парагриппозную (ПГ-3), аденовирусную (1 и 11), респираторно-синцитиальную инфекции и вирусную диарею. Схема проведения лабораторной диагностики ИРТ аналогична применяемой при диагностике аденовирусной инфекции.

Предварительный диагноз на инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота ставят на основании положительных результатов обнаружения антигена в патологическом материале РИФ с учетом эпизоотологических и клинических данных, а также патологических изменений.

Окончательный диагноз ставят на основании совпадения результатов РИФ с выделением и идентификацией вируса; совпадения результатов РИФ с обнаружением антител в 30% и более вторых проб сывороток в титрах не ниже 1:2 в РН и 1:16 в РНГА и обнаружением 4-кратного и более увеличения титра антител в парных пробах сывороток. Предварительный диагноз ставят в ветеринарных лабораториях в течение 2-3 дней, окончательный - в течение 15-30 дней.

Выделение вируса . Взятие и подготовка материала. В лабораторию направляют патологический материал, взятый в течение первых 2- 3 дней болезни при выраженной клинической картине болезни или с диагностической целью непосредственно при убое от животных с острой стадией заболевания.

От больных животных берут 15-20 проб: смывы со слизистой оболочки носовой полости, глаз, влагалища, препуция, пробы спермы. Для смывов используют стерильные ватно-марлевые тампоны; смывы с препуциальной полости и сперму берут в соответствии с Методическими указаниями по отбору проб, транспортированию и подготовке к вирусологическому исследованию спермы и смыва с препуциальной полости быков; пробы крови, не менее 5 мл, получают в первые 3 дня болезни и через 3 нед от тех же животных в стерильные пробирки. Тампоны с материалом помещают в стерильные пеницил линовые флаконы или пробирки с 2-3 мл стерильного физиологического раствора или раствора Хенкса, содержащего от 500 до 1000 ЕД/мл антибиотиков (канамицин, мономицин, неомицин, пенициллин, стрептомицин и др.).

После свертывания крови стерильно сливают 2-3 мл сыворотки и доставляют последнюю в лабораторию.

Консервирование патологического материала, доставка в лабораторию и его подготовка к исследованию такие же, как при диагностике аденовирусной инфекции.

Пробы спермы до исследования допускается хранить при минус 20 °С не более 5 сут. Сперму исследуют в течение 24 ч после размораживания. Ее разводят 1:10 питательной средой для культуры клеток с добавлением соответствующих антибиотиков (по 500 ЕД на 1 мл), замораживают 2-3 раза при минус 30 °С, оттаивают при 37 °С, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость используют для заражения культуры клеток. Заражение культур клеток. Методика его аналогична таковой при диагностике аденовирусной инфекции. Изолят считается выделенным в случае, если он вызывает стабильное однотипное цитопатогенное действие не менее чем в трех последовательных пассажах. В этом случае возможна его последующая идентификация в РН. Цитопатогенное действие вируса ИРТ в культуре клеток характеризуется образованием окон в монослое, округлением клеток, скоплением их в виде «гроздьев» с последующим отслоением их от поверхности стекла.

Заражение животных. Делают очень редко с целью идентификации вируса инфекционного ринотрахеита. Телятам 6-8-месячного возраста патологический материал вводят интраназально в вагину, под кожу и наносят на конъюнктиву. Если в исследуемом материале есть вирус, у зараженных животных развивается ринотрахеит с конъюнктивитом. От больных телят вирус выделяют главным образом из пораженной трахеи и гортани. У инфицированных животных развиваются симптомы, сходные с наблюдаемыми при естественном течении болезни. Первые клинические признаки болезни появляются через 20 ч после инфицирования и регистрируются 7-10 дней. Зараженные телята, как правило, выздоравливают и остаются вирусоносителями.

Выделить вирус из носовой полости, влагалища и с конъюнктивы удается с 5-го по 10-й день, а нейтрализующие антитела - с 5-8-го дня после заражения. Более высокий титр антител наблюдается после 35 дней, затем начинается медленное снижение.

Установлено, что максимальное количество вируса выделяется во время подъема температуры тела на 4-7-й день болезни и продолжается до 10- 14 дней.

Индикация и идентификация вируса . Обнаружение специфических телец-включений. В ядрах клеток эпителия пораженных слизистых оболочек носовой полости, вульвы, вагины и конъюнктивы находят специфические тельца-включения. Через 18-20 ч после заражения их можно обнаружить и в клетках зараженной культуры ткани, окрашенной гематоксилин-эозином. Биопроба.

Серологическая идентификация

РИФ. Техника постановки ее такая же, как и при диагностике аденовирусной инфекции крупного рогатого скота. Обращают внимание на свечение антигена в цитоплазме и перинуклеарной зоне неповрежденных клеток. Ярко-зеленая флюоресценция в виде гранул или диффузного свечения цитоплазмы не менее чем в 10% клеток позволяет оценить препарат как положительный. Предварительный диагноз ставят при наличии не менее 30% положительных препаратов от общего количества исследованных проб. В мазках из влагалища и конъюнктивы специфическую флюоресценцию отмечали через 24 ч, из препуция - через 48, из носа и трахеи-через 72 ч после заражения. Присутствие специфического антигена удается подтвердить заражением культуры клеток почки телят, в которой обнаруживается специфическая перинуклеарная и диффузная цптоплазматическая флюоресценция, свойственная ринотрахеитной инфекции. Использование культуры клеток почки кролика позволяет освободиться от неспецифического свечения.

Совпадаемость результатов РИФ и патогистологических изменений составляет 87%, а иммунофлюоресценции и вирусологических исследований - 44%. При параллельном исследовании сывороток в РН и РИГА результаты совпадали в 94% случаев.

В полевых условиях РИФ оказалась положительной в 18,5%, а метод вирусовыделения - в 15,9% случаев.

Таким образом, РИФ можно использовать для экспресс-диагноз диагностики ИРТ с последующим подтверждением диагноза вирусологическими методами.

РН. При наличии ЦПД в культурах клеток, зараженных изолятом, и положительной нммунофлюоресценции проводят окончательное типирование вируса в РН. Перед ее постановкой специфическую и отрицательную сыворотки разводят в соотношении 1:10 раствором Хенкса или питательной средой для кулыуры клеток, содержащих ангионотики, и прогревают в водяной бане 30 мин при 56 °С. РН ставят общепринятым методом в первичной культуре ПЭК или перевиваемой линии клеток МДВК.

Результаты РН учитывают по ЦПД вируса, для чего определяют титр типируемого изолята в присутствии специфической и отрицательной (контрольной) сывороток. Титр рассчитывают по методу Рида и Менча и выражают в lg ТЦД 50 /мл.

Затем вычисляют индекс нейтрализации (И) по формуле И = Т 1: Т 2,

где Т 1 - титр изолята в присутствии контрольной сыворотки; Т 2 - титр изолята в присутствии специфической сыворотки.

Видовую принадлежность изолята устанавливают при разности в титрах вируса не менее 2 lg. При индексе нейтрализации от 1 lg до 2 lg реакцию считают сомнительной, в этом случае ее повторяют. Индекс нейтрализации менее 1 lg считают отрицательным. При положительных результатах РН изолят считают полностью идентифицированным.

Приготовление гипериммунной сыворотки для РН. Гипериммунную вируснейтрализующую сыворотку готовят по следующей схеме: подкожно вводят кроликам 1 мл культурального вируса с адъювантом Фрейнда, далее следует трехкратное внутривенное введение вируса в объеме 1 мл с интервалом через 7 дней. Через 10 дней после последней инокуляции вируса кроликов обескровливают, сыворотку замораживают и хранят при минус 30 °С.

РТГА. Ставят ее микрометодом при 4 °С с 0,5 - 1%-ной взвесью эритроцитов белых мышей, разбавитель - трис-буферный раствор с 0,2% бычьего сывороточного альбумина. В качестве антигена используют культуральную вируссодержащую жидкость, которую концентрируют ПЭГ-6000 или ультрацентрифугированием.

После обнаружения гемагглютинирующего агента, определения его гемагглютинирующего титра готовят 4 ГАЕ и проводят его идентификацию в РТГА с эталонной положительной сывороткой.

Иммуноферментная идентификация вируса. Иммунопероксидазный метод можно использовать для исследования прижизненно взятых нозофарингиальных мазков-отпечатков в клетках, полученных из легочных

Кроме того, рекомендован непрямой антикомплементарный иммунопероксидазный метод (НАИП) для лабораторной идентификации вируса ИРТ. Методика заключается в следующем: на покровных стеклах, в пробирках готовят чувствительную культуру клеток к вирусу ИРТ (ПЭК, ТБ и др.) по общепринятой методике. Монослой заражают исследуемым вирусом. Через 48 ч стекла с инфицированными клетками извлекают, отмывают в фосфатно-буферном растворе с рН 7,2-7,4 и фиксируют в охлажденном ацетоне 5-10 мин.

На фиксированный монослой клеток наносят 1-2 капли смеси из специфической иммунной сыворотки и комплемента морской свинки в разведении 1:10. Перед работой противовирусные сыворотки сорбируют гетерологичными исследуемыми вирусами, т. с. получают моносыворотки. При обработке контрольных препаратов на монослой наносят смесь комплемента и нормальной сыворотки.

Препараты инкубируют во влажной камере при 37 °С в течение 40-60 мин, затем промывают проточной водой 5-10 мин, слегка подсушивают и обрабатывают меченной пероксидазой антикомплементарной сывороткой (1-2 капли), предварительно разведенной 1:20 фосфатным буфером, и снова помещают препарат на 40-60 мин во влажную камеру при 37 °С. Затем их промывают, подсушивают и для выявления образовавшегося комплекса (антигенан-титело-пероксидаза) на препарат наносят на 40-60 мин бензидиновый реагент (50 мг бензидина в 100 мл трис-НС1-буфера с рН 6,8 с добавлением после фильтрации 6-7 капель 3%-ной перекиси водорода на каждые 5 мл рабочего раствора). Препарат выдерживают во влажной камере, промывают в дистиллированной воде, высушивают, монтируют на предметном стекле и изучают в световом микроскопе под объективом с иммерсией.

При световой микроскопии непрямой антикомплементарный иммунопероксидазный метод обеспечивает четкое выявление вирусного антигена в цитоплазме инфицированных клеток в виде окрашенных в коричневый цвет образований, которые видны при увеличении в 140 раз.

Специфичность показателей, полученных этим методом, подтверждается постановкой специальных иммунологических контролей. При постановке перекрестной иммунопероксидазной реакции с гетерологичными антителами эта реакция имеет выраженный видоспецифический характер: антиген реагирует только с гомологичной сывороткой. Эндогенная пероксидаза в культуре клеток ПЭК и LF не выявляется.

Непрямой антикомплементарный иммунопероксидазный метод является перспективным при диагностике острых респираторных вирусных инфекций крупного рогатого скота.

При использовании иммунопероксидазного метода для индикации вируса ИРТ в культуре клеток ПЭК антиген выявляется через 18, 22 ч после заражения. Три прямых серологических метода быстрого обнаружения вирусных антигенов (РИФ, иммунопероксидазный и ELISA) одинаково применимы для обнаружения вируса во время лихорадки, но не на поздних стадиях болезни.

Вирусный антиген обнаруживают в носовых смывах методом ELISA с 3-го по 10-й день после заражения. В конъюнктивальных смывах его выявляют на 5-е сутки.

Идентификация вируса ИРТ посредством рестрикционного анализа вирусной ДНК. Описаны метод клонирования фрагментов генома вируса ИРТ, выделение и характеристика рекомбинантного ДНК-зонда, который позволяет определять вирус в клинических пробах. С помощью метода дот-блот-гибридизации выявлена ДНК вируса ИРТ в пробах спермы, полученной от серопозитивных животных, когда выделение вируса в культуре клеток давало отрицательный результат. Хороший результат также получен при использовании инфицированных культур клеток.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика . Антитела к вирусу ИРТ можно обнаружить в сыворотках крови больных и переболевших животных в РН, РНГА и др. Для постановки ретроспективного диагноза используют парные пробы сывороток, взятые с интервалом в 3 нед. Результат серодиагностики учитывают по возрастанию титра антител в парных пробах сыворотки, а также числа серопозитивных животных через указанный интервал. Перед исследованием сыворотки прогревают в водяной бане при температуре 56 °С в течение 30 мин.

РН. Ставят методом разведения испытуемых сывороток с постоянной дозой вируса в культуре клеток "ПЭК или ТБ. Вирус предварительно титруют в культуре клеток. Для этого сухой вирус ИРТ из набора диагностикумоя стерильно разводят в объеме, указанном на этикетке, и готовят из него десятикратные разведения от 10 -1 до 10 -6 на питательной среде (конечный титр су.хого вируса указан на этикетке).

Разведение готовят в общем объеме 5 мл, затем заражают по 4 пробирки с культурой клеток, предварительно отмытой от ростовой среды, каждым разведением вируса в объеме I мл. Зараженные и контрольные культуры клеток (4-6) инкубируют при 37 °С, ежедневно учитывают ЦПД вируса заключительно - на 5-7-е сутки.

Титром вируса считают обратную величину его наибольшего разведения, вызывающего ЦПД в 50% культур клеток, который высчитывают по методу Рида и Менча пли Кербера и выражают в ТЦД 50 /мл. Титры 1:32, 1:64 обнаруживаются редко. В неблагополучных по данной болезни стадах ВНА выявляются у 12% клинически здорового скота. Ретроспективный диагноз на ИРГ ставят при 4-кратном и более приросте AT в пробах сывороток реконвалесцентов. В настоящее время широко используют микрометод РН.

РНГА. Биологическая промышленность нашей страны выпускает эритроцитарный диагностикум. РНГА ставят согласно методическим указаниям в микропанелях с U -образными лунками наборов микротитрования Такачи или Титертек по общепринятой методике. Результаты РНГА с используемыми сыворотками оценивают по титрам; положительные – 1:16 и выше, сомнительные - 1:8, отрицательные - 1:4, 1:2 и нулевые. Увеличение титров АТ в парных сыворотках в 2-4 раза свидетельствует о наличии инфекции. Применяя РНГА, можно обнаружить AT в более ранний период инфекции, чем с помощью РН. Установлено соответствие результатов РНГА и РН в 95% случаев. С помощью данной реакции легче и быстрее, чем РН проводить типирование АТ к вирусу ИРТ. Титры AT были в 7-10 раз выше выявляемых в РН.

РДП. Не нашла широкого применения в диагностической практике, исследователи рекомендуют её использовать для серодиагностики ИРТ. По наличию ПА можно уловить недавно прошедшую инфекцию, в то время как ВНА длительно циркулируют в организме, и заболевание можно уловить по парным сывороткам. При выявлении ПА кровь лучше брать на 8-й и последуюшие дни болезни.

РТГА. Может использоваться для выявления и количественной оценки AT к вирусу ИРТ. Титр анти-ГА коррелирует с титром ВНА. Положительный результат РТГА уже в 1-ом разведении сыворотки (1:4) указывает на наличие AT к вирусу ИРГ в данной пробе сыворотки. 4-кратный и более прирост титров анти-ГА в парных пробах сыворотки является показателем активной инфекции.

ELISA . Широко применяют в Нидерландах, США, Великобритании, Швеции, странах бывшего СССР. Он оказался пригодным для обнаружения AT к вирусу ИРГ в молоке. Для этого достаточно получения проб смешанного молока от 5-10 коров. AT определяют после предварительного концентрирования в них Ig. Совпадаемость данных серологических реакций в пробах сыворотки крови и молока составляла 92,8%. С помощью данного метода можно оперативно определять иммунологический статус поголовья лактирующих коров целого региона, а также проводить обследование экспортируемых и импортируемых животных. В ФРГ разработан и применяется метод ТРАХИТЕСТ для ИФА проб сборного молока поров с целью диагностики скрытого вирусоносительства.

Предложен непрямой метод IgM-ELISA для определения недавней инфекции ИРТ. Ранние AT IgM выделены на 6-й дн после заражения, к 9-му дн происходил рост титра AT Ig, a к 13-му дн - ВНА. У телят, привитых инактивированной вакциной, раннего иммунного ответа не происходило - AT IgM не выявлялись, a IgM и ВНА появлялись позже, чем после заражения. Однако при этом следует иметь в виду, что наличие в сыворотке КРС ревматоидного фактора может привести к ложноположительным результатам диагностики в IgM-ELISA. В этом случае предварительная обработка проб сыворотки антибычьими IgM позволяет избежать ложноположительных результатов. Тест IgM-ELISA имеет большую ценность в диагностике ИРТ, особенно у молодых животных. В группе позитивных сывороточных проб корреляция между ELISA и РНГА составляла 98,3%, a EL1SA с ИФ - 95,7%.

ELISA с использованием монАТ . Основан на конкуренции между AT сыворотки крови КРС и нейтрализующими мышиными монАТ. Для его проведения лунки микротитрационных панелей обрабатывают очищенным вирусом ИРТ, и после высушивания их можно использовать немедленно или хранить при - 20°С. В обработанные вирусом лунки панелей последовательно вносят неразведенную испытуемую сыворотку, специфические к вирусу ИРТ монАТ, конъюгированные пероксидазой, субстрат пероксидазы. Результаты реакции учитывают в спектрофотометре при А405. В случае положительной реакции связывание монАТ ингибируется AT сыворотки крови. Метод оказался намного чувствительнее и специфичнее РН.

Лабораторная диагностика ротавирусной инфекции крупного рогатого скота

Ротавирусная инфекция (РВИ) КРС (диарея неонатальных телят) - остропротекающая контагиозная болезнь новорожденных телят, характеризующаяся поражением ЖКТ. Болезнь широко распространена во всех географических регионах земного шара. Практически ее регистрировали везде, где проводили исследования. Доказана широкая диссиминация ротавирусов (РВ) телят среди животных разных видов и наличие АТ у грызунов (морских свинок, крыс, хомяков, мышей).

На основании эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных ставят предварительный диагноз, окончательный устанавливают лишь лабораторньм методами. Последние базируются на обнаружении вируса или вирусного АГ в фекали больных телят, содержимом кишечника, клетках слизистой оболочки тонкого кишечника павших и вынужденно убитых животных, а также на выявлении АТ к РВ в сыворотках крови больных и переболевших телят и в сыворотках крови и молозиве коров-матерей.

Экспресс-методы диагностики. Разработана тест-система ИФА на основе РВ свиней при выявлении специфического АГ РВ КРС, которая обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Её целесообразно применять в лабораторных условиях для экспресс-диагностики. Поскольку полипептид VР5 содержит перекрестный групповой АГ, локализованный в консервативном домене, который является общим для всех РВ группы А. Показана возможность индикации рота- и коронавирусов методом флюоресцентных зондов и АТ к ним. Он основан на регистрации ранних этапов взаимодействия вирусов с рецепторами клеток.

Выделение вируса. В лабораторию для исследования направляют не менее 10 проб жидких фекалий, тонкий кишечник с содержимым (не позднее 2-3 ч с момента гибели или вынужденного убоя телят), 10-15 проб парных сывороток больных и переболевших животных, 6-10 проб сыворотки крови коров и 6-10 проб молозива. С наибольшим постоянством вирус удается обнаружить в пробах фекалий, взятых в первые дни болезни, поэтому для исследования пригодны фекалии, взятые от 2-14-дн телят с клиническими признаками диареи на 1-3-й день болезни. Сразу же после доставки в лабораторию пробы обрабатывают или хранят при 4°С не более суток, при -20-50°С до 1 мес. Сыворотки крови хранят при 4-10°С не более 1 нед, при -20°С до 1 мес; молозиво - при 4°С не более 2 сут, при -20°С - до 1 мес. Для вирусологических или электронно-микроскопических исследований готовят 10%-ную суспензию фекалий на р-ре Хенкса. Суспензию гомогенизируют и центрифугируют 1 ч при 3 тыс. об/мин, надосадочную жидкость переносят в стерильный флакон, добавляют пенициллин и стрептомицин (по 1000 ЕД/мл), выдерживают 10-12 ч (ночь) при 4°С и исследуют.

Выделение РВ в культуре клеток. Показана корреляция между заболеванием новорожденных телят диареей с присутствием РВ АГ в фекалиях. Следует иметь в виду, что обычными методами вирус не культивируется, а применение дополнительных воздействий - химических (трипсин) и физических (центрифугирование вируса на слое клеток) - дает положительные результаты при высоких концентрациях вируса в фекалиях, что проверяется электронной микроскопией. Для этого содержимое одной пробирки после замораживания и оттаивания и обработки полиэтиленгликолем ресуспендируют в 0,1 мл дистиллированной воды и исследуют в электронном микроскопе. В положительном случае обнаруживают типичные частицы РВ и их скопления. Специфический характер частиц подтверждают методом иммуноэлектронной микроскопии.

Индикация и идентификация вируса. ЭМ и ИЭМ. Метод электронной микроскопии (ЭМ) суспензии вируса из жидкой части фекалий наиболее широко применяется для диагностики инфекции при концентрации вируса в фекалиях не ниже 10 4 -10 5 частиц/мл жидкости. Препараты готовят из осветленной низким центрифугированием жидкой части фекалий, Однако лучшие препараты получают при разведении фекалий дистиллированной водой 1:1-1:10 и последующем осветлении суспензии центрифугированием при 4-10 тыс. об/мин в течение 15 мин. Простой метод приготовления препаратов из фекалий, не уступающий по чувствительности ультрацентрифутированию, состоит в следующем. К 4 мл осветленной низким центрифугированием жидкой части фекалий добавляют 60% насыщенного р-ра (NН 4) 2 SО 4 смешивают, оставляют на 1 ч при 4°С, а затем центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в 4-х каплях дистиллированной воды и готовят препараты. Существуют различные способы и модификации приготовления препаратов из. Наиболее широко используется капельный способ. Более целесообразно применять ИЭМ. Для этого можно использовать сыворотку лабораторных животных (кроликов, морских свинок), иммунизированных РВ обезьян или сыворотку реконвалесцентов. Содержание и специфичность АТ в сыворотках реконвалесцентов могут быть проверены в серологических реакциях с использованием вируса SА 11. При обработке фекальной суспензии иммунной сывороткой одновременно с обнаружением типичных частиц РВ устанавливается их специфичность, на что указывает выявление агрегатов, в которых РВ частицы связаны специфическими иммунными глобулинами. Чаще используют три модификации иммуноэлектронной микроскопии.

При положительном результате РВ частицы выявляются в препаратах в виде специфических скоплений (иммунных комплексов). Оценку специфичности реакции проводят путем подсчета числа и размеров подобных скоплений, а также по степени покрытия отдельных вирионов АТ сыворотки. Выраженность этого эффекта при определенном навыке можно оценивать по шкале условных единиц от 0 до 4-х плюсов.

ИФ. Для обнаружения вирусного АГ в замороженных срезах тонкого кишечника, мазках фекалий и культуре клеток успешно применяют прямой и непрямой методы. При исследовании криосрезов кишечника и мазков из фекалий телят лучшие результаты получают в течение 4-6 ч после обнаружения признаков диареи. Эпителиальные клетки быстро десква-мируются с поверхности ворсинок кишечника и удаляются с фекальными массами. Чаще всего суспензией фекалий заражают культуру клеток и идентифицируют вирусный АГ в реакции ИФ. Разработан прямой метод ИФ в клетках МДВК, инфицированных культуральным или фекальным вирусным материалом. В методических рекомендациях по индикации РВ КРС непрямым методом ИФ предусматривается использование диагностического набора, включающего антиген специфический - культуральную вируссодержащую суспензию клеток ПЭК или МА-104; АГ нормальный - неинфицированную суспензию клеток ПЭК или МА-104; специфическую сыворотку, полученную путем гипериммунизации телят, лабораторных животных; нормальную сыворотку от здорового КРС, не содержащую АТ к РВ; антивидовую сыворотку против глобулинов КРС, конъюгированную ФИТЦ (выпускает Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи). НИФ можно использовать для обнаружения и идентификации РВ АГ в инфицированных культурах клеток, фекалиях и кишечнике больных и павших телят для выявления и количественной оценки АТ к РВ.

РДП. Это - простой и доступный метод выявления РВ АГ в фекалиях больных телят, содержимом кишечника и суспензии слизистой оболочки кишечника павших или вынужденно убитых телят. Для этого 20%-ную суспензию фекалий в фосфатно-буферном солевом р-ре прогревают в водяной бане при 37°С 30 мин, периодически перемешивая. Затем центрифугируют 15 мин при 8000 g. Надосадочную жидкость фильтруют через фильтр "Миллипор" и фильтрат концентрируют в 25 раз при помощи диализного концентратора. В результате всех этапов обработки 0,2 мл концентрата соответствует 1 г исходного материала фекалий. Источником специфических АТ служат сыворотки реконвалесцентов после ротавирус-ного гастроэнтерита, предварительно проверенные в других серологических реакциях.

РДП проводят в геле агарозы на стеклянных пластинках 0,9% агарозы в буферном р-ре, содержащем 0,1 М NaС1, 0,01 М трис(гидроксиметил)-аминометана и 0,001 М этилендиа-минтетраацетата. Компоненты реакции помещают в вырезанные в слое агарозы лунки диаметром 3 мм, отстоящие друг от друга на 3 мм. Пластинки с гелем выдерживают в течение ночи при комнатной температуре, после чего учитывают результаты. Между лунками с АГ и АТ в положительных случаях формируется одна четкая линия преципитации. В РДП испытывается АГ - жидкая часть фекалий или надосадочная жидкость после центрифугирования суспензии фекалий или кишечника, испытуемая сыворотка от переболевших телят, молозиво и молоко в натуральном виде (в виде сыворотки) после обработки сычужным ферментом.

Реакция иммунопреципитации с окрашиванием преципитатов флюоресцирующими АТ может применяться для обнаружения в фекалиях РВ человека и РВ диареи телят. Разработана ее ускоренная модификация. Диагностикум, включающий специфический и нормальный АГ, специфическую сыворотку, готовят по методике ВИЭВ, а в качестве нормальной сыворотки используют фетальную сыворотку или сыворотку безмолозивных телят. Реакцию оценивают по образованию характерных линий преципитата.

РСК. Для выявления АГ применяется реже других методов. Она менее чувствительна, чем электронная микроскопия и РИФ, чаще дает ложноположительные результаты из-за антикомплементарности многих проб фекалий. Однако при обработке фекалий комплементом, фетальной сывороткой, фреоном, очисткой ПЭГ 6000 или ультрацентрифугированием РСК не уступает по чувствительности электронной микроскопии. Реакцию ставят микрометодом со специфической сывороткой или сывороткой недавно переболевших телят, свободной от АТ к другим вирусам.

ВИЭФ. При этой реакции образуется линия преципитации между АГ, движущимся к аноду, и АТ, движущимся к катоду. Качество и чистота агарозы являются основным фактором получения воспроизводимых результатов. Большинство исследователей считают, что этот тест не уступает электронной микроскопии или даже превосходит ее.

ВИЭФ предложен для обнаружения РВ в фекалиях и патологическом материале и для выявления АТ в сыворотках крови. Для исследования берут жидкую часть фекалий. Если для исследования жидкой части недостаточно, то пробы фекалий центрифугируют 10-15 мин при 4 тыс. об/мин при 4-10°С. Исследуют надосадочную жидкость. Кишечник мелко измельчают, добавляют равный объем физиологического р-ра, затем гомогенизируют в ступке со стеклом, центрифугируют 10-15 мин при 2 тыс. об/мин при 4-10°С. Надосадочную жидкость используют в реакции. ВИЭФ ставят в 0,85%-ом р-ре агарозы, приготовленной на 0,5 М веронал-мединаловом буфере (рН 8,6).

Е LIS А. По чувствительности выше, чем ЭИ, ИФ, РСК, ВИЭФ. Может быть использован в прямом и непрямом вариантах, а также в постановке на латексе. С помощью ЕLISА можно обнаружить РВ в фекалиях телят при разведении исследуемой пробы до 1:5000. Описан твердофазный ЕLISА для типирования и деления на подгруппы РВ человека и животных. Для этого используют IgG в концентрации 5 мкг/мл; разведение кроличьей антисыворотки к IgG КРС до 1:400. Продолжительность инкубации IgG -4 ч, реакции АГ РВ с IgG -3 ч, реакции антисыворотки к РВ с комплексом IgG - РВ АГ -16 ч, для соединения с конъюгатом - 4 ч, для изменения цвета субстрата (фосфата Р-нитрофенила) - 10 мин. Перед исследованием фекалии телят разводят в 4 раза фосфатно-буферным р-ром, осветляют центрифугированием и обрабатывают смесью Твина-20 с азидом натрия. Показания ЕLISА в 100% случаев совпадают с результатами электронной микроскопии.

Разработана тест-система ИФА на основе РВ свиней для выявления специфического АГ РВ КРС, которая обладает высокой чувствительностью и специфичностью. В Российской Федерации разработан иммуноферментный диагностикум, выпускаемый ВИЭВ. Набор включает: специфический лиофилизированный РВ АГ - вируссодержащая суспензия, полученная на культуре клеток МА-104, концентрированная ПЭГ 6000 и центрифугированная при 6000g, контрольный АГ, лиофилизированная специфическая антиротавирусная сыворотка, полученная путем гипериммунизации телят или кроликов вирусом, очищенным в градиенте плотности хлористого рубидия; сухие иммуноглобулины, выделенные из гипериммунной антиротавирусной сыворотки методом высаливания насыщенным р-ром (NН 4) 2 SО 4 с последующей ионообменной хроматографией на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.

Существует ряд других методов для выявления РВ АГ в фекалиях больных диареей телят: реакция обратной пассивной гемагглютинации, метод иммуноагрегатной ГА, реакция агглютинации латекса и др. Так, предложен простой стафилококковый метод для обнаружения РВ в фекалиях новорожденных телят с использованием кроличьей сыворотки к РВ телят. Метод основан на обнаружении РВ агглютинирующего стафилококка в 10%-ой суспензии образцов фекалий на предметных стеклах с золотистым стафилококком, нагруженным РВ АТ. Контролем служат стафилококки, обработанные неиммунной кроличьей сывороткой. Агглютинация видна под микроскопом через 2-3 мин после кругового покачивания стекла. Во избежание неспецифических реакций проводят предварительную обработку образцов фекалий нагреванием, фильтрацией и Ы-ацетилцистеином. Такая обработка не снижает специфичности метода. В сравнении с ЕLISА данный метод оказался чувствительнее; преимущества его - скорость, простота и низкая стоимость, что очень важно для скрининга большого числа образцов фекалий.

Метод агглютинации латекса с использованием коммерческого набора Rotalех для выявления РВ в фекалиях больных столь же специфичен, чувствителен, как и методы электронной микроскопии, ИФ и ЕLISА. Для дифференциации подгрупп и серотипов изолятов РВ описан метод гибридизации нуклеиновых кислот, электрофорез в ПААГ вирионной РНК вирусов. Метод точечной гибридизации высоко специфичен, позволяет выявлять 8 нг вирусной РНК и в 10-100 раз более чувствителен, чем ЕLISА.

Вариантная идентификация с помощью монАТ. Получены монАТ к шт. RIT4237 (серотип I) РВ КРС. Нейтрализация АГ выявила вариабельную специфичность к групповым и подгрупповым детерминантам. Использованием монАТ против субгрупповых АГ в ЕLISА было установлено доминирование серотипа II РВ человека в пробах кала больных детей. Наличие таких АТ увеличивает чувствительность и специфичность тест-систем.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика . Серологическое исследование сывороток крови телят имеет весьма ограниченную ценность. В течение первых недель жизни не удается обнаружить прироста АТ, несмотря на прошедшую болезнь. Уровень гуморальных АТ у взрослых животных не позволяет прогнозировать возникновение эпизоотии в стаде.

РСК. Для диагностики РВИ показана возможность постановки РСК с парными сыворотками переболевших животных. В первые дни болезни КСА у большинства животных отсутствуют. К 7-10 дню уровень их возрастает, достигая максимума к 21 дню, затем происходит снижение, и к 30-35 дню титр КСА доходит до нуля. РСК ставят общепринятым методом в микро- и макрообъемах.

РТГА. Ставят по стандартной методике, используемой диагностическими вирусологи-) ческими лабораториями. Применяют стеклянные пробирки и обычные объемы реагентов или одноразовые пластиковые панели с лунками и микрообъемы реагентов. Для постановки реакции используют эритроциты человека группы О или эритроциты морской свинки. Исследуемые сыворотки обрабатывают каолином и эритроцитарной массой (последнее - при использовании эритроцитов человека). Все разведения готовят на физиологическом солевом р-ре с добавлением 0,04 % альбумина сыворотки КРС.

Непрямая ИФ, РН, радиоиммунологический метод ставятся по общепринятым методикам.

Дифференциальная диагностика . РВИ у новорожденных телят следует дифференцировать от коронавирусной инфекции, колибактериоза. Необходимо исключать диспепсию новорожденных телят алиментарного происхождения. Для титрования вирусов группы А разработаны методы дот- и блот-гибридизации РНК с зондами к ДНК геномного сегмента 4, полученными с помощью амплификации в ПЦР гипердивергентных областей гена белка VР4 (нуклеотиды 211-686) к ДНК шт. ИК, IND, NCDV и Сr с использованием олигонуклеотидных праймеров. Зонды 3 типоспецифичны (VР4) и не реагируют перекрестно с 2-нитевыми РНК гетерологичных Р-типов РВ.

Лабораторная диагностика вирусной диареи

крупного рогатого скота

Вирусная диарея - болезнь слизитых оболочек (ВД-БС) - инфекционная контагиозная болезнь КРС, преимущественно молодых животных, характеризующаяся эрозивно-язвенным воспалением слизистых оболочек пищеварительного тракта, ринитом, увеличением лимфоузлов, высокой лихорадкой, общим угнетением, лейкопенией, постоянной или перемежающейся диареей, эрозивным и язвенным стоматитом с обильным слюноотделением, появлением слизисто-гнойных истечений из носовой полости. У коров возможны аборты. Впервые как самостоятельное заболевание ВД-БС была определена в штате Нью-Йорк (США) в 1946 г. при вспышке острой, часто со смертельным исходом болезни КРС, характеризовавшейся диареей и эрозийными поражениями ЖКТ. В настоящее время ВД-БС широко распространена на территориях многих стран и вместе с 2-мя другими пестивирусами (ВКЧС и вирус ПБО) инфицирует 173 вида домашних и диких жвачных животных и 11 видов свиней. Имеются публикации об обнаружении АТ и АГ пестивируса у человека, но возможность его инфицирования только предполагается.

На основании различий в клинических проявлениях вирусную диарею и болезнь слизистых оболочек КРС первоначально рассматривали как разные болезни. Позднее на основании анализа патологических изменений, особенностей эпизоотологии и клинических проявлений эти 2 болезни стали обозначать под названием вирусная диарея - болезнь слизистых оболочек КРС. Поскольку установлена идентичность возбудителей этих болезней, то их считают одной инфекцией с различными клиническими проявлениями, преимущественным развитием респираторного или диарейного синдрома, в связи с чем болезнь чаще стали называть вирусная диарея КРС.

Болезнь зарегистрирована во всех странах мира. В некоторых штатах США обнаруживается до 70-90% серопозитивных животных.

Диагноз ставят на основании клинических, эпизоотологических данных и лабораторных методов исследования. Однако эпизоотологические данные, симптомы болезни и характер патологических изменений дают основание лишь заподозрить болезнь. Поскольку ВД-БС напоминает многие другие болезни (чуму, инфекционный язвенный стоматит, грибковый стоматит, ПГ-3, катаральную лихорадку КРС, паратуберкулез и алиментарные отравления), лабораторные исследования в диагностике имеют решающее значение. При постановке диагноза на ВД-БС следует учитывать следующее: заболевают отдельные животные в возрасте 3-36 мес, типичные клинические изменения проявляются поражением слизистых оболочек или кровянистым поносом с эрозией или без эрозии слизистых мембран, все заболевшие животные погибают в течение нескольких дней, у больных животных нет специфический АТ в крови, хотя остальное поголовье имеет их в высоких титрах.

Лабораторная диагностика ВД-БС включает: 1) обнаружение в патологическом материале (мазках, отпечатках, срезах), полученном от больных животных АГ в РИФ; 2) выдм ление возбудителя из патологического материала в культуре клеток ТБ, ПЭК или Л ЭК него идентификация в РН или РИФ; 3) выявление АТ в сыворотке крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в РСК и РН.

Лабораторную диагностику ВД-БС проводят с использованием набора диагностикумов, выпускаемых биологической промышленностью. Ее ведут параллельно с исследованием материала на ПГ-3, аденовирусную (адено 1 и 2), РС и ИРТ.

Предварительный диагноз на ВД-БС КРС ставят на основании положительных результатов обнаружения АГ в патологическом материале в ИФ и ПЦР с учетом эпизоотологичм ских и клинических данных, а также патологоанатомических изменений. Окончательный диагноз ставят на основании: совпадения результатов ИФ с ПЦР, выделением и идентификацией вируса; совпадения результатов ИФ с обнаружением АТ в 30% и более вторых проб парных сывороток в титрах не ниже 1:4 в РСК и 1:16 в РН; обнаружения 4-кратного и более прироста АТ в парных пробах сывороток. Предварительный диагноз ставят в ветеринарный лабораториях в течение 2-3 дн, окончательный - до 30 дн.

Выделение вируса. В лабораторию направляют патологический материал от больных животных, взятый в первые 2-3 дня при выраженных симптомах болезни или от животных, убитых с диагностической целью в острой стадии заболевания. От боли ных животных берут 15-20 проб следующего материала: смывы со слизистой оболочки носовой полости, получаемые путем введения стерильного ватно-марлевого или поролоновом тампона в носовые ходы; пробы крови в первые 3 дн болезни и через 3 нед от тех же животных с соблюдением правил асептики в стерильные пробирки по 8-10 мл; соскобы с изъязи ленных или эрозированных участков слизистых оболочек ротовой полости и носового зер кала, взятые жесткими ватно-марлевыми тампонами или скальпелем. Тампоны с материя лом помещают в стерильные пеницилли новые флаконы или пробирки с 2-3 мл стерильной физиологического р-ра или р-ра Хенкса, содержащего 500-1000 ЕД/мл антибиотике (канамицина, мономицина, неомицина, пенициллина, стрептомицина и др.). Из крови послесвертывания стерильно сливают 3-4 мл сыворотки и доставляют в лабораторию.

От животных, убитых с диагностической целью, берут с соблюдением правил асептики кусочки легких с бронхом (на границе пораженного и здорового участков), селезенки, средостенные, бронхиальные и брыжеечные лимфоузлы, миндалины, пораженные участки слизистых оболочек носовой и ротовой полостей, трахеи, ЖКТ, а также пробу крови. Кусочи материала массой до 20 г помещают в стерильную, плотно закрывающуюся посуду. Легче вирус выделить в начале болезни и в период обострения из крови, легких, различных учая ков тонкого кишечника (в особенности из клеток слизистой оболочки 12-перстной кишки лимфоузлов и селезенки. При хроническом течении болезни его удается регулярно выделяй из разных отделов кишечника, но не из крови. Исследование носовых смывов и фекалий в этих случаях также дает отрицательные результаты, хотя в отдельных случаях вирус выделяли из фекалий даже через 5 мес после болезни. В начале болезни в период поди ема температуры от больных животных берут пробы крови в р-р цитрата натрия или геля рина и помещают их в термос со льдом. Из крови экспериментально зараженных животных выделяли вирус с 1-14-го дн после заражения. Выделяли его также из тканей абортированных или мертворожденных плодов, плаценты и околоплодной жидкости.

Заражение культур клеток. Вирус выделяют в первичных субкультурах клеток эмбриона КРС (ПЭК, ЛЭК, СЭК) или ТБ. Изолят считается выделенным в случае, если он вызывает стабильное однотипное ЦПД не менее чем в 2-х последовательных пассажах. В этом случае возможна его идентификация в РН. В первичных культурах клеток почки эмбриона коров первые ЦПИ обнаруживают через 2-5 дн после инокуляции. Они выражаются в появлении мелкозернистой инфильтрации в клетках фибробластоидного типа. По мере развития инфекции клетки постепенно отторгаются от поверхности стекла, но некоторые долго сохраняются, образуя островки клеток эпителиоидного типа. В конце концов на стекле остается только сеть зернистого материала.

При использовании вторичных культур клеток цитопатические изменения появляются почти одновременно во всех клетках монослоя, причем они становятся удлиненными, угловатыми и кажутся переплетенными. В окрашенных препаратах клеточного монослоя при наличии цитопатических изменений обнаруживают вакуолизацию протоплазмы и изменение ядер, выражающиеся в сокращении мембраны, пикнозе и кариорексисе. В некоторых случаях вакуолизация бывает так выражена, что ее наблюдают при микроскопии неокрашенных препаратов. Развитие ЦПИ не соответствует возрастанию титра вируса. К 72-96 ч после инокуляции, когда титры вируса достигают максимума (10 5,5 -10 6,5 ТЦД 50), отмечают лишь начало ЦПД. При отсутствии ЦПД в 3-х последовательных пассажах клеток 4-й пассаж проводят с попыткой выявления вируса в монослойной культуре на покровных стеклышках в ИФ. При отрицательной реакции дальнейшее исследование прекращают. Однако отрицательный результат в этом случае не дает права на постановку диагноза. Для идентификации таких штаммов японские исследователи предлагают использовать феномен экзальтации вируса БН в присутствии возбудителя ВД-БС. Сущность метода сводится к появлению ЦПИ при совместном выращивании этих агентов в культурах клеток тестикулярной ткани КРС. Методика исследования заключается в следующем. Диспергированные трипсином клетки тестикулярной ткани КРС суспендируют до концентрации 210 6 клеток в 1 мл в 0,5%-ном р-ре ГЛАХ с сывороткой КРС, проверенной на отсутствие ВНА к возбудителю ВД-БС. Суспензию распределяют по 0,5 мл в пробирки. В каждую из них инокулируют по 0,5 мл вирусного материала (разведенного ВД) и инкубируют при 37°С в наклонном стационарном положении. В качестве контроля в каждый опыт включают не инокулированные культуры. После 4 дн инкубцрования жидкость удаляют, а культуры заражают вирусом БН (10 6 БОЕ в 0,5 мл среды). После дополнительного 3-дн инкубирования при 37°С культуры исследуют на наличие ЦПД. В культурах, первоначально инфицированных нецитопатогенным штаммом ВД, после заражения вирусом БН появляется четко выраженные ЦПИ. В контрольных культурах один вирус БН обычно не вызывает ЦПИ. Незараженные культуры, в которые не вводили ни одни из вирусных агентов, должны оставаться нормальными.

Для пассирования не цитопатогенных штаммов культуры, инокулированные вирусом диареи каждого пассажа, инкубируют 3 дн при 37°С, после чего собирают культуральную жидкость, которую используют для дальнейших пассажей, а культуры инфицируют вирусом БН и дополнительно инкубируют для индикации ВД при помощи феномена экзальтации.

Заражение телят . Биопробу на телятах ставят в тех случаях, когда попытки выделить специфический вирус оказались безуспешными или возникает сомнение в его наличии в связи с тем, что в зараженных культурах клеток нет ЦПИ. Используют телят 2-6-мес возраста, проверенных на отсутствие ВНА к ВД, или телят 4-6-дн возраста, полученных из благополучного хозяйства. В качестве материала для заражения используют культуральную жидкость 3-5 пассажей, 5-10 мл которой вводят внутривенно. Если в исследуемом материале есть вирус диареи, у телят на 4-7-й день после заражения отмечают повышение температуры, лейкопению, появление слизистых истечений из носовой полости и диарею; у некоторых животных могут отмечаться тенезмы. В случае положительного результата у зараженных животных вирус сравнительно легко удается выделить из крови. В наибольшей концентрации (10 3 -10 5 ИД 50 /мл) вирус обнаруживают через 4 дн после заражения, хотя присутствие его в крови подтверждается на протяжении 15 дн.

Серологическая идентификация.

ИФ. Аналогична таковой при диагностике аденовирусной инфекции. Этим методом АГ ВД обнаруживают в клетках слизистой оболочки прямой кишки, селезенки, легких и лимфоузлов экспериментально зараженных животных. Изучено распределение АГ ВД-БС в тканях животных остром и хроническом течениях болезни. В лимфоидных тканях АГ располагается в клетках системы фагоцитирующих мононуклеаров. Между первоначальным обнаружением АГ в слизистой кишечника, кератинизированном эпителии верхних отделов пищеварительной системы и кожи и прогрессированием патологических признаков имеется скрытый период.

ИФ биопсийного материала слизистых оболочек ротовой и носовой полостей пригодна для ранней прижизненной диагностики вируса диареи. ИФ для обнаружения АГ вируса в клетках из носоглоточных смывов - надежный и быстрый способ выявления животных, персистентно инфицированных вирусом. При исследовании препаратов обращают внимание на свечение АГ в цитоплазме не разрушенных клеток. Яркая зеленая флюоресценция в виде гранул или диффузного свечения цитоплазмы не менее чем в 10% клеток позволяет оценить препарат как положительный. Предварительный диагноз ставят при наличии не менее 30% положительных препаратов от общего количества исследованных проб. Удобным оказался непрямой метод ИФ с использованием конъюгированных РаЬ-фрагментов АТ из гипериммунной свиной сыворотки против ВД-БС КРС. Специфическая флюоресценция вирусного АГ в культуре бычьих макрофагов обнаруживалась в цитоплазме клеток. Для идентификации не цитопатогенных изолятов метод ИФ практически единственный. При наличии ЦПД в культурах клеток, зараженных изолятом, и положительной флюоресценции проводят окончательное типирование вируса в РН.

РН. Это основной метод идентификации вируса. Новые изоляты возбудителя ВБ-БС, не обладающие цитопатогенной активностью, могут быть идентифицированы при помощи гипериммунной сыворотки к вирусу диареи по подавлению феномена экзальтации вируса НБ, который используют для индикации подобных штаммов.

РДП. Обеспечивает быструю и точную постановку диагноза, однако пока чувствительность метода невелика, и его следует использовать в комплексе с другими методами лабораторной диагностики и идентификации возбуди теля. Приготовление испытуемого АГ и методика постановки РДП описаны ранее. Антисыворотку для РДП готовят на КРС. Для иммунизации животных используют нитрированную кровь, взятую асептически от экспериментально зараженных животных в период подъема температуры. Кровь вводят внутривенно (некоторым животным делают несколько таких инъекций). Кровь берут через 60-90 I дн после инокуляции.

Выявление вируса ПЦР. Данный метод рекомендован для быстрой диагностики ВД-БС. После цикла обратной транскрипции образцы ткани инфицированной культуры клеток. подвергают амплификации с использованием праймеров, обеспечивающих репликацию определенного сегмента гена белка gр48 ВД. Для обнаружения амплифицированных последовательностей используют электрофорез в ПААГ и гибридизацию с биотинилированным, ДНК-зондом на последовательности генома вируса лейкоза. При идентификации молочных стад, инфицированных вирусом ВД-БС КРС, также предложен метод ПЦР для работы с пробами молока. Вирусную ДНК выделяют из соматических клеток цельного молока методом экстракции изотиоцианатом гуанидина и фенолом-хлороформом. При острой инфекции РНК вируса обнаруживалась через 6-10 дн после заражения, а при хронической - с использованием обоих праймеров (5"-нетранслируемая область (S"-НТ) и область р80) до разведения молока 1:640. ПЦР оказалась в 14,6 раза чувствительнее других методов выде ления вируса. Для выяснения РНК ВД методом ПЦР необходимо не менее 580 соматических клеток, тогда как для выделения вируса - не менее 8500 клеток. Чувствительность и специфичность ПЦР подтверждена гибридизацией по Соузерену. Чувствительность метода превышает чувствительность выделения вируса в культуре клеток в 10 2 -10 4 раза. Показана возможность обнаружения персистентной инфекции ВД-БС КРС методом ДНК-гибридизации и ПЦР.

Биотинилированные зонды комплементарной ДНК уже широко используются для обнаружения пестивирусов (КЧС, ВД-БС КРС и ПБО). В Бельгии разработан метод обнаружения специфических АТ к ВД с помощью ИФА, проводимого с рекомбинантным АГ и монАТ. ИФА с монАТ удобен для выявления виремии у животных; с его помощью в лейкоцитах обнаруживали 2 родственных неструктурных белка (р80К и р120-130К). Вирусный АГ был обнаружен в В- и Т-лимфоцитах, моноцитах. Помимо общепринятого метода ИФА предложена иммуноферментная реакция захвата АГ ВД КРС в лимфоцитах периферической крови КРС. В реакции для захвата АГ используют монАТ к консервативному АГ домену неструктурного белка (р125/р80) ВД.

Кроме ИФА разработан и предложен метод взаимодействия специфической антисыворотки с вирусным АГ ВД в лимфоцитах инфицированных животных с помощью проточной цитометрии. Метод отличается высокой чувствительностью и специфичностью. Для повышения чувствительности реакции лимфоциты фиксируют, их клеточные мембраны солюбилизируют, и вирусный АГ выявляют при использовании биотинилированных Ig из антисыворотки свиней с последующей инкубацией с ФИТЦем, конъюгированным авидином.

ИФА. ИФА позволяет легко идентифицировать культуры клеток, инфицированные В Д. Идентификация с помощью монАТ в практическом диагностическом применении не разработана. Однако получено 5 монАТ (XI А9, АЕЗЕ2, АМ2G5, ВТ48, ВТ6G9) против вируса ВД-БС КРС с ВН-активностью, которые позволили разделить изоляты ВД на 4 группы. Получена и изучена панель монАТ против Singer-изолята, с помощью которой были обнаружены полипептиды мол.м. 56-58 кД и доказано, что гликопротеин, локализуется на поверхности вирионов и является носителем нейтрализующих эпитопов. Анализ с панелью монАТ показал АГ гетерогенность среди изолятов этого вируса.

Серодиагностика заболевания затруднительна, так как при хроническом течении инфекции АТ обнаруживаются непостоянно и бывают в невысоких титрах. Диагноз на прошедшую инфекцию, а также латентное вирусоносительство обычно ставят при помощи РН в культуре клеток, определяя титры АТ в сыворотках реконвалесцентов. Для этого лучше исследовать парные сыворотки, взятые с интервалом 3-4 нед. При диагностике скрытого течения инфекции чаще используют сыворотки крови убойного скота, поступающего с клиникой не диагностированной инфекции кишечного и респираторного трактов. Обычно в таких случаях процент положительных сывороток (титры от 1:16 до 1:128) варьирует в широких пределах и может достигать 30-50 (иногда до 80). У клинически здоровых животных процент положительных проб может колебаться от 6-8 до 20-30. Динамика появления и угасания титров ВНА недостаточно изучена. Перед исследованием сыворотки прогревают в водяной бане при температуре 57-58°С 30 мин.

В США разработан быстрый количественный метод титрования ВД КРС. Он состоит в микротитровании с использованием цитопатогенных и не цитопатогенных изолятов вируса и перевиваемой линии клеток бычьей почки - МДВК. Для этого серийные разведения вирус-содержащей жидкости и суспензию клеток в концентрации 1-10 5 в среде с 2% сыворотки крови лошади заливают в лунки пластин Теrasaki и проводят микротитрование в НИФ, которую учитывают на дне лунок пластин, используя водно-иммерсионный объектив микроскопа. Вирус также титруют и по бляшкообразованию. Специфическую флюоресценцию в клетках наблюдали уже через 12 ч после заражения, окончательные результаты считали через 72 ч инкубирования. Результаты титрования вируса по бляшкам и в микротитровании совпадали. Микротитрование вируса по ИФ имеет ряд преимуществ над стандартным методом титрования по бляшкам: требует меньше времени и материалов и особенно незаменимо при титровании не цитопатогенных изолятов ВД.

РН. Её ставят методом разведения испытуемых сывороток с постоянной дозой стам дартного вируса в культуре клеток ПЭК или ТБ. Положительными считают сыворотки титром АТ 1:16 и выше, в парных сыворотках - повышение титра АТ во второй пробе в раза и более. При экспериментальном заражении у всех телят через 15-61 день обнаруживали ВНА в титре 1:64 - 1:1024. Реакция, суть которой заключается в подавлении образованя бляшек АТ исследуемой сыворотки, оказалась пригодной для серологических исследований при ВД-БС. После получения гомогенного слоя клеток культуру промывают 1 раз фосфатным буферным р-ром и заражают 15 мл суспензии вируса в таком разведении, чтобы в 1 мл ее содержалось около 20 БОЕ. После адсорбции вируса при 37°С в течение 30 мин суши зию отсасывают и наносят на культуру 15 мл агара. После застывания агара на его повед ности раскладывают кружки фильтровальной бумаги, насыщенной неразведенной иссм дуемой сывороткой. После 4 дн инкубации при 37°С учитывают результаты. Доказательством того, что исследуемая сыворотка содержит АТ, служит отсутствие повреждения слоя клеток вокруг насыщенного ею кружка фильтровальной бумаги, что обнаруживается в виде венка клеток.

РСК. Ставят микрометодом с использованием микротитратора Такачи или Титертека. При их отсутствии возможна постановка РСК в пробирках в общем объеме 0,5 мл.

РДП. Не нашла широкого применения в ветеринарной диагностической практике при обнаружении АТ в сыворотках животных. ПА появляются в сравнительно поздние сроки (3-4 нед) после инфицирования и могут сохраняться 4 мес (титры АТ до 1:16).

Е LIS А. В 500 раз чувствительнее РН, менее трудоемок и быстрее выполним. В качесм АГ использовали вирус, концентрированный ПЭГ и очищенный градиентным равновесии ультрацентрифугированием. Оптимальная концентрация АГ составляла 1 мкг на лунку.

Дифференциальная диагностика . При постановке диагноза на ВД-БС необходимо исключить ИРТ, аденовирусную инфекцию, ПГ-3, злокачественную катаральную лихорадку, ящур, паратуберкулезный энтед и др. Ввиду того, что ВД-БС может проявляться в различных формах (от острой до латентной), часто ассоциируется с такими инфекциями, как ПГ-3, аденоинфекция, хламидиозы др., для окончательного диагноза необходимы лабораторные исследования. Лишь в качесд подозрения на ВД-БС следует учитывать быстрое распространение в стаде болезни, сопровождающейся лихорадкой, диареей, эрозиями в ротовой полости и ранней лейкопенией.

Лабораторная диагностика парагриппа -3 крупного рогатого скота

Парагрипп-3 (ПГ-3) КРС (транспортная лихорадка КРС, параинфлюэнца-3) - острая контагиозная вирусная болезнь, главным образом телят, характеризующаяся поражением органов дыхания.

В настоящее время ПГ-3 зарегистрирован во всех странах мира с развитым животноводством.

Лабораторная диагностика включает: а) обнаружение АГ в патологическом материале (мазках, отпечатках, срезах), полученном от больных животных в РИФ; б) выделение возбудителя из патологическо го материала в культуре клеток почки эмбриона коровы (ПЭК) или легких эмбриона коровы (ЛЭК) и его идентификацию в РТГА, РИФ и др.; в) выя вление АТ в сыворотке крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в РТГА. Лабораторную диагностику ПГ-3 проводят с использованием набора диагностикумов, выпускаемого биологической промышленностью. Ее обычно ведут параллельно с исследованием материала на аденовирусную и РС-инфекции, ИРТ и ВД-БС КРС. Схема проведения исследований на ПГ 3 аналогична схеме диагностики аденовирусной инфекции КРС. Предварительный диагно: на ПГ-3 ставят в течение 2-3 дн на основании положительных результатов обнаружения АГ в патологическом материале в РИФ с учетом эпизоотологических и клинических данных, а также патологоанатомических изменений, а окончательный - в течение 10-30 дн на основании совпадения результатов РИФ с выделением и идентификацией вируса. В настоящее время для быстрой индикации вируса ПГ-3 может быть использована ПЦР; г) обнаружение 4-кратного и более прироста АТ в парных пробах сывороток.

Выделение вируса . Ввиду малой устойчивости парагриппозного вируса испытуемый материал рекомендуется помещать в контейнеры с обычным льдом, немедленно доставлять в лабораторию и сразу же использовать для заражения культуры клеток. Если сделать это невозможно, нужно заморозить материал в смеси сухого льда и спирта и хранить при - 20-60°С до исследования.

ВПГ-3 выделяют в первичных субкультурах клеток ПЭК, ЛЭК, ПТ, ТБ и др., которые готовят по общепринятой методике. Для парагриппозных вирусов характерным является диффузный характер РГАд, которая проявляется раньше, чем ЦПД вируса.

Первые ЦПИ зараженной культуры можно наблюдать иногда спустя 48 ч после инокуляции. Они состоят в появлении округлившихся клеток, сильнее преломляющих свет, в дальнейшем образуется синцитий и дегенерация клеток. При отрицательном результате в первом пассаже проводят второй пассаж на том же виде культуры клеток. Параллельно с пробирочными культурами ее выращивают и на покровных стеклах для ИФ. Всего рекомендуется не менее 4-х "слепых" пассажей. Изолят считают выделенным, если он вызывает стабильное однотипное ЦПД и положительную ГАд. В этом случае возможна его идентификация в РТГАд, РН, РТГА и других реакциях. Метод выделения вируса на эмбрионах менее чувствителен, чем заражение культур клеток и применяется сравнительно редко.

Заражение естественно-восприимчивых животных. Применяют редко вследстви; дороговизны и большой трудности в подборе телят, восприимчивых к ПГ-3, не имеющих специфических АТ. Заражать восприимчивых животных вирусом ПГ-3 лучше нанесением на слизистую оболочку носовой полости и трахеи. От экспериментально зараженных телят вирус удается выделить из экссудата носовой полости во время подъема темпера туры или же из крови на 4-6-й день после интраназального и на 2-й день после внутривенного заражения. С носовым истечением вирус обычно выделяется со 2-го по 10-й день.

Индикация и вируса . В клетках НеLа и КВ вирус размножается менее активно, чем в клетках почки теленка. В культуре этих клеток, а также клеток почки обезьяны, помимо синцития, вирус вызывает образование цитоплазматических, а иногда внутриядерных включений. Их находят и в эпителиальных клетках бронхов и бронхиол.

Для ускоренной индикации вирусов ИРТ, ПГ-3 стафилококки обрабатывают иммунной сывороткой. Готовят мазок, на который наносят исследуемый вируссодержащий материал, обрабатывают его иммунной противовирусной сывороткой и вирусспецифическим иммуноглобулином, меченым ФИТЦем. По специфическому свечению на поверхности стафилококка осуществляют индикацию вируса. При использовании ускоренного метода индикации время индикации сокращается до 3-4 ч.

Серологическая идентификация

РИФ. В основном АГ локализуется в цитоплазме клеток, однако в ранние сроки инфицирования одновременно наблюдается свечение ядрышек. Парагриппозный АГ выявляют в первые дни болезни и до 10- 14 дня. При осложненных формах болезни АГ выявляют более длительное время. В некоторых случаях его удается выявить даже во время инкубационного периода, за 1-2 дня до появления клинических симптомов. Специфичность ИФ составляет 94% при сопоставлении с результатами серологического исследования. Существует однозначное мнение о большей чувствительности ИФ по сравнению с РГАд при индикации па-рагриппозных вирусов, что делает ее перспективной для быстрой диагностики.

РТГАд. Является быстрым методом идентификации выделенного вируса. Для этого используют иммунные сыворотки кроликов или морских свинок. РТГАд ставят общепринятым методом с эритроцитами морской свинки. Исследуемый вирус считают идентифицированным, если иммунная сыворотка к ПГ-3 блокирует гемадсорбцию.

РНГАд. Используют 100 ГАд единиц вируса. По реакции гемадсорбции вирус ПГ-3 можно титровать в культуре ткани, используя для заражения культуры последовательные 10-кратные разведения. После 3 дн инкубации ставят РГАд с содержимым всех пробирок и регистрируют наличие гемадсорбции. За одну ГАд единицу принимают конечное разведение вируса, вызвавшего гемадсорбцию. Положительная РГАд в контрольных пробирках, отсутствие реакции в пробирках со смесью вируса и сыворотки свидетельствует об идентичности выделенного вируса данному типу сыворотки.

РТГА. Применяется для типирования выделенного вируса при наличии в жидкой фракции зараженных культур клеток гемагглютинина в титре, достаточном для выбора 4 ГАЕ. Следует иметь в виду, что вирус парагриппа, выращенный в культуре клеток почки КРС, агглютинирует эритроциты гусей, индюков и морских свинок, в отличие от эритроцитов кур и уток. Агглютинация развивается в следующие сроки: эритроциты гусей за - 1-3 мин, индюка - за 2-5, морской свинки - за 60-90 мин. Наиболее высокие и стабильные титры выявляются с эритроцитами индюка и при значениях рН: эритроциты гусей при 5,7; индюка 5,7-7,2; морской свинки 6,8-7,2. Иммунные сыворотки, используемые в РТГА, должны быть освобождены от термолабильных и термостабильных ингибиторов, для этого сыворотки прогревают при 56°С 30 мин и обрабатывают каолином или фильтратом холерного вибриона. РТГА ставят общепринятым методом.

Иммуноферментная идентификация. Сотрудниками ВНИТИБП разработана методика идентификации вируса ПГ-3 в ЕLISА.

Иммунодиффузия (ИД) может быть с успехом использована для диагностики ПГ-3 инфекции. В ИД выявлено 2 линии преципитации, что соответствует 2-м АГ ПГ-3.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. При серологической диагностике ПГ-3 КРС исследуют парные сыворотки телят или взрослых животных для выявления прироста АТ. Интервал между взятием проб 2-3 нед. РГА, РН, РЗГАд и РСК дают в целом идентичные результаты при исследовании АТ в период развития болезни и реконвалесценции. Однако РТГА самая чувствительная и самая простая. Кроме исследования парных сывороток крови, при серодиагностике ПГ-3 рекомендуется метод выявления секреторных АТ в РТГА. Для этого берут парные пробы носовых секретов от 8-10 животных, проявивших клинические признаки болезни (повышение температуры, истечения из носовой полости и др.), и повторяют исследования через 6-8 дн.

Перед постановкой РТГА пробы размораживают, центрифугируют 10 мин при 2 000 мин- 1 , затем обрабатывают следующим образом: к 0,2 мл надосадочной жидкости добавляют 0,2 мл 20%-ной суспензии эритроцитов морской свинки, встряхивают, выдерживают 30 мин при 4°С, 10 мин центрифугируют при 1500 мин- 1 ; надосадочную жидкость в объеме 0,3 мл смешивают с 25%-ной суспензией каолина на физиологическом р-ре, встряхивают 25 мин, центрифугируют 15 мин при 2000 мин- 1 . После этого надосадочную жидкость используют в РТГА.

Положительный результат исследования на ПГ-3 считают в случае выявления АТ во 2-й пробе носовых секретов в титре 1:16 и выше (при отсутствии титров АТ в 1-й пробе) или установления 4-кратного и более увеличения титра АТ во 2-й пробе носовых секретов по сравнению с1-й.

При положительной РНГАд в контролях вируса (пробирки с культурой клеток, куда был внесен вирус в рабочем разведении с равным объемом питательной среды), учитывают её отсутствие в пробирках, куда была залита смесь того или иного разведения сыворотки и вируса. Диагностическим является не менее чем 4-кратный прирост нейтрализующих гемадсорбцию АТ в реконвалесцентной сыворотке по сравнению с сывороткой, взятой в начале болезни. РСК не нашла широкого применения в ветеринарной диагностической практике.

Максимальный срок обнаружения АТ в сыворотках крови телят после инфицирования вирусом ПГ-3 точно не установлен. Ряд исследователей полагают, что АТ сохраняются в течение 4-6 мес. Уровень образования ВНА и анти-ГА достигал пика 1:320 и выше к 14-21 дню после заражения. ЕLISА широко используется за рубежом для индикации и титрования АТ. Он в 4 - 64 раза чувствительнее, чем РТГА.

Дифференциальная диагностика. При постановке диагноза на ПГ-3 необходимо исключить ИРТ, ВД-БС, адено- и РС-инфекции, имеющие очень сходные эпизоотологические, клинические и патологоанатомические данные. Поэтому материал, поступивший с подозрением на ПГ-3, в лаборатории исследуют параллельно на все вышеуказанные инфекции.

Лабораторная диагностика лейкоза

Лейкоз КРС - хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, основной признак которой - злокачественное разрастание клеток кроветворных органов с нарушением их созревания, в результате чего происходит диффузная инфильтрация органов этими клетками или появляются опухоли.

Лейкозы животных диагностируют почти во всех странах мира. Наиболее широко они распространены в США, ряде стран центральной Европы, Дании, Швеции и странах ближнего Востока.

В нашей стране возникновение лейкоза связано с завозом племенного скота в 1940, 1945 – 1947 гг. из Германии в хозяйства Западной Сибири, Московской, Ленинградской, Калининградской областей, а также Украины, Латвии и Литвы. В дальнейшем лейкоз распространился в Таджикистан, Псковскую, Новгородскую области.

В естественных условиях ВЛКРС распространен среди КРС, овец, зебу и буйволов.

Вирус лейкоза КРС (ВЛКРС) относится к семейству Retroviridae, роду ретровирусов лейкоза КРС и Т-клеточного лейкоза человека. ВЛКРС обладает выраженной антигенной активностью и индуцирует синтез ВНА и КСА. ГА свойства. ВЛКРС агглютинирует только эритроциты мышей

Диагноз на лейкоз ставят на основании эпизоотологических данных, клинических признаков, патологоанатомических изменений и результатов лабораторных исследований, которые включают гематологические и гистологические, а также серологические исследования.

Основные характеристики некоторых ретровирусов

Все формы лейкоза характеризуются увеличением в различной степени лимфоузлов. При лимфолейкозе они увеличены равномерно, не сращены с окружающими тканями, капсула снимается легко, на разрезе узлы серо-белого цвета, сочные и саловидные. Лимфоузлы при лимфогранулематозе, лимфосаркоме и гистиоцитарной саркоме бугристые, капсула сращена с паренхимой, на разрезе часто обнаруживают кровоизлияния и некрозы; в органах брюшной, тазовой полостей, на серозных оболочках отмечают опухолевые разрастания узлов в виде конгломератов серо-белого, желто-серого цвета. Селезенка при лимфоидном и миелоидном лейкозах увеличена. При первых 2-х формах она буро-красного цвета с четко выраженной красной и белой пульпой за счет гиперплазии фолликулов. В более поздней стадии болезни граница между белой и красной пульпой стерта. При миелоидном лейкозе селезенка красно-малинового цвета, фолликулы плохо заметны, а в отдельных участках отсутствуют, ткань рыхлой консистенции с кровоизлияниями. При лимфоретикулосаркоме селезенка не увеличена. При всех формах лейкоза отмечают очаговые или диффузные разрастания серо-белого или серо-розового цвета в печени, почках, толще сердечной мышцы, органах пищеварения, матке, скелетных мышцах, диафрагме и других органах.

Взятие и подготовка материала . Для гематологического исследования кровь берут из времной вены в пробирки с антикоагулянтом - 10 %-ном р-ром динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, трилон Б) из расчета 0,02 мл р-ра на 1 мл крови. Не разрешается брать кровь от животных за 15 дней до отела и 15 дней после него. Для серологического исследования кровь берут от животных в возрасте 6 мес и старше. В лабораторию в термосе со льдом направляют 5-6 мл сыворотки. Для гистологического исследования кусочки пораженных органов (селезенки, лимфоузлов, грудной кости, печени, почек, легких, сердца и правого ушка сердечной мышцы, стенки сычуга, матки и скелетных мышц) посылают в свежем виде в термосе со льдом или в 10%-ном р-ре формалина.