Rabia(Latina - Lyssa; Engleză - Rabie; rabie, hidrofobie) - o boală zooantroponică acută deosebit de periculoasă a animalelor cu sânge cald de toate speciile și oameni, caracterizată prin afectarea gravă a sistemului nervos central, comportament neobișnuit, agresivitate, paralizie și moarte.

Contextul istoric, distribuția, gradul de pericol și daune. Boala a fost descrisă acum aproximativ 5000 de mii de ani. Mesaje despre aceasta sunt disponibile în codul legilor Babilonului, lucrările grecilor antici, în special Aristotel. Chiar și numele „Rabie”, „Lyssa” reflectă principalul semn clinic al bolii și sunt traduse prin furie, furie nebună. Medicii antici au putut determina transmiterea bolii prin saliva câinilor „furiați”. Chiar și în secolul al II-lea. n. e. medicii utilizate ca măsură preventivă împotriva rabiei îndepărtarea chirurgicalățesuturile de la locul mușcăturii și cauterizarea rănilor cu un fier fierbinte.
Perioada descoperirilor lui L. Pasteur este următoarea etapă din istoria studiului rabiei (1881-1903). Pasteur a descoperit etiologia virală a rabiei. În 1890, studenții lui Pasteur E. Roux și E. Nocard au descoperit că saliva animalelor bolnave devine contagioasă cu 3-8 zile înainte de manifestarea clinică a bolii. L. Pasteur a dovedit posibilitatea reproducerii bolii prin injectarea intracerebrală a materialului, iar în timpul unor astfel de treceri prin creierul iepurilor, proprietățile biologice ale virusului pot fi modificate. În 1885, au fost făcute primele vaccinări oamenilor, care au devenit încununarea tuturor eforturilor lui L. Pasteur de a salva omenirea de rabie. Introducerea vaccinărilor Pasteur a dus la o scădere a mortalității cauzate de rabie de 10 ori sau mai mult.

În prezent, rabia este înregistrată în majoritatea țărilor lumii. Potrivit OMS, în ciuda faptului că în fiecare an peste 5 milioane de oameni și zeci de milioane de animale sunt vaccinate împotriva rabiei în lume, anual se înregistrează aproximativ 50 de mii de decese din cauza acestei boli, iar numărul total de animale productive bolnave este sute de mii.

În ciuda succeselor obținute, problema rabiei este departe de a fi rezolvată, a devenit foarte relevantă datorită răspândirii progresive a bolii în rândul animalelor sălbatice – așa-numita rabie naturală. Epizootia în rândul animalelor sălbatice a dus la o creștere a incidenței animalelor de fermă, în primul rând bovinelor.

Agentul cauzal al bolii. Rabia este cauzată de un virus ARN în formă de glonț din familia Rhabdoviridae, genul Lyssavirus.

Orez. 1 - modelul virusului rabiei:
a - spire descrescătoare ale nucleocapsidei; b - poziția relativă a vârfurilor și a proteinei micelare subiacente (vedere de sus); in - tepi; g - proteină micelară; e - strat asemănător membranei interioare; (e) Regiunea virionului care arată raportul dintre lipide și stratul micelar, filamentele de vârfuri se pot extinde mai adânc în înveliș. Partea fără coloană a cochiliei poate forma goluri în helixul nucleoproteic.

Anterior, toate tulpinile virusului rabiei erau considerate a fi uniforme din punct de vedere antigenic. S-a stabilit acum că virusul rabiei are patru serotipuri: virusul serotipului I a fost izolat în diferite părți ale lumii; virusul serotip 2 izolat din măduvă osoasă liliac în Nigeria; virusul serotipului al 3-lea este izolat de la scorpie și persoană; Virusul serotip 4 a fost izolat de la cai, țânțari și țânțari din Nigeria și nu a fost încă clasificat. Toate variantele virusului sunt legate imunologic.

Sistemul nervos central este un loc selectiv pentru agentul cauzal al rabiei. La cel mai mare titru, virusul a fost găsit în creier (coarne de amon, cerebel și medula oblongata). După înfrângerea sistemului nervos central, agentul patogen pătrunde în toate organele interne și în sânge, cu excepția epiploonului, splinei și vezicii biliare. Virusul se găsește în mod constant în glandele salivare și țesuturile ochilor. Cultivat prin pasaje intracerebrale la iepuri și șoareci albi și într-un număr de culturi celulare.

În ceea ce privește rezistența la dezinfectanții chimici, agentul patogen al rabiei este clasificat ca rezistent (grupa a doua). Temperaturile scăzute păstrează virusul, iar pe tot parcursul iernii acesta rămâne în creierul cadavrelor de animale îngropate în pământ. Virusul este termolabil: la 60 ° C este inactivat după 10 minute, iar la 100 ° C - instantaneu. Razele ultraviolete îl ucid în 5-10 minute. În material putrezitor, rămâne 2-3 săptămâni. Procesele autolitice și putrefacția provoacă moartea agentului patogen în creierul cadavrelor, în funcție de temperatură, după 5-90 de zile.
Următoarele sunt cele mai eficiente dezinfectante: 2% soluții de cloramină, alcali sau formol, 1% iod, 4% soluție de peroxid de hidrogen, Virkon C 1:200 etc. Inactivează rapid virusul.

epizootologie. Principalele date epizootologice ale rabiei:

Specii de animale sensibile: animale cu sânge cald de toate felurile. Cele mai sensibile sunt vulpea, coiotul, șacalul, lupul, șobolanul de bumbac marsupial și șobolanul. Hamsteri, veverițe de pământ, scoici, ratoni, pisica domestica, liliac, râs, mangustă, cobai și alte rozătoare, precum și un iepure.
Sensibilitatea la virusul rabiei la oameni, câini, oi, cai, bovine este considerată moderată, iar păsările - slabă.
Animalele tinere sunt mai sensibile la virus decât cele bătrâne.

Surse și rezervoare ale agentului infecțios. Rezervorul și principalele surse ale agentului cauzal al rabiei sunt prădătorii sălbatici, câinii și pisicile, iar în unele țări ale lumii, liliecii. În epizootiile de tip urban, principalii răspânditori ai bolii sunt câinii fără stăpân și neglijați, iar în epizootiile de tip natural, prădătorii sălbatici (vulpe, câine raton, vulpe arctică, lup, corsac, șacal).

Metoda de infectare și mecanismul de transmitere a agentului patogen. Infecția oamenilor și animalelor are loc prin contactul direct cu sursele de agent patogen al rabiei, ca urmare a mușcăturii sau salivației pielii sau mucoaselor deteriorate.

Orez. 2. Răspândirea virusului la animale și la oameni

Este posibilă infectarea cu rabie prin mucoasele ochilor și nasului, alimentar și aerogen, precum și transmisibil.
Mecanismul aerogen de transmitere a infecției la vulpi și alte carnivore sălbatice din peșterile în care au fost ținuți milioane de lilieci a fost observat în condiții experimentale. Carnivorele au fost infectate cu virusul liliecilor folosind un generator de aerosoli. Animale sălbatice infectate cu aerosoli ținute într-o cameră separată și în cuști izolate vulpi infectate și alte animale: 37 de vulpi și alte carnivore au murit de rabie în mai mult de 6 luni. Aceste experimente au confirmat transmiterea respiratorie a rabiei printre carnivorele sălbatice. A fost posibilă izolarea virusului rabiei din aerul peșterilor observate prin infecția intercerebrală a șoarecilor (Winkler, 1968). Constantine (1967) a remarcat, de asemenea, că doi infirmieri sufereau de hidrofobie ca urmare a unei presupuse contaminări aerogene într-un focar al peșterii liliecilor. Winkler și colab. (1972) au detectat un focar de rabie într-o colonie de laborator de coioți, vulpi și ratoni, probabil ca rezultat al transmiterii aerogene a unui virus adaptat la lilieci. De menționat că mecanismul aerogen de transmitere a infecției se reproduce în principal cu virusul rabiei, susținut de lilieci.
La șoareci, hamsteri, lilieci, iepuri, scoici, rabia a fost reprodusă în condiții experimentale atunci când a fost infectată pe cale intranazală.

Intensitatea manifestării procesului epizootic. Cu o densitate mare de distribuție a vulpilor, corsacilor, ratonilor, lupilor, șacalilor, vulpilor arctice, boala se răspândește rapid, cu o densitate medie a distribuției acestora, rabia manifestându-se în cazuri izolate. Cu o densitate scăzută a populației de carnivore sălbatice, epizootia se estompează.

Sezonalitatea manifestării bolii, periodicitatea. Creșterea maximă a incidenței în toamnă și în perioada iarnă-primăvară. A fost stabilit un ciclu de rabie de trei-patru ani, care este asociat cu dinamica numărului de rezervoare principale.

Factori care contribuie la apariția și răspândirea rabiei. Prezența câinilor și pisicilor neglijate, precum și
animale sălbatice bolnave.

Morbiditate, mortalitate. Morbiditatea în rândul animalelor nevaccinate mușcate de câini turbați este de 30-35%, letalitatea este de 100%.

Conform clasificării epizootologice, agentul cauzal al rabiei este inclus în grupul infecțiilor focale naturale.

În prezent, există trei tipuri de infecție cu rabie în Rusia:

arctic (rezervor - vulpi arctice);
silvostepă focală naturală (lac de acumulare - vulpi);
antropologice (rezervor - pisici, câini).

Având în vedere natura rezervorului de agent patogen, se disting epizootii de rabie de tip urban și natural. În epizootiile de tip urban, câinii fără stăpân și câinii fără stăpân sunt principalele surse ale agentului patogen și răspânditorii bolii. Amploarea epizootiei depinde de numărul lor. În epizootiile de tip natural, boala este răspândită în principal de prădătorii sălbatici. Localizarea focarelor naturale ale bolii corespunde distribuției vulpilor, corsacilor, câinilor raton, lupilor, șacalilor, vulpilor arctice. Sunt foarte sensibili la virus, agresivi, adesea predispuși la migrații pe distanțe lungi, iar atunci când se îmbolnăvesc, secretă intens virusul cu saliva. Aceste circumstanțe, împreună cu o densitate semnificativă a populațiilor unor prădători (vulpe, câine raton), o schimbare rapidă a generațiilor lor și a duratei acestora. perioadă de incubațieîn rabie, acestea asigură continuitatea procesului epizootic, în ciuda morții relativ rapide a fiecărui animal bolnav individual.

Patogeneza. Posibilitatea de a dezvolta o infecție cu rabie, al cărei agent cauzal este de obicei transmis printr-o mușcătură, depinde de cantitatea de virus care a intrat în organism, de virulența acestuia și de alte proprietăți biologice, precum și de locația și natura leziunii. provocate de animalul turbat. Cu cât țesutul este mai bogat în zona porții de infecție cu terminații nervoase, cu atât este mai mare posibilitatea de a dezvolta boala. Contează și gradul de rezistență naturală a organismului, în funcție de tipul și vârsta animalului. Practic, virusul intră în corpul unui animal prin pielea deteriorată sau mucoasele.

Apariția virusului în sânge este adesea observată înainte de apariția semnelor clinice ale bolii și coincide cu creșterea temperaturii corpului.

În patogeneza bolii, pot fi distinse în mod condiționat trei faze principale:

I - extraneural, fără reproducere vizibilă a virusului la locul de inoculare (până la 2 săptămâni),
II - răspândirea intraneurală, centripetă a infecției,
III - diseminarea virusului în tot organismul, însoțită de apariția simptomelor bolii și, de regulă, moartea animalului.

Reproducerea virusului în substanța cenușie a creierului determină dezvoltarea encefalitei difuze non-purulente. Virusul călătorește de la creier de-a lungul căilor nervoase centrifuge către glandele salivare, unde se înmulțește în celulele ganglionilor nervoși și, după degenerarea acestora, pătrunde în canalele glandelor, infectând saliva. Izolarea virusului cu salivă începe cu 10 zile înainte de apariția semnelor clinice. În perioada de incubație, virusul este transportat și din creier în mod neurogen către glandele lacrimale, retină și cornee, până la suprarenale, unde, aparent, se reproduce și el. Impactul agentului patogen provoacă mai întâi iritarea celulelor marile departamente sistemul nervos central, ceea ce duce la o creștere a excitabilității reflexe și a agresivității animalului bolnav, provocând crampe musculare. Apoi are loc o degenerare a celulelor nervoase. Moartea apare din cauza paraliziei mușchilor respiratori.

Curent și manifestare clinică simptome de rabie. Perioada de incubație variază de la câteva zile la 1 an și este în medie de 3-6 săptămâni. Durata acestuia depinde de tipul, vârsta, rezistența animalului, cantitatea de virus care a pătruns și virulența acestuia, localizarea și natura rănii. Cu cât rana este mai aproape de creier, cu atât mai repede apare clinica rabiei.

Boala este adesea acută. Tabloul clinic similar la animalele de toate speciile, dar mai bine studiat la câini. Rabia la ele se manifestă de obicei sub două forme: violentă și liniștită.

La furie violentă Există trei perioade: prodromală, excitație și paralizie.
Perioada prodromală (stadiul precursor) durează de la 12 ore până la 3 zile. Această perioadă începe cu o ușoară schimbare a comportamentului. Animalele bolnave devin letargice, plictisite, evită oamenii, încearcă să se ascundă într-un loc întunecat, merg fără tragere la apelul proprietarului. În alte cazuri, câinele devine afectuos față de proprietar și cunoscuți, încearcă să-și lingă mâinile și fața. Apoi anxietatea și excitabilitatea cresc treptat. Animalul se întinde adesea și sare în sus, latră fără motiv, există o excitabilitate reflexă crescută (la lumină, zgomot, foșnet, atingere etc.), apare scurtarea respirației, pupilele sunt dilatate. Uneori, la locul mușcăturii apare mâncărime severă, animalul linge, pieptene, roade acest loc. Pe măsură ce boala progresează, apare adesea un apetit pervertit. Câinele mănâncă obiecte necomestibile (pietre, sticlă, lemn, pământ, fecale proprii etc.). În această perioadă se dezvoltă pareza mușchilor faringelui. Dificultate la înghițire (se pare că câinele se sufocă cu ceva), se observă salivație, lătrat răgușit și sacadat, mers instabil și uneori strabism.

A doua perioadă - excitația - durează 3-4 zile și se caracterizează printr-o creștere a simptomelor descrise mai sus. Agresivitatea este în creștere, un câine fără motiv poate mușca un alt animal sau persoană, chiar și stăpânul ei, roade fier, bețe, pământ, rupându-și adesea dinții și uneori maxilarul inferior. La câinii bolnavi, dorința de a se elibera și de a fugi crește; un câine turbat aleargă zeci de kilometri într-o zi, mușcă și infectează alți câini și oameni pe parcurs. În mod caracteristic, câinele alergă în tăcere spre animale și oameni și îi mușcă. Atacurile de violență, care durează câteva ore, sunt înlocuite cu perioade de opresiune. Treptat, se dezvoltă paralizia grupurilor musculare individuale. Mai ales remarcabilă este modificarea vocii câinelui din cauza paraliziei mușchilor laringelui. Scoarța sună răgușită, ca un urlet. Acest semn are valoare de diagnostic. Maxilarul inferior este complet paralizat, se lasă. Cavitatea bucală este deschisă tot timpul, limba cade pe jumătate, se observă salivație abundentă. În același timp, apare paralizia mușchilor de deglutiție și a mușchilor limbii, în urma căreia animalele nu pot mânca alimente. Apare strabismul.

A treia perioadă - paralitică - durează 1-4 zile. Pe lângă paralizia maxilarului inferior, membrele posterioare, mușchii cozii, vezicii urinare și rectului sunt paralizați, apoi mușchii trunchiului și ai membrelor anterioare. Temperatura corpului în stadiul de excitare crește la 40-41 ° C, iar în stadiul paralitic scade sub normal. În sânge se observă leucocitoză polimorfonucleară, numărul de leucocite este redus, iar conținutul de zahăr din urină crește la 3%. Durata totală a bolii este de 8-10 zile, dar adesea moartea poate apărea după 3-4 zile.

La formă tăcută (paralitică) a rabiei(mai des observat atunci când câinii sunt infectați de vulpi) excitația este slab exprimată sau nu este exprimată deloc. La un animal cu o absență completă a agresivității, se observă salivație puternică și dificultăți de înghițire. La oamenii ignoranți, aceste fenomene provoacă adesea o încercare de a îndepărta un os inexistent și, în acest sens, se pot infecta cu rabie. Apoi, la câini apare paralizia maxilarului inferior, a mușchilor membrelor și a trunchiului. Boala durează 2-4 zile.

Forma atipică de rabie nu are un stadiu de excitare. Se remarcă pierderea musculară și atrofie. Au fost înregistrate cazuri de rabie, care au apărut doar cu simptome de gastroenterită hemoragică: vărsături, fecale semi-lichide care conţin mase sângero-mucoase. Chiar și mai rar, se înregistrează o evoluție avortivă a bolii, culminând cu recuperare, și rabie recidivante (după o recuperare aparentă, semnele clinice ale bolii se dezvoltă din nou).

Pentru rabie la pisici semnele clinice sunt practic aceleași ca la câini, boala decurgând în principal într-o formă violentă. Adesea, un animal infectat încearcă să se ascundă într-un loc liniștit și întunecat. Pisicile bolnave sunt foarte agresive față de oameni și câini. Ei provoacă daune profunde prin aruncarea ghearelor, încercând să muște în față. Vocea lor se schimbă. În stadiul de entuziasm, pisicile tind, ca și câinii, să fugă de acasă. În viitor, se dezvoltă paralizia faringelui și a membrelor. Moartea apare la 2-5 zile de la debutul semnelor clinice. Cu rabia paralitică, agresivitatea este prost exprimată.

vulpi atunci când sunt bolnavi, sunt alertați de un comportament neobișnuit: își pierd sentimentul de frică, atacă câinii, animalele de fermă și oamenii. Animalele bolnave pierd rapid în greutate, adesea există mâncărime în zona infecției.

Pentru rabie la bovine perioada de incubație este mai mare de 2 luni, mai des de la 15 la 24 de zile. În unele cazuri, pot trece 1-3 ani din momentul mușcăturii până la primele semne ale bolii. Rabia apare în principal sub două forme: violentă și liniștită. În formă violentă, boala începe cu emoție. Animalul se întinde adesea, sare în sus, bate cu coada, călcă, se aruncă în perete, lovește cu coarnele. Agresivitatea este deosebit de pronunțată în raport cu câini și pisici. Se remarcă salivație, transpirație, nevoia frecventă de a urina și defeca, excitare sexuală. După 2-3 zile se dezvoltă paralizia mușchilor faringelui (imposibilitatea înghițirii), a maxilarului inferior (salivația), a membrelor posterioare și anterioare. Moartea survine în a 3-6-a zi de boală.
Cu o formă liniștită, semnele de excitare sunt ușoare sau absente. Se observă oprimarea, refuzul de a hrăni. Vacile nu mai secreta lapte si guma de mestecat. Apoi există paralizia laringelui, faringelui, maxilarului inferior (mâhâit răgușit, salivație, incapacitatea de a înghiți), apoi membrele posterioare și anterioare. Moartea are loc în a 2-a-4 zi.

La oi și capre simptomele sunt aceleași ca la bovine: agresivitate, în special față de câini, excitabilitate sexuală crescută. Paralizia se dezvoltă rapid, iar în a 3-a-5-a zi animalele mor. În forma paralitică a rabiei, emoția și agresivitatea nu sunt remarcate.

Rabia la cai manifestat la început prin anxietate, teamă, excitabilitate. Mâncărimea este adesea posibilă la locul mușcăturii. Se manifestă agresivitate față de animale și uneori față de oameni. În perioada de entuziasm, caii se aruncă în perete, își sparg capul, roade hrănitoarele, ușile, uneori, dimpotrivă, cad într-o stare de depresie, sprijinindu-și capetele de perete. Există spasme ale mușchilor buzelor, obrajilor, gâtului, cufăr. Odată cu dezvoltarea în continuare a bolii, se dezvoltă paralizia mușchilor de deglutiție și apoi a membrelor. Animalul moare în a 3-4-a zi de boală. Dar uneori moartea apare după 1 zi. În forma paralitică a rabiei, stadiul de excitație cade.

Rabia la porci deseori procedează brusc și în formă violentă. Porcii se grăbesc în țarc, refuză să se hrănească, roade hrănitoarele, despărțitori, locul mușcăturii. Există o salivație puternică. Se manifestă agresivitate față de alte animale și oameni. Scroafele se năpustesc asupra propriilor purcei. Paralizia se dezvoltă curând, iar la 1-2 zile de la apariția lor, animalele mor. Durata bolii nu este mai mare de 6 zile.
În forma paralitică a rabiei (rareori înregistrată), se observă depresie, refuzul de mâncare și apă, salivație ușoară, constipație și paralizie rapid progresivă. Animalele mor la 5-6 zile de la debutul semnelor bolii.

Semne patologice. Modificările patologice sunt în general nespecifice. La examinarea cadavrelor, se observă emaciare, urme de mușcături și urme de zgârietură, leziuni ale buzelor, limbii și dinților. Membranele mucoase vizibile sunt cianotice. La autopsie, cianoză și uscăciune a tegumentelor seroase și a mucoaselor se stabilește pletora congestivă. organe interne; sânge întunecat, gros, gudron, slab coagulat; muşchi roşu închis. Stomacul este adesea gol sau conține diverse obiecte necomestibile: bucăți de lemn, pietre, cârpe, așternuturi etc. Mucoasa gastrică este de obicei hiperemică, edematoasă, cu mici hemoragii. Dura mater este tensionată. Vase de sânge injectat. Creierul și învelișul său moale sunt edematoase, adesea cu hemoragii petehiale, localizate în principal în cerebel și medular oblongata. Convoluțiile cerebrale sunt netezite, țesutul creierului este flasc.
Modificările histologice se caracterizează prin dezvoltarea poliencefalomielitei diseminate non-purulente de tip limfocitar.

O valoare diagnostică importantă în rabie este formarea în citoplasma celulelor ganglionare a unor corpuri de incluziune specifice Babes-Negri, rotunde sau ovale, care conțin formațiuni granulare bazofile de nucleocapside virale de diferite structuri.

Diagnosticare și diagnostic diferentiat rabie. Diagnosticul rabiei se face pe baza unui complex de date și rezultate epizootice, clinice, patologice și anatomice. cercetare de laborator(diagnostic final).
Pentru cercetarea rabiei, un cadavru sau un cap proaspăt este trimis la laborator, de la animale mari - capul. Materialul pentru cercetări de laborator trebuie preluat și trimis în conformitate cu Instrucțiunile privind măsurile de combatere a rabiei animalelor.

Schema generală de diagnosticare a bolii este prezentată în Figura 3:

LA anul trecut au fost dezvoltate noi metode de diagnosticare a rabiei: radioimunotest, test imunosorbent enzimatic (ELISA), test imunosorbent enzimatic (TF-ELISA), identificarea virusului folosind anticorpi monoclonali, PCR.

În diagnosticul diferențial, este necesar să se excludă boala Aujeszky, listerioza, botulismul. La câini - o formă nervoasă a ciumei, la cai - encefalomielita infecțioasă, la bovine - febră catarrală malignă. Rabia poate fi, de asemenea, suspectată în cazuri de otrăvire, colici, forme severe cetoză și alte boli netransmisibile, precum și în prezența corpuri străineîn cavitatea bucală sau faringe, blocarea esofagului.

Imunitate, profilaxie specifică . Animalele vaccinate împotriva rabiei produc anticorpi de neutralizare a virusului, de fixare a complementului, de precipitare, anti-hemaglutinanți și litici (distrugând celulele infectate cu virusul în prezența complementului). Mecanismul imunității post-vaccinare nu a fost descifrat definitiv. Se crede că vaccinarea provoacă modificări biochimice care reduc sensibilitatea celulelor nervoase la virus. Esența imunizării artificiale în rabie se reduce la producția activă de anticorpi care neutralizează virusul la locul pătrunderii acestuia în organism înainte ca acesta să intre în elementele nervoase sau, cu imunizarea forțată, neutralizează virusul pe drumul către sistemul nervos central. sistem. De asemenea, sunt activate limfocitele T responsabile de producerea interferonului. Prin urmare, cu această boală este posibilă vaccinarea post-infectie: tulpina vaccinală, pătrunzând în celulele nervoase mai devreme decât cea de câmp, le determină să producă interferon, care inactivează virusul rabiei sălbatice, și anticorpi care blochează receptorii celulari specifici.

LA practica veterinaraÎn prezent, se folosesc atât vaccinuri antirabice cu țesuturi vii, cât și vaccinuri antirabice cultivate și inactivate (vaccinuri antirabice) - până la 84 de soiuri de vaccinuri antirabice în 41 de țări ale lumii.

Vaccinurile antirabice sunt clasificate în trei grupe: vaccinuri pentru creier, care sunt fabricate din țesutul cerebral al animalelor infectate cu un virus rabic fix; embrionar, în care componenta care conține virus este țesutul embrionilor de pui și rață; vaccinuri culturale antirabice realizate din virusul rabiei reprodus în celule primare tripsinizate sau transplantate VNK-21/13.

În Federația Rusă, a fost dezvoltat un vaccin antirabic inactivat pe baza tulpinii Schelkovo-51, reprodus într-o cultură de celule VNK-21, care are o activitate imunizantă ridicată.
Pentru vaccinarea preventivă și forțată a bovinelor și bovinelor mici, cailor, porcinelor aplicați vaccinul antirabic lichid cultural („Rabikov”).
Pentru vaccinări preventive pentru câini și pisici se aplică un vaccin antirabic inactivat de cultură uscată din tulpina Schelkovo-51 ("Rabikan"). A fost dezvoltat un vaccin universal - pentru bovine, cai, oi, porci, câini, pisici.
Vaccinurile importate sunt larg reprezentate pe piata ruseasca. Medicii veterinari folosesc vaccinuri antirabice Nobivak Rabies, Nobivak RL, Defensor-3, Rabizin, Rabigen Mono și altele.
Pentru vaccinarea orală a animalelor sălbatice și fără stăpân, au fost dezvoltate metode de vaccinare bazate pe animalele care consumă diferite momeli cu Lisvulpen, Sinrab și alte vaccinuri.În prezent, se lucrează pentru crearea de vaccinuri modificate genetic (recombinant).

Prevenirea. Pentru prevenirea rabiei, câinii sunt înregistrați în populație, control asupra respectării regulilor de păstrare a animalelor de companie, capcane caini vagabonziși pisici, vaccinarea anuală preventivă a câinilor și în cazurile necesare si pisici. Câinilor nevaccinati li se interzice folosirea pentru vânătoare și paza fermelor și turmelor.
Angajații autorităților forestiere și de vânătoare sunt obligați să raporteze suspectele de rabie la animalele sălbatice, să le predea cadavrele pentru examinare și să ia măsuri pentru reducerea numărului de prădători sălbatici în zonele defavorizate și amenințate de rabie. Prevenirea rabiei la animalele de fermă se realizează prin protejarea acestora de prădători, precum și vaccinarea preventivă în zonele infectate.
Vânzarea, cumpărarea, precum și transportul câinilor în alte orașe sau regiuni este permisă numai dacă există un certificat veterinar cu mențiunea că câinele a fost vaccinat împotriva rabiei cu cel mult 12 luni și nu mai puțin de 30 de zile înainte de export.

Tratamentul împotriva rabiei. mijloace eficiente nu exista terapie. Animalele bolnave sunt imediat izolate și ucise, deoarece supraexpunerea lor este asociată cu riscul de a infecta oamenii.

Măsuri de control. Atunci când se organizează măsuri de combatere a rabiei, ar trebui să se facă distincția între un focar epizootic, un punct dezavantajat și o zonă amenințată.
Focarele epizootice ale rabiei sunt apartamentele, clădirile de locuit, gospodăriile particulare ale cetățenilor, clădirile zootehnice, ferme zootehnice, taberele de vară, pășunile, pădurile și alte obiecte în care se găsesc animale cu rabie.
O zonă nefavorabilă pentru rabie este o așezare sau o parte a unei așezări mari, o fermă separată de animale, o fermă, o pășune, o pădure, pe teritoriul căreia a fost identificat un focar epizootic al rabiei.
Zona amenințată include așezări, ferme de animale, pășuni și alte teritorii în care există amenințarea introducerii rabiei sau activării focarelor naturale ale bolii.

Activitățile de eradicare a rabiei sunt prezentate în Figura 4:

Măsuri de protecție a oamenilor împotriva infecției cu rabie. Persoanele care sunt expuse în mod constant la riscul de infecție (personalul de laborator care lucrează cu virusul rabiei, crescătorii de câini etc.) trebuie să fie imunizate profilactic.

Toți oamenii mușcați, zgâriați, slobiți de orice animal, chiar și sănătoși în exterior, sunt considerați suspecti pentru infecția cu rabie.

După contact, dezvoltarea infecției poate fi prevenită printr-un tratament prompt al rănii și adecvat tratament preventiv victima. Persoana rănită ar trebui să aștepte ceva timp pentru ca o mică parte de sânge să curgă din rană. Apoi se recomandă spălarea plăgii cu multă apă și săpun, tratarea cu alcool, tinctură sau soluție apoasă iod și aplicați un bandaj. Spălați rana cu atenție pentru a evita deteriorarea ulterioară a țesuturilor. Pansamentul local este cel mai benefic dacă se face imediat după un atac de animal (în decurs de 1 oră, dacă este posibil). Victima este trimisă la postul de prim ajutor și se efectuează un curs de tratament și imunizare profilactică cu gama globulină antirabică și vaccin antirabic. Persoanele cu rabie sunt internate.

O analiză pentru rabie la câini implică efectuarea unor teste speciale rapide pentru prezența anticorpilor specifici antirabic în sânge. Uneori este utilizat în diagnosticare complexă pentru infecția suspectată a animalelor de companie cu virusul rabiei. Această boală reprezintă o amenințare pentru viața animalelor, a oamenilor, așa că crescătorii de câini ar trebui să aibă o idee despre cum se manifestă această boală. Dacă există o suspiciune de infecție, dacă animalul de companie a avut contact cu un posibil purtător de bacterii, ar trebui să duceți imediat animalul de companie la o clinică veterinară pentru diagnosticare de laborator, fără de care este imposibil să stabiliți un diagnostic precis.

(rabia) este o boală acută a animalelor cu sânge cald de etiologie infecțioasă, cauzată de un virus care afectează sistemul nervos central, provocând tulburări grave în organism. Din pacate, tratament eficient nu este dezvoltată în prezent, astfel încât infecția este întotdeauna fatală.

Agentul cauzal al unei boli infecțioase este un virus care conține ARN (rhabdovirus). Afectează animalele domestice și sălbatice. Există un așa-numit virus „natural” și „laborator”.

IMPORTANT! RABIA ESTE O BOLĂ ZOOANTROPOZOONĂ, Adica INFECȚIA SE TRANSMISE LA OM. FOARELE SUNT Peste tot. BOALA ARE UN CARACTER FOCAL NATURAL.

Rezervorul natural al rabdovirusului este prădătorii carnivori infectați. Virusul mortal se găsește în saliva persoanelor infectate. Are loc infecția prin contact, cu mușcături, pătrunderea salivei în abraziuni, răni pe derm.

După ce a pătruns în organism, virusul se mișcă instantaneu de-a lungul căilor nervoase către creier, măduva spinării, glandele salivare, unde se înmulțește ulterior.

În saliva animalelor infectate, rabdovirusul apare cu aproximativ trei până la șapte zile înainte de apariția primelor simptome. În același timp, un individ infectat este deja un purtător de virus, reprezentând o amenințare reală pentru oameni și alte animale domestice. Prin urmare, infecția cu rabie poate apărea chiar dacă tu sau animalul tău de companie sunteți mușcat de un animal aparent sănătos.

Forme, stadii ale rabiei

Perioada de incubație durează de la 2-7 zile până la câteva săptămâni. Intensitatea manifestării simptomelor depinde de vârstă, rezistență, apărare imunitară, virulență și concentrația de rhabdovirus în organism. O boală mortală la animale apare într-un mod liniștit, violent, mai rar în forme atipice.

La câini, se observă o formă predominant violentă de infecție, a cărei durată este de la șase până la zece zile. Are trei etape de manifestare:

prodromală. Durata etapei melancolice nu este mai mare de două zile. În acest stadiu al dezvoltării infecției, se observă o schimbare a comportamentului câinelui. Animalele sunt puternic oprimate, arată deprimat, se ascund în locuri întunecate izolate, sunt reticente în a face contact și răspund inadecvat la stimuli.
Maniac(etapa de excitație). Durata cursului nu este mai mare de trei sau patru zile. Animalele bolnave manifestă o agresivitate nerezonabilă față de semenii lor, alte animale de companie, oameni, inclusiv proprietarul. Agresivitatea este înlocuită cu un comportament afectuos. Animalul de companie necesită atenție, linge mâinile, fața persoanei. Animalele de companie bolnave mănâncă produse necomestibile. Adesea câinii fug de acasă și pot alerga neobosit 20-30 km.
Paralitic(depresiv). Această etapă, care nu durează mai mult de șase zile, se caracterizează prin perturbări severe în funcționarea sistemului nervos central. Se notează paralizia faringelui, laringelui, crampele musculare, spasmele. Maxilarul inferior coboară. Nu există reflex de înghițire. Saliva curge constant din gură. Sunetele puternice, sunetul apei provoacă cea mai puternică panică. Coordonarea mișcării este întreruptă. Animalul de companie intră în comă, moare din cauza epuizării, a funcțiilor respiratorii și cardiace afectate.

Este de remarcat faptul că un câine turbat, indiferent de forma și stadiul bolii, mușcă o persoană fără a avertiza animalele despre atacul prin lătrat.

Forma linistita, atipica

Forma tăcută a bolii se caracterizează prin absența unui stadiu de excitație. Durata - de la două până la cinci zile. Se caracterizează prin oprimare generală, melancolie, lipsă de răspuns la stimuli externi. Animalele mor din cauza paraliziei structurilor musculare ale corpului, faringe. Boala se termină întotdeauna cu moartea.

Mai rar la câini se observă o formă atipică a bolii, care se manifestă prin manifestări atipice, necaracteristice pentru această infecție. Apare acut, subacut, mai rar cronic (două-trei luni). La animale, se observă o schimbare a comportamentului, disfuncționalități ale sistemului nervos central, tractului gastrointestinal.

Observând comportamentul necaracteristic al animalului dvs. de companie, o schimbare a obiceiurilor, o manifestare a agresivității și, de asemenea, dacă câinele a avut contact sau a fost mușcat de animale sălbatice, fără adăpost, trebuie neapărat să duceți animalul de companie la o clinică veterinară și să verificați câinele pentru rabie. . Nu uitați că simptomele cresc spontan într-o anumită secvență.

Metode de diagnosticare

Atunci când se face un diagnostic preliminar, trebuie luate în considerare datele anamnezei, rezultatele anatomice patologice, situația epizootologică și simptomele. Se efectuează o serie de studii de laborator, histologice, microscopice, bacteriologice, teste exprese.

Dată fiind asemănarea simptomelor cu alte infecții, se realizează diagnosticul diferențial (ELISA, PCR). Este necesar să se excludă boala Aujeszky, boala canină, encefalomielita.

Important! Dacă există suspiciunea de infecție, animalul a mușcat o persoană, câinele este plasat în cutii speciale izolate și timp de zece zile, până când rezultatele testelor sunt gata, starea acesteia este monitorizată. Dacă diagnosticul este confirmat, din păcate, se face eutanasie. Animalele sunt eutanasiate pentru că nu există un tratament pentru această infecție.

Un diagnostic precis poate fi stabilit numai după moartea animalelor. Materialul patologic rezultat este examinat prin diferite metode.

Studii de diagnostic de bază

Cea mai fiabilă metodă care confirmă întotdeauna boala este studii microscopice biomaterial pentru prezența incluziunilor specifice în creier – corpuri Babes-Negri. Situat în coarne de amoniu.

Pentru a detecta un antigen specific din creier, se folosește o reacție precipitare difuză, analiza imunofluorescentă a amprentei corneei.

Metoda imunofluorescentă vă permite să diagnosticați rapid prezența virusului în corpul câinilor. Metoda determină antigenul viral în 93-97% din cazuri.

Test de sânge pentru anticorpi

Având în vedere că virusul se mișcă de-a lungul trunchiurilor nervoase, este extrem de rar să-l detectezi în fluxul sanguin. De regulă, dacă se suspectează infecția, lichidul cefalorahidian este examinat pentru analiză.

Studiile serologice constau în efectuarea unui test de sânge general, biochimic. Se observă modificări ale formulei leucocitelor (leucocitoză), oligurie, albuminurie, glucozurie și o creștere a concentrației de monocite.

Testarea animalului de companie pentru rabie, determinarea intensității imunității post-vaccinare va permite testarea prezenței anticorpilor specifici antirabic în sânge. Susținut această procedură doar in laboratoare acreditate, unele clinici veterinare. Trebuie remarcat faptul că costul acestei analize este destul de mare. Rezultatele după procedură vor fi gata în 10-20 de zile.

Astăzi, se efectuează două tipuri de teste pentru anticorpi antirabici - RFFIT (inhibarea rapidă a testului de focalizare a fluorescenței) și FAVN - un test de anticorpi de neutralizare a virusului fluorescent, care determină titrul de anticorpi în UI / ml. Aceste tehnici sunt efectuate pe culturi vii ale structurilor celulare cu adăugarea unui agent infecțios la reacție. La câini se iau 0,5-1 ml de ser sanguin.

Testul se efectuează în principal dacă doriți să vă duceți animalul de companie în străinătate. Multe țări UE interzic importul pe teritoriul lor a animalelor care nu au fost vaccinate împotriva rabiei, precum și a câinilor și pisicilor care nu au rezultatele acestei analize.

Trebuie să faceți un test de anticorpi atunci când anticorpii împotriva acestei infecții sunt dezvoltați în sângele câinelui. Imunitatea specifică după imunizare se formează la o lună după vaccinare. Din acest moment, vă puteți duce animalul de companie la laborator pentru un test de anticorpi rabici. Mai mult, după imunizare, dacă este nevoie de acest test, nu trebuie să treacă mai mult de un an de la data vaccinării. Testul trebuie efectuat cu cel puțin o lună înainte de data revaccinării.

Dacă titrul de anticorpi antirabici este mai mic de 0,50 UI/ml, câinele este revaccinat. O lună mai târziu, se face o reanaliza. Mai mulți factori influențează producția de anticorpi de protecție după imunizare: rasa, vârsta, caracteristicile individuale ale organismului, frecvența imunizării antirabică. Medicii veterinari recomandă monitorizarea titrului de anticorpi la câini și pisici după vaccinare, chiar dacă nu intenționați să călătoriți în străinătate.

Mulți proprietari își duc animalele de companie la țară, la natură, la pădure, la vânătoare. Nu uitați că câinele poate fi mușcat de animale sălbatice care pot fi infectate sau sunt purtători de virus.

Singura modalitate de a vă proteja câinele de o infecție mortală este să vă vaccinați la timp.

Pe viitor, în funcție de medicamentul ales, revaccinarea se efectuează o dată pe an. Unele vaccinuri oferă protecție imunitară pentru o perioadă de trei ani. Schema optimă de vaccinări, revaccinări va fi selectată de un medic veterinar.

CONSILIUL INTERSTATAL DE STANDARDIZARE. METROLOGIE ȘI CERTIFICARE

INTERSTATAL

STANDARD

ANIMALE

Ediție oficială

Forma standard

cuvânt înainte

Obiectivele, principiile de bază și procedura de bază pentru realizarea lucrărilor privind standardizarea interstatală sunt stabilite de GOST 1.0 - 92 „Sistemul de standardizare interstatală. Fundamentele prevederilor” și GOST 1.2-2009 „Sistemul de standardizare interstatală. Standarde interstatale. reguli și recomandări pentru standardizarea interstatală. Reguli de dezvoltare. acceptare, aplicare, reînnoire și anulare”

Despre standard

1 DEZVOLTAT de Instituția Federală pentru Bugetul de Stat „Centrul de Stat pentru Calitatea și Standardizarea Medicamentelor pentru Animale și Furaje” (FGBU „VGNKI”)

2 INTRODUS de Agenția Federală pentru Reglementare Tehnică și Metrologie Federația Rusă

3 ADOPTAT de Consiliul Interstatal pentru Standardizare, Metrologie si Certificare (Proces-verbal din 27 iunie 2013 Nr. 57-P)

Numele scurt al țării conform MK (ISO 3166) 004-97	Codul țării nr. MK (ISO 3166) 004-97	Numele prescurtat al organismului național de standardizare
		Ministerul Economiei al Republicii Armenia
Bielorusia		Standard de stat al Republicii Belarus
Kârgâzstan		Kirghizstandartul
		Moldova-Standard
		Gosstandart
Uzbekistan		Uzsgandart

4 Prin ordinul Agenției Federale pentru Reglementare Tehnică și Metrologie din 30 septembrie 2013 nr. 1127-st, standardul interstatal GOST 26075-2013 a fost pus în vigoare ca standard național al Federației Ruse de la 1 ianuarie 2015.

5 ÎN LOC DE GOST 26075-54

Informațiile despre modificările aduse acestui standard sunt publicate în indexul de informații publicat anual „Standarde naționale”, iar textul modificărilor și amendamentelor - în indexul de informații publicat lunar „Standarde naționale”. În cazul revizuirii (înlocuirii) sau anulării acestui standard, un anunț corespunzător va fi publicat în indexul de informații publicat lunar „Standarde naționale”. Informațiile relevante, notificarea și textele sunt, de asemenea, postate în sistemul de informare publică - pe site-ul oficial al Agenției Federale pentru Reglementare Tehnică și Metrologie pe internet

În Federația Rusă, acest standard nu poate fi reprodus integral sau parțial. replicat și distribuit ca publicație oficială fără permisiunea Agenției Federale pentru Reglementare Tehnică și Metrologie

STANDARD INTERSTATAL

ANIMALE

Metode de diagnostic de laborator al rabiei

Data introducerii - 2015 - 01 - 01

1 domeniu de utilizare

Acest standard internațional se aplică tuturor speciilor de mamifere și specifică următoarele metode pentru diagnosticul de laborator al rabiei:

Metoda anticorpilor fluorescenți (MFA);

Metodă pentru izolarea virusului rabiei într-o cultură celulară de neuroblastom de șoarece CCL-131 (sau nodul de neurinom Gasser al șobolanului - NGUK-1);

Biotest pe șoareci albi:

Metoda testului imunosorbent legat de enzime (ELISA);

Reacția de precipitare prin difuzie (RDP).

Note

1 Aceste metode sunt aplicabile tuturor membrilor genului Lyssavwus.

2 Virusul rabiei stradale aparține microorganismelor din clasa a II-a de patogenitate (prezentă un pericol de moarte pentru oameni și animale).

3 Dacă este necesar, genotiparea virusului rabiei folosind gata făcute sisteme de testare este utilizată metoda reacției în lanț a polimerazei cu transcriptază inversă (RT-PCR).

2 Referințe normative

Acest standard folosește referințe normative la următoarele standarde:

GOST ISO/IEC 17025 - 2009 Cerințe generale pentru competența laboratoarelor de testare și calibrare

GOST 12.0.004 - 90 Sistem de standarde de securitate a muncii. Organizarea instruirii in domeniul securitatii muncii. Dispoziții generale

GOST 12.1.005-68 Sistemul standardelor de securitate a muncii. Cerințe generale sanitare și igienice pentru aerul din zona de lucru

GOST 12.1.008 - 76 Sistem de standarde de securitate a muncii. siguranța biologică. Cerințe generale

GOST 12.4.011 - 89 Sistem de standarde de securitate a muncii. Mijloace de protecție a lucrătorilor. Cerințe generale și clasificare

GOST 17.0.0.01 - 76 Sistem de standarde în domeniul protecției naturii și îmbunătățirii utilizării resurselor naturale. Puncte cheie

GOST 177-88 Peroxid de hidrogen. Specificații GOST 2603 - 79 Reactivi. Acetonă. Specificații GOST 2768 - 84 Acetonă tehnică. Specificații GOST 4204 - 77 Reactivi. Acid sulfuric. Specificații GOST 6709 - 72 Apă distilată. Specificații.

GOST ISO 7218 - 2011 Microbiologie Produse alimentareși hrana animalelor. Cerințe generale și recomandări pentru studii microbiologice

GOST 8074 - 82 Microscoape instrumentale. Tipuri, parametri de bază și dimensiuni. Cerinte tehnice.

GOST 9147 - 80 Sticlărie și echipamente de porțelan de laborator. Specificații GOST 9284-75 Lame de microscop. Specificații GOST 12026 - 76 Hârtie de filtru de laborator. Specificații GOST 13739-78 Ulei de imersie pentru microscopie. Cerinte tehnice. Metode de testare

GOST 16317-87 Aparate frigorifice electrice de uz casnic. Specificații generale

GOST 21241-69 Pensetă medicală. Specificații generale.

GOST 22967 - 90 Seringi medicale de injectare pentru utilizare multiplă. Cerințe tehnice generale și metode de încercare

GOST 24661 - 91 (ISO 7866 84) Seringi de injectare de unică folosință

GOST 25046 - 81 (ISO 7864-81) Ace de injectare de unică folosință. Dimensiuni principale. Cerinte tehnice. Metode de testare

GOST 25336 - 82 Sticla și echipamente de laborator. Tipuri, parametri de bază și dimensiuni

GOST 29230 - 91 (ISO 835-4-81) Sticla de laborator. Pipete absolvite. Partea 4. Pipete de suflare

Notă - Când utilizați acest standard, este recomandabil să verificați valabilitatea standardelor de referință în sistemul de informare publică - pe site-ul oficial al Agenției Federale pentru Reglementare Tehnică și Metrologie pe Internet sau conform indexului anual de informații „Standarde naționale” , care a fost publicată de la 1 ianuarie a anului curent, și numărul de ediții ale indexului lunar de informații „Standarde naționale” pentru anul în curs. Dacă standardul de referință este înlocuit (modificat), atunci când utilizați acest standard, trebuie să vă ghidați după standardul de înlocuire (modificat). Dacă standardul la care se face referire este anulat fără înlocuire, prevederea în care se face referire la acesta se aplică în măsura în care această referință nu este afectată.

3 Termeni, definiții și abrevieri

3.1 Următorii termeni sunt utilizați în acest standard cu definițiile lor respective:

3.1.1 boală infecțioasă rabică a oamenilor și animalelor cauzată de membrii familiei Rhabdoviridae din genul Lyssavirus (rhabDovirus) care are ca rezultat rezultat letalîn 100% din cazuri.

3.1.2 virusul rabiei: agentul cauzal al unei boli infecțioase la oameni și animale.

3.1.3 structurile proteice de suprafață ale antigenului virusului rabiei ale virusului rabiei împotriva cărora sunt produși anticorpi.

3.1.2 Metoda cu anticorpi fluorescenți (MFA): O metodă de detectare a antigenului virusului rabiei cu anticorpi antirabici marcați cu eotiocianat de fluoresceină, cu formarea de complexe de incluziune luminoase caracteristice care sunt detectate în câmpul vizual al unui microscop fluorescent. .

3.1.3 metoda de izolare a virusului rabiei în cultura celulară a neuroblastomului de șoarece CCL-131 (sau neurinomului ganglionului lui Gasser de șobolan - NGUK-1): Metodă de izolare a antigenului virusului rabiei. bazată pe reproducerea virusului în cultură celulară și identificarea acestuia prin metoda anticorpilor fluorescenți.

3.1.3 biotest: O metodă pentru izolarea virusului rabiei la șoareci albi prin injectarea acestora cu o suspensie de material patologic, urmată de identificarea virusului prin metoda anticorpilor fluorescenți.

3.1.4 Metoda ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) pentru detectarea antigenului virusului rabiei pe baza interacțiunii sale specifice cu un anticorp anti-rabic imobilizat pe un suport solid, urmată de detectarea antigenului legat folosind un al doilea anticorp marcat cu enzimă prin colorarea produsului de reacție cu un cromogen.

3.1.5 Test de precipitare prin difuzie (RDP): O metodă pentru detectarea virusului rabiei bazată pe capacitatea anticorpilor și a antigenului viral al rabiei de a difuza într-un gel de agar și, la o interacțiune specifică, de a forma un complex antigen-anticorp vizibil pentru cei liberi. ochiul ca linie de precipitare.

3.1.6 Metoda reacției în lanț a polimerazei cu transcriptază inversă (RT-PCR) pentru detectarea genomului virusului rabiei prin traducerea secvenței specifice de ARN a virusului în ADN, urmată de copierea repetată a ADN-ului rezultat și detectarea produselor de reacție, efectuată in vitro .

3.2 Următoarele abrevieri sunt utilizate în acest standard:

FAG - imunoglobulină antirabică fluorescentă;

ANG - globulină antirabică;

CFG - control fluorescent globulină;

PBS - soluție tampon fosfat;

NGUK-1-neurinom Nodul lui Gasser al șobolanului;

FITC - izotiocinat de fluoresceină:

ARN - acid ribonucleic:

ADN - acid dezoxiribonucleic:

CCN31 - cultură de celule de neuroblastom de șoarece:

OFD - ortofenildiamină;

TMB - tetrametilbenzidină.

4 Condiții de cercetare și cerințe de siguranță

4.1 Condiții de cercetare

4.1.1 Cerințe generale pentru analiza microbiologică și lucrul cu microorganisme din grupele de patogenitate I - II - conform GOST ISO 7218.

4.1.2 Cerințe generale pentru spații - conform GOST ISO 7218.

4.1.3 Cerințe pentru personal - conform GOST ISO 7218, GOST ISO / IEC 17025. (1).

Angajații calificați cu experiență în lucrul cu microorganisme din grupele de patogenitate I-II, care au studiat metodele de lucru microbiologice, au voie să efectueze cercetări. vaccinat împotriva rabiei.

4.2 Cerințe de siguranță

4.2.1 Cerințe generale de siguranță pentru lucru în conformitate cu GOST 12.1.008.

4.2.2 Echipamentul de protecție pentru lucrători trebuie să respecte cerințele GOST 12.4.011.

4.2.3 Aerul din zona de lucru trebuie să respecte cerințele GOST 12.1.005.

4.2.4 Instruirea personalului de securitate a muncii în conformitate cu GOST 12.0.004.

4.2.5 Aruncarea materialului obținut pentru studiu, precum și a echipamentului individual de protecție, instrumentelor etc. se efectuează prin fierbere timp de 30 min sau autoclavare timp de 15 min la o presiune de (0,11 ± 0,20) MPa.

5 Instrumente de măsurare, echipamente, materiale, reactivi și animale

5.1 Pentru utilizare în cercetare:

Spectrofotometru de scanare cu un interval spectral de lungimi de undă de la 190 la 1100 nm cu o eroare de cel mult ± 0,5 nm și un interval de măsurători de densitate optică (OD) de la 0,1 la 3,0;

Plăci pentru reacții imunologice cu 96 de godeuri:

Termostat care menține temperatura de la 20 "-C până la 50 ° C:

Frigider de uz casnic, care asigură menținerea temperaturii de la 0 ° C la 10 ° C conform GOST 16317:

centrifuga de laborator;

baie de apă;

Microscop luminiscent inversat conform GOST 8074:

Mortare din porțelan cu pistil conform GOST 9147 sau omogenizator conform GOST ISO/IEC 17025;

Diapozitive conform GOST 9284:

Eprubete de sticlă conform GOST 25336;

vase Petri conform GOST 25336;

Cuvă conform GOST 25336;

Pipete cu o capacitate de 1,0; 2,0 și 10,0 cm 3 conform GOST 29230;

Pipete automate cu o capacitate de la 0,05 până la 0,20 cm 3 cu vârfuri:

Pensetă medicală conform GOST 21241:

Seringi de insulină cu o capacitate de 1,0 cm 3 conform GOST 22967 sau GOST 24861;

Ace de injectare conform GOST 25046:

Pahare de cultură pentru opt găuri;

Cuști pentru ținerea șoarecilor;

Acetonă conform GOST 2603 sau GOST 2768;

imunoglobulină antirabică fluorescentă (FAG);

globulină antirabică (AnG);

Controlul globulină fluorescentă (CFG);

Ulei de imersie nefluorescent conform GOST 13739;

Apă distilată conform GOST 6709;

Soluție tampon fosfat cu o concentrație molară de 0,01 mol/dm3 (PBS). pH 7,2 - 7,4;

- soluție sterilă de clorură de sodiu 0,9% izotonică:

Cultura celulară a neuroblastomului murin CC31 sau a nodului nonerinom Gasser al șobolanului -

Penicilină;

Streptomicină;

Medium Needle MEM cu un set dublu de aminoacizi și vitamine (DMEM), pH 7,2;

Soluție de tripsină 0,25%;

Ser de sânge embrionar de bovine pentru culturi celulare 10%;

Glutamina 3%;

Peroxid de hidrogen 3% conform GOST 177;

Un set de preparate pentru diagnosticul de laborator al rabiei animalelor prin ELISA;

O soluție de acid sulfuric cu o concentrație molară de 2 mol / dm 3 conform GOST 4204;

Hârtie de filtru conform GOST 12026;

Ștampila pentru realizarea puțurilor;

Mertiolat;

Agar "Difko" sau similar;

Soluție de metil portocală 1% în 50% Alcool etilic:

Antigene pozitive și negative;

Ser antirabic sau imunoglobulină;

Șoareci albi sănătoși clinic, cântărind 6-8 g.

5.2 Este permisă utilizarea altor instrumente de măsură cu caracteristici metrologice și echipamente cu specificatii tehnice nici mai rău, precum și reactivi și materiale de calitate nu mai mică decât cele indicate mai sus. Este permisă vesela de unică folosință.

6 Eșantionarea

6.1 Pentru a efectua cercetări privind prezența virusului rabiei, materialul patologic este trimis la laborator - un cadavru proaspăt sau un cap de animale mici, capul sau creierul animalelor mari.

6.2 Materialul patologic selectat pentru cercetare este ambalat într-un recipient rezistent la umiditate și livrat la laborator în recipiente metalice. Materialul congelat este plasat într-un criocontainer.

6.3 Materialul patologic este însoțit de un document care conține următoarele date; numele și adresa expeditorului, tipul de animal, datele anamnestice și clinice și elieootologice.

6.4 Studiile de laborator se efectuează imediat după primirea materialului patologic.

6.5 Pentru cercetare, bucăți de țesut sunt prelevate de la animale mari din fiecare parte a creierului (coarnele lui Ammon, cerebel, cortexul cerebral, medular) 0,5 - 1,0 cm în dimensiune Creierul animalelor mici, cum ar fi șoarecii, este examinat ca întreg.

Numai probele de țesut cerebral proaspăt sau proaspăt congelat sunt potrivite pentru studiul MFA și metoda de izolare a virusului rabiei într-o cultură de celule de neuroblastom de șoarece CCL-131 (sau NGUK-1). Probele de creier de animale care se descompun (în stadiul de degradare), conservate cu glicerol, fixate cu alcool metilic, formol sau alte mijloace care favorizează apariția fluorescenței nespecifice nu sunt permise pentru cercetare.

Pentru realizarea unui biotest, este permisă utilizarea probelor de creier conservate într-o soluție de glicerol 30% -50% *. Nu este permisă utilizarea altor conservanți. Pentru conservare, materialul patologic poate fi congelat la o temperatură care nu depășește minus 10 C.

7 Metoda cu anticorpi fluorescenți (MFA)

7.1 Esența metodei

Esența metodei anticorpilor fluorescenți constă în interacțiunea specifică a anticorpilor anti-rabici fluorescenți cu antigenul omolog al virusului rabiei. Complexul antigen-anticorp rezultat marcat cu FITC. este detectat vizual printr-o strălucire caracteristică în câmpul vizual atunci când este privit la microscop fluorescent.

7.2 Pregătirea pentru studiu

7.2.1 Pregătirea probei

7.2.1.1 Se prepară cel puțin trei preparate (amprente sau frotiuri) din fiecare parte a creierului din bucățile de țesut selectate conform punctului 6.5 pe lame de sticlă degresate cu grijă. Dacă starea materialului patologic permite, atunci se pregătesc amprente, în alte cazuri se fac frotiuri.

7.2.1.2 Pregătirea tipăririlor

Bucăți de țesătură selectate conform 6.5. pune pe hârtie de filtru împăturită în patru până la șase straturi. Creierul animalelor mici este tăiat peste cap, captând toate departamentele sale, și îl pune cu partea tăiată în sus pe hârtie de filtru pliată în patru până la șase straturi. Suprafața tăiată se atinge cu o lamă de sticlă, apăsând-o ușor până se obține o amprentă subțire pe sticlă.

7.2.1.3 Pregătirea frotiurilor

O bucată de țesut din fiecare parte a creierului (la animalele mici întregul creier), selectată conform punctului 6.5. se freacă într-un mortar de porțelan cu un pistil până se formează o masă omogenă, din care se fac frotiuri pe lamele de sticlă.

7.2.1.4 Ca control, se fac tampoane sau amprente din creierul șoarecilor albi sănătoși, lipsiți de rabie și nevaccinați, așa cum este descris la 7.3.1.2 și 7.3.1.3.

7.2.1.5 După preparare, petele sau amprentele sunt uscate la aer timp de 20-30 de minute. se fixează în acetonă răcită la temperatura de 4'C timp de 4 - 12 ore sau la o temperatură de minus 20 * C timp de 1 oră, după care se îndepărtează din acetonă şi se usucă la aer timp de 10 - 15 luni.

7.2.2 Prepararea reactivilor

FAG. Ang și KFG sunt dizolvate cu apă distilată până la volumul inițial indicat pe eticheta fiolei. Perioada de valabilitate a FA dizolvate. AnH și CFG la o temperatură de (5 ± 2) C - nu mai mult de două săptămâni.

Direct pentru studiu, cantitatea necesară de FAG dizolvat. AnG și KFG sunt diluate cu FBI până la diluția de lucru indicată pe eticheta fiolei. Diluții de lucru ale FAG-urilor dizolvate. Ang și CFG sunt utilizate în ziua pregătirii.

7.3 Efectuarea studiului

Lamele cu preparate (pete sau amprente) conform punctului 7.2.1 se pun într-o cameră umedă (vasă Petri sau cuvă cu fundul umezit). Apoi, unul dintre cele trei preparate preparate este acoperit cu FAG într-o diluție de lucru uniform pe întreaga suprafață a frotiului sau a amprentei folosind o pipetă. Diluția de lucru a KFG se aplică celui de-al doilea preparat. Închideți camera cu medicamente. plasat într-un termostat la o temperatură de (37 ± 1) * C și păstrat timp de 30

min. Preparatele de control sunt colorate în paralel. La sfârșitul colorării, preparatele sunt spălate de trei ori, scufundându-le de fiecare dată timp de 10 min într-un vas cu PBS. clătiți cu apă distilată și uscați la aer timp de 20-30 de minute.

Diluția de lucru a Ang se aplică celui de-al treilea preparat. plasat într-un termostat la o temperatură de (37 ± 1) * C și incubat timp de 30 de minute. Apoi preparatul se spală de trei ori, scufundandu-se de fiecare dată timp de 10 minute într-un vas cu PBS. se clătește cu apă distilată, se usucă la aer timp de 20 - 30 de minute și se colorează cu diluția de lucru a FAG. așa cum este descris mai sus.

7.4 Manipularea rezultatelor

În preparatele colorate, țesutul cerebral neafectat de virusul rabiei strălucește slab. galben cenușiu.

Antigenul virusului rabiei este detectat în neuroni și în celulele din exterior sub formă de granule de culoare verde strălucitor de diferite forme și dimensiuni - de la abia vizibile până la diametrul de 15-20 microni. Uneori există un număr mare de particule mici de culoare verde strălucitor (cu dimensiunea de până la 1 micron) de formă rotundă și ovală.

Diagnosticul de rabie se consideră stabilit dacă în preparatul de testare se găsesc granule tipice verzi-gălbui în mai multe câmpuri vizuale ale microscopului. Totodată, în preparatele martor (în frotiuri sau amprente din creierul șoarecilor albi sănătoși fără rabie, colorați cu FAG), precum și în preparatele studiate, colorate cu CFG și pre-tratate cu AnG și colorate cu FAG. astfel de formațiuni nu ar trebui să existe.

Rezultatele studiului sunt raportate autorităților competente în conformitate cu procedura în vigoare pe teritoriul statului care a adoptat standardul.

8 în cazul unui rezultat negativ, studiile se efectuează pe 8 sau 9.

8 Metodă pentru izolarea virusului rabiei în cultura celulară a neuroblastomului murin CCL-131

8.1 Esența metodei

Esența metodei constă în izolarea virusului rabiei în cultura de celule de șoarece.

neuroblastom CCL-131 sau NGUK-1 cu identificarea sa ulterioară prin metoda anticorpilor fluorescenți.

Metoda este o alternativă la biotestul pe șoareci albi conform 9.

8.2 Pregătirea pentru studiu

8.2.1 Pregătirea probei

Părți egale de țesut prelevate steril din fiecare parte a creierului unui animal mic (coarnele lui Ammon, cerebel, cortexul cerebral, medula oblongata) sau bucăți de țesut din fiecare parte a creierului unui animal mare, prelevate conform 6.5. zdrobit cu foarfeca si macinat in mojar sau omogenizator, adaugand treptat o solutie sterila de clorura de sodiu izotona 0,9% pana se obtine o suspensie 10%. Penicilina și streptomicina sunt adăugate la suspensia creierului conform unităților SUA/cm3 și respectiv 1 mg/cm3.

Suspensia rezultată este bine amestecată și centrifugata timp de 5-10 minute la o viteză de 2000 rpm. Lichidul sedimentar de mai sus este transferat într-o eprubetă sterilă și depozitat la o temperatură care nu depășește 4 °C până la utilizare.

8.2.2 Pregătirea lamelor de cultură

O cultură zilnică de celule de neuroblastom de șoarece CCL-131 (sau NGUK-1) este îndepărtată din balonul de cultură utilizând o soluție de tripsină 0,25% și diluată cu mediu DMEM cu 10% ser fetal bovin și 3% glutamină până la o concentrație de 2 * 10 s celule. /cm3. 0,1 cm 3 din suspensia celulară rezultată se adaugă în godeurile din sticlă de cultură, se acoperă cu un capac și se plasează într-un incubator umed CO g cu un conținut de CO de 5% la o temperatură de (37 ± 1) ° C timp de 18- 20 de ore

8.3 Efectuarea studiului

Se adaugă 0,05 cm 3 de suspensie din fiecare parte a creierului în două godeuri de sticlă de cultură conform 8.2.2. Două godeuri sunt lăsate pe fiecare lamă pentru un control pozitiv și unul negativ. O suspensie a creierului unui șoarece infectat cu virusul rabiei - tulpina CVS este utilizată ca martor pozitiv. O suspensie a creierului unui șoarece sănătos clinic este introdusă ca martor negativ. Sticla de cultură este plasată într-un incubator umed cu CO2 cu un conținut de CO2 de 5% la o temperatură de (37 ± 1) *C timp de 42-48 ore.

La sfârșitul incubării, mediul este îndepărtat din godeurile sticlei de cultură cu ajutorul unei pipete automate, celulele sunt spălate o dată cu PBS (folosind o pipetă automată, se adaugă 0,2 cm 3 soluție în fiecare godeu) și se usucă într-un flux de aer laminar timp de 20 - 30 min. Apoi, în fiecare godeu se adaugă 0,1 cm3 de acetonă răcită la o temperatură de minus 20*C și se lasă la temperatura camerei timp de 30 de minute.

După fixarea celulelor, sticla de cultură este răsturnată și agitată pentru a îndepărta acetona și apoi uscată într-un flux de aer laminar timp de 20-30 de minute. Folosind un bisturiu și o pensetă, scoateți duza de plastic și uscați paharul pentru încă 5-10 minute. În fiecare godeu se adaugă 0,05 - 0,10 cm 3 FAG într-o diluție de lucru (selectată empiric), preparată în FBI. plasat într-un vas Petri umed și incubat la (37 ± 1) C timp de 30 min.

La sfârșitul colorării, lamelele sunt spălate de trei ori, scufundându-le timp de 10 minute de fiecare dată într-un vas cu PBS. Apoi preparatele se clătesc cu apă distilată și se usucă la aer timp de 20-30 de minute.

Uleiul de imersie nefluorescent este aplicat preparatelor colorate și vizualizat la microscop fluorescent.

8.4 Manipularea rezultatelor

În preparatele colorate, o cultură celulară neafectată de virusul rabiei strălucește slab. culoare galben-cenusie (control negativ). Antigenul virusului rabiei este detectat în citoplasma culturii celulare sub formă de granule de culoare verde strălucitor de diferite forme și dimensiuni, cu margini clare definite (control pozitiv).

Diagnosticul de rabie se consideră stabilit dacă în preparatul de testare se găsesc granule tipice galben-verzui în mai multe câmpuri vizuale ale microscopului.

Dacă virusul rabiei nu este detectat în cultura celulară, atunci se pune un diagnostic negativ.

Rezultatele izolării virusului rabiei în cultura celulară sunt definitive, nu sunt efectuate studii suplimentare.

9 Bistlerob pe șoareci albi

9.1 Esența metodei

Esența metodei constă în izolarea virusului rabiei prin injectarea intracerebrală a materialului patologic la șoareci albi, urmată de identificarea virusului prin metoda anticorpilor fluorescenți conform 7.

9.2 Pregătirea probelor pentru examinare - conform 6.2.1.

9.3 Efectuarea studiului

Cinci - șase șoareci albi sunt infectați cu o suspensie 10% de material patologic im-tracerebral într-un volum de 0,02 - 0,03 cm3. Șoarecii infectați sunt plasați într-o cușcă separată, pe care este atașată o etichetă care indică data infecției, numărul de șoareci, metoda de infectare și numărul de examinare al materialului patologic. Animalele sunt observate timp de cel puțin 30 de zile. Numărul de șoareci sănătoși, bolnavi și morți este înregistrat în jurnal.

9.4 Manipularea rezultatelor

La evaluarea rezultatelor se ține cont de prezența semnelor clinice la șoarecii infectați (blana ciufulită, aportul de hrană, coordonarea afectată a mișcărilor, paralizie, tremor, prosternare). Moartea șoarecilor în primele două zile după infectare nu este luată în considerare. Probele de creier de la animale bolnave și moarte, începând din a treia zi, sunt examinate de MAE până la 7.

Un biotest este considerat pozitiv dacă, începând din a treia zi după infectare, cel puțin un șoarece s-a îmbolnăvit și a murit, iar incluziuni specifice ale virusului rabiei au fost detectate în proba de creier folosind MFA.

Un diagnostic negativ poate fi dat numai după 30 de zile de observație, cu condiția ca toate animalele infectate să rămână în viață și sănătoase.

Rezultatele biotestului sunt considerate finale, nu se efectuează cercetări ulterioare.

10 Metoda imunologică enzimatică (ELISA)

10.1 Esența metodei

8 ELISA se bazează pe interacțiunea specifică a antigenului virusului rabiei cu antiheliul. imobilizat pe un suport solid. Antigenul legat este detectat folosind un al doilea anticorp antirabic marcat cu peroxidază. al cărui produs de reacție este colorat la adăugarea unui cromogen. Intensitatea colorării produsului de reacție este direct proporțională cu cantitatea de antigen.

10.2 Pregătirea pentru studiu

10.2.1 Ca material de testat (antigen), sunt utilizate mostre de țesut cerebral de animale moarte, ucise forțat, suspectate de rabie sau infectate experimental cu virusul rabiei.

10.2.2 Prepararea antigenului de testat

Probele de țesut cerebral obținute conform punctului 6.5 se zdrobesc, se macină în mojar și se prepară suspensii 10%* în soluție izotonă de clorură de sodiu C.9%, se încălzesc în baie de apă la temperatura de 60*C timp de 15 minute și se centrifughează pt. 5-10 min la 2000 rpm. Supernatantul este utilizat ca antigen de testare.

10.2.3 Prepararea reactivilor

toate soluțiile și reactivii înainte de stabilirea reacției trebuie păstrate cel puțin 30 de minute la o temperatură de (22 ± 1) * C.

Pregătirea componentelor trusei se efectuează conform instrucțiunilor de utilizare.

10.3 Efectuarea studiului

10.3.1 ELISA se efectuează într-o versiune sandwich folosind componentele incluse în trusa pentru detectarea antigenului patogen al rabiei în material patologic.

Pentru ELISA se folosesc plăci pentru reacții imunologice cu fund plat.

Volumul ingredientelor introduse în etape în godeurile tabletei este egal între ele și este

10.3.2 Sensibilizarea plăcii

6 godeuri dintr-o placă de polistiren sunt încărcate cu ANG la diluția de lucru indicată pe etichetă. Placa cu ANG se acoperă cu un capac și se incubează într-un termostat la o temperatură de (37 ± 0,5) *C timp de 3 ore sau la o temperatură de 4 *C timp de 18 ore.După incubare se spală godeurile plăcii. de trei ori cu soluție tampon de spălare. Scuturați conținutul godeurilor cu fiecare spălare. iar soluția rămasă se îndepărtează atingând hârtie de filtru.

10.3.3 Aplicarea antigenelor

8 rânduri de farfurie A. 8 și C adaugă tampon de spălare. Antigenele de control pozitive (godeu A1) și negative (godeu A2) incluse în trusă, precum și probele de testat (godeuri AZ. A4 și etc.) sunt introduse în godeurile tabletei și titrate vertical, obținându-se diluții de la 1. : 2 la 1: 8. Cu un număr mare de mostre, completați alte rânduri ale tabletei. Placa se acoperă cu un capac și se incubează într-un hermostat la o temperatură de (37 ± 0,5) *C timp de 1 oră.La sfârșitul incubației, godeurile plăcii sunt spălate de trei ori din antigenele nelegate de imunoglobulină, așa cum este descris în 10.3.2.

10.3.4 Aplicarea conjugatului de leroxidază de rabie

Diluția de lucru a conjugatului anti-peroxidază antirabic se introduce în godeurile plăcii, după care se acoperă cu un capac și se incubează într-un termostat la temperatura de (37 ± 0,5) C timp de 1 oră, apoi godeurile de plăcile sunt spălate de trei ori conform descrierii de la 10.3.2.

10.3.5 Întinderea amestecului de substrat

Pentru manifestarea reacției, amestecul de substrat preparat este adăugat în godeurile tabletei. Reacția este prezentată timp de 15 - 30 min la o temperatură de (22 ± 0,5) *C în întuneric. Reacția este oprită prin adăugarea unei soluții de acid sulfuric cu o concentrație molară de 2 mol/DM3.

10.4 Manipularea rezultatelor

Contabilitatea reacției se efectuează vizual sau pe un spectrofotometru de scanare în conformitate cu instrucțiunile de utilizare ale trusei.

Dacă OPD este utilizat ca cromogen în amestecul de substrat. apoi măsurarea densității optice se efectuează la 490 nm. dacă se utilizează TMB. apoi la 450 km.

O reacție este numărată numai dacă nu există o colorare specifică în godeurile cu antigen martor negativ atunci când există o colorare intensă în godeurile cu antigen martor pozitiv. La numărarea vizuală, proba este considerată pozitivă dacă cel puțin o (prima) diluție prezintă o colorare specifică.

Când se ia în considerare spectrofotometric rezultatul ELISA, se efectuează calculul coeficientului de specificitate K sp. care este egal cu raportul dintre densitatea optică (OD) a produsului de reacție din godeurile cu antigenul pozitiv de control sau materialul de testat (OD) și densitatea optică a amestecului de substrat din godeurile cu antigenul negativ de control (OD) . Reacția este considerată pozitivă. dacă coeficientul de specificitate este mai mare de 2,1 și negativ dacă este mai mic de 2,1.

OP1 * 0,641, OPg a 0,120, Ksp \u003d 5,34 - reacția este pozitivă sau OP1 \u003d 0,180, OPg la 0,120 K cu „ * 1,5 - reacția este negativă.

În cazul unei reacții pozitive, diagnosticul se consideră stabilit. Un rezultat negativ trebuie confirmat prin alte metode conform 7 - 9.

11 Reacția de precipitare prin difuzie (RDP)

11.1 Esența metodei

Esența metodei RDP constă în capacitatea anticorpilor și a antigenului viral de a difuza într-un gel de agar și, la o interacțiune specifică, să formeze un complex antigen-anticorp, care este vizibil cu ochiul liber sub forma unei linii de precipitare.

11.2 Pregătirea examenului

11.2.1 Pregătirea probei

Pregătirea probelor pentru cercetare - conform 8.2.1.

Probele de creier de animale învechite contaminate cu microfloră bacteriană sunt permise pentru cercetare.

11.2.2 Prepararea agarului

Pentru a prepara agar, amestecați 1,5 g de agar Difko. 1 cm3 soluție 1% de metil portocală în etanol 50%. 0,01 g mertiolat. 100 cm 3 soluție izotonică de clorură de sodiu. Amestecul rezultat se fierbe până când agarul este complet topit, se toarnă în eprubete, se autoclavează la o presiune de 0,5 atm timp de 30 de minute și se păstrează la frigider la o temperatură de 4°C.

11.2.3 Pregătirea lamelor (cutii Petri)

Reacția este plasată fie pe lame de sticlă, fie pe vase Petri. Pe un pahar degresat se aplică o picătură de agar topit, se distribuie uniform peste pahar și se lasă la temperatura camerei timp de 20-30 de minute pentru a solidifica agarul. Apoi se aplică pe sticlă 2,5 cm 3 de agar topit, formând un strat de aproximativ 2 mm grosime. si se lasa 20-30 de minute. Găurile sunt făcute într-un strat înghețat de agar folosind o ștampilă specială sau un tub metalic cu pereți subțiri cu un diametru de 4-5 mm. Coloanele de agar sunt îndepărtate cu grijă, fără a deteriora sau permite ca un strat subțire de gel de agar să se desprindă de sticlă, folosind pensete pentru ochi sau alt instrument.

Cutiile Petri se prepară în mod similar, adăugându-le 10 - 15 cm 3 de agar topit pentru a obține un strat de 2-3 mm grosime.

11.3 Efectuarea studiului

Imediat înainte de inițierea reacției se prepară diluții de ser antirabic (imunoglobulină), pentru care se adaugă 1,0 cm 3 de soluție izotonică de clorură de sodiu în patru eprubete. Se adaugă 1,0 cm 3 de ser antirabic în prima eprubetă, obținându-se o diluție de 1: 2.

se amestecă și se transferă 1,0 cm 3 din amestec într-o a doua eprubetă etc. Astfel, se obțin patru eprubete cu diluții de 1: 2,1: 4,1: 8 și 1:16.

8 godeuri pregătite contribuie cu 0,05 - 0,07 cm 3 dintr-o probă de creier (fiecare probă într-un godeu separat), obţinută conform 8.2.1. și diluții de ser antirabic sau imunoglobuline (1:2; 1:4; 1:8:1:16) conform Figura 1.

Figura 1 - Schema de aplicare a materialelor

Ar - cornul lui Emmon; Pm - medulla oblongata; A+ - antigen de control pozitiv; M - cerebel; K - cortexul cerebral; A- - antigen de control negativ.

este posibil să se utilizeze alte scheme de introducere a materialului, dar utilizarea antigenelor pozitive și negative este obligatorie.

Lamele cu materialul de testat sunt plasate în cutii Petri cu fundul umezit sau cu un desicator umed, apoi într-un termostat la o temperatură de (37 ± 1) * C timp de 48 de ore (cutiile Petri se acoperă cu un capac și se pun în un termostat).

Reacția este luată în considerare după 6,24 și 48 de ore.

11.4 Manipularea rezultatelor

Reacția este considerată pozitivă atunci când chiar și o linie de precipitare de orice intensitate apare între godeurile care conțin materialul de testat și ser antirabic (imunoglobulină).

În acest caz, trebuie observată o linie de precipitare vizibilă între antigenul pozitiv și serul antirabic (imunoglobulină) și nu trebuie să existe o linie de precipitare între antigenul negativ și serul antirabic (imunoglobulină).

În 8 cazuri de reacție pozitivă, diagnosticul este considerat stabilit. Un rezultat negativ trebuie confirmat prin alte metode conform 7-10.

bibliografie

Ghidul UE de bune practici de fabricație pentru medicamente de uz uman și veterinar

UDC 619:616.98:579.852.1:615371 MKS 11.220

Cuvinte cheie: rabie, diagnosticare, metoda anticorpilor fluorescenți, imunotest enzimatic, biotest, reacție de precipitare prin difuzie

Semnat pentru publicare la 04.01.2014. Format 60x84V

Uel. pvc. l. 1.40. Circulație 31 echiv. Zach. 1363.

Elaborat pe baza versiunii electronice furnizate de dezvoltatorul standardului

FSUE „STANDARTINFORM”

123995 Moscova. Banda Garnet, 4.

RABIA DIAGNOSTIC RAPID

Metode de detectare a antigenelor. În cazul rabiei pentru diagnosticare expresă, se pot folosi metode de anticorpi fluorescenți (MFA), reacții de precipitare (RP) în gel de agar, metode de imunotest enzimatic (ELISA), reacție în lanț a polimerazei (PCR). Sunt necesare mai multe teste pentru a diagnostica rabia la oameni in vivo.

Determinarea anticorpilor la antigenele virusului rabiei. Detectarea anticorpilor în serul sanguin sau lichidul cefalorahidian este o metodă importantă de diagnostic. Testarea serologică a anticorpilor specifici rabiei este efectuată în serul sanguin pentru a determina vaccinarea pre și post-expunere și pentru a determina momentul imunizării de rapel pentru a crește răspunsul imun.

Izolarea virusului. Pentru izolarea și identificarea virusului se utilizează metoda biotestului pe șoareci albi. Materialul de testat este suspendat într-o soluție fiziologică care conține antibiotice și ser fetal bovin. Suspensia se administrează intracerebral la șoareci albi cu greutatea de 5–6 g. Pentru a dovedi dezvoltarea infecției, șoarecii sunt observați zilnic până în a 30-a zi după inoculare. Șoarecii care dezvoltă boala în această perioadă sunt eutanasiați imediat și țesuturile creierului sunt examinate prin MFA direct.

Avantajul acestei abordări este capacitatea de a detecta cantități mici de virus rabiei în material. Dezavantajul metodei este necesitatea de multe zile (7–18 zile) de așteptare între inoculare și manifestarea primelor semne ale bolii. Pentru a reduce perioada de incubație, se folosesc șoareci care alăptează. Șoarecii cu vârsta mai mică de 3 zile pot fi utilizați pentru diagnosticare expresă: la șoarecii sacrificați după 3 zile, antigenul virusului este deja detectat în creier, care poate fi detectat de MFA.

Această metodă de izolare a virusului se practică ca test de confirmare a diagnosticului pentru rezultate negative pentru depistarea antigenului și a corpurilor Babes-Negri și în cazul mușcăturii unei persoane de către un animal suspectat de rabie. Acesta oferă sensibilitate și specificitate adecvate, adică este privit la nivelul semnificației diagnostice a metodei de imunofluorescență directă. În plus, această metodă este cea principală pentru identificarea variantelor de virus și este promițătoare pentru dezvoltarea de reactivi de diagnostic.

Izolarea și identificarea virusului în cultura celulară. Principalul dezavantaj al izolării virusului în timpul infecției animalelor de laborator este durata metodei. Acest lucru poate fi evitat prin utilizarea culturilor celulare. De obicei, o cultură de celule de neuroblastom de șoarece este utilizată în aceste scopuri dacă este necesar să se examineze țesuturile cerebrale. Creierul este suspendat într-un mediu nutritiv de cultură, suspensia este aplicată pe un monostrat de cultură celulară și incubată timp de una până la câteva zile.

Sensibilitatea unei culturi date la virus poate fi crescută prin tratarea acesteia cu DEAE dextran. Monostratul celular este apoi spălat, fixat la rece cu acetonă sau un amestec de formol și metanol și examinat prin imunofluorescență. Dacă animalul a fost infectat cu virusul rabiei, atunci incluziunile citoplasmatice ale antigenului virusului rabiei sunt detectate în monostratul culturii celulare.

Sa demonstrat că antigenul virusului rabiei poate fi detectat pe celulele de neuroblastom de șoarece Na C1 300 în combinație cu MFA după 2 zile. Sensibilitatea metodei este comparabilă cu cea a izolării virusului la șoareci.

Deși virusul rabiei are neuropatogenitate obligatorie in vivo, este capabil să infecteze o gamă largă de celule gazdă in vitro, care pot fi utilizate pentru a testa alte țesuturi și organe pentru prezența virusului rabiei. S-a stabilit că virusul rabiei se înmulțește în celulele BHK-21 și Vero, în celulele primare ale embrionilor de pui sau rinichilor de hamster. S-a demonstrat că adsorbția virusului și introducerea lui în celulă au loc în decurs de 7 ore. După 24-48 de ore, în interiorul celulei se formează noi particule virale, după 72 de ore înmuguresc din membrana celulară în spațiul intercelular.

Metode de cercetare

Pentru diagnosticul expres al rabiei poate fi utilizat:

o metodă ÎN CAZUL ÎN CARE UN- pentru a detecta antigenul virusului rabiei în amprentele corneei sau din ceafa unui pacient care conține foliculi de păr;
b) metoda PCR- pentru detectarea ARN virusului în probele de biopsie tisulară, saliva, lichidul cefalorahidian sau lacrimal;
c) metoda ELISA- pentru a detecta anticorpi specifici (antigen) la pacientii cu evolutie tipica sau atipica.
d) metoda biotestele- pentru a izola virusul în stadiile incipiente ale bolii sau pentru a detecta anticorpi în sânge sau lichid cefalorahidian la stadii târzii boli. Pentru diagnosticarea expres, se folosește o metodă complexă (biotest + MFA), care constă în infectarea șoarecilor nou-născuți de 2 zile cu materialul de testat și examinarea creierului acestora în zilele 3-4 în MFA.

Alegerea metodelor de diagnosticare in vivo depinde în mare măsură de stadiul bolii: o metodă bazată pe detectarea antigenelor, de regulă, este foarte sensibilă la sfârșitul perioadei de incubație, în primele zile ale bolii, în timp ce anticorpii de neutralizare a virusului apar de obicei în lichidul cefalorahidian și în sângele seric după 7-10 zile de la debutul bolii.

Reacția de imunofluorescență. Metoda se bazează pe utilizarea anticorpilor legați la un colorant, de exemplu, izotiocianatul de fluoresceină. RIF este utilizat pe scară largă pentru a detecta antigenele virale în materialul pacienților și pentru diagnosticarea rapidă.

Metoda are cel mai înalt grad de sensibilitate; este baza pentru diagnosticarea expresă și permite detectarea antigenelor virale în câteva ore.

Principalele avantaje ale MFA sunt: viteza de execuție, specificitate ridicată (100%). Timpul petrecut pentru diagnosticarea bolii cu ajutorul ei este mai mic de o zi. Sunt utilizate versiunile directe și indirecte ale AMF.

Imunofluorescență directă rămâne metoda preferată de diagnosticare a rabiei. Lamele care conțin frotiuri-amprente ale țesuturilor cerebrale sau ochelari cu un monostrat de cultură de țesuturi se fixează în acetonă timp de 1-4 ore. Preparatele sunt apoi uscate și tratate cu anticorpi policlonali fluorescenți anti-nucleocapsid (reactiv imunofluorescent).

Acest reactiv este un conjugat preparat din anticorpi policlonali specifici de clasă IgG la antigenul nucleocapsid al virusului și izocianatul de fluoresceină (FITC). Anticorpii specifici se obțin prin hiperimunizarea animalelor (iepuri, hamsteri sau cai) cu un amestec de epitopi nucleocapside virali.

În prezent, anticorpii monoclonali de șoarece împotriva nucleocapsidei virusului rabiei sunt din ce în ce mai folosiți în aceste scopuri. După o incubare de 30 de minute la 37°C, preparatele de diagnosticare sunt spălate în mod repetat cu ser fiziologic și apă distilată.

Anticorpii marcați cu FITC sunt fixați numai la locurile de localizare a antigenelor nucleoproteice virale. Preparatele sunt apoi uscate în aer și examinate prin microscopie luminoasă folosind o lampă cu xenon și un filtru adecvat ca sursă de lumină.

La versiune indirectă antigenul este mai întâi combinat cu ser imun specific necolorat. Apoi, complexele antigen-anticorp non-fluorescente formate sunt expuse la ser imun marcat cu fluorocrom care conține anticorpi la proteine serice specifice. Versiunea indirectă a MFA, împreună cu detectarea antigenului, face posibilă cuantificarea anticorpilor din serul de testare prin diluarea adecvată a acestuia.

Formațiunile marcate cu FITC în celulele diferitelor țesuturi sunt detectate ca colorație fluorescentă galben-verde pe un fundal întunecat (sub formă de incluziuni intracitoplasmatice rotunde sau ovale).

Test imunosorbent legat. Metoda se bazează pe principiul sorbției proteinelor pe faza solidă urmat de formarea de complexe antigen-anticorp detectate de o soluție substrat-indicator. Antigenul adăugat în godeuri se leagă în mod specific la anticorpi. Serurile de testat sunt aplicate pe stratul de antigen în diluțiile necesare. În prezența anticorpilor specifici în ei, aceștia din urmă se leagă de antigen. Pentru a detecta legarea, pe stratul de anticorpi se aplică imunoglobulina împotriva globulinelor serice umane conjugate cu peroxidază de hrean. Cantitatea de conjugat de sorbție este proporțională cu cantitatea de ser uman legat de antigen. Acest lucru poate fi determinat folosind o soluție indicator (ortofenilendiamină + peroxid de hidrogen), ale cărei componente, ca urmare a acțiunii peroxidazei conjugate, colorează lichidul maro-galben. La examinarea cazurilor neclare, utilizarea ELISA pe lângă metodele RP sau RSK vă permite să creșteți fiabilitatea diagnosticului de laborator al rabiei, datorită sensibilității ridicate a acestei metode. Metoda permite detectarea particulelor infecțioase și defecte.

Pentru a determina anticorpii antirabici în timpul vaccinării, puteți utiliza metoda indirecta ELISA, folosind virusul purificat ca antigen, și pentru determinarea anticorpilor de clasă IgG în serul uman - proteină A de stafilococ asociată cu peroxidaza de hrean. Rezultatele ELISA sunt comparabile cu cele obținute în testele de neutralizare virală la șoareci. Metoda permite detectarea prezenței IgM la începutul procesului de imunizare.

Metodele imunoenzimatice sunt foarte promițătoare pentru detectarea antigenului nucleocapside al virusului în timpul diagnosticului post-mortem în țesuturile cerebrale. Printre acestea, de exemplu, se numără o metodă ELISA rapidă de diagnosticare a rabiei, bazată pe prepararea plăcilor sensibilizate cu anticorpi de izotip IgG la nucleocapsidul primului serotip, diluate în tampon carbonat.

Materialul de testat este omogenizat în tampon sau mediu de cultură, clarificat prin centrifugare, adăugat în godeuri și incubat în plăci. Antigenul nucleocapside fixat cu anticorpi specifici este identificat prin adăugarea unui conjugat de peroxidază cu anticorpi anti-rabic antinucleocapsid cu specificitate diferită de specie și un substrat cromogen. Sensibilitatea metodei este de 0,8–1,0 ng/ml.

Această metodă poate detecta antigenele virusurilor de diferite serotipuri. Utilizarea conjugaților de anticorpi specifici nucleocapsidelor marcați cu biotină crește sensibilitatea metodei la 0,1–0,2 ng/ml.

Antigenul nucleocapside este detectat cu succes prin ELISA, dar materialul, chiar descompus, nu trebuie fixat cu formol.

metoda reacției în lanț a polimerazei. Pentru diagnosticarea rapidă a virusului rabiei și identificarea lisavirusurilor, cea mai convenabilă metodă este reacția în lanț a polimerazei (PCR). Metoda PCR este cea mai fiabilă și cea mai rapidă metodă pentru izolarea ARN virionului din orice probă care conține virusul la o concentrație scăzută. Cu el, puteți crea multe copii ale virusului ARN. Această metodă este utilizată pentru a confirma rezultatele MFA și pentru a detecta virusul în salivă, foliculii de păr din spatele gâtului și capului.

PCR se bazează pe principiul replicării naturale a ADN-ului. Esența metodei este repetarea repetată a ciclurilor de sinteză (amplificare) a unei secvențe de ADN specifică virusului folosind o ADN polimerază Taq termostabilă și doi primeri specifici, așa-numiții primeri.

Fiecare ciclu este format din trei etape cu diferite regim de temperatură. În fiecare ciclu, numărul de copii ale regiunii sintetizate este dublat. Fragmentele de ADN nou sintetizate servesc ca matriță pentru sinteza noilor catene în următorul ciclu de amplificare, ceea ce face posibilă acumularea unui număr suficient de copii ale regiunii ADN selectate în 25-35 de cicluri pentru determinarea acesteia, de obicei prin gel de agaroză. electroforeză.

Sensibilitate deosebit de ridicată a PCR atunci când se utilizează primeri complementari genei N, atunci când este posibil să se detecteze ARN viral în probele care conțin virusul la un titru de 10 MLD50. Metoda PCR poate detecta ARN virusului chiar și în material patologic descompus.

În prezent, teste de confirmare (confirmatoare), cum ar fi PCR cu revers transcriptază (RT-PCR), au fost dezvoltate și sunt utilizate pe scară largă în practică. Metoda RT-PCR este foarte sensibilă și cea mai eficientă. ARN-ul este extras din țesuturile organului infectat cu virus, transcris în ADNc, care este apoi amplificat Metoda PCR. RT-PCR necesită primeri obținuți pentru regiunile conservatoare ale genomului virusului rabiei. De obicei, sunt utilizate gene care codifică o nucleoproteină sau o proteină N.

Metoda PCR este foarte specifică și foarte sensibilă. Este unul dintre cele mai precise teste pentru detectarea antigenului rabiei; permite diagnosticarea rabiei chiar daca in material exista cel putin un virion. Testul se bazează pe completarea complementară a matriței ARN, efectuată in vitro folosind enzima ARN polimeraza. În ultimii ani, PCR a fost din ce în ce mai utilizată pentru diagnostic și monitorizare. infecții virale. Cu toate acestea, tehnica este complexă, costisitoare și încă nu este suficient de unificată pentru utilizarea de rutină.

Metodele citologice au în prezent o valoare diagnostică limitată, dar ar trebui totuși utilizate într-o serie de infecții. Se examinează materialele de autopsie, biopsiile, frotiurile care, după o prelucrare corespunzătoare, sunt colorate și analizate la microscop. În rabie, este detectarea incluziunilor în citoplasma celulelor (corpii Babes-Negri).

Izolarea virusului. Izolarea virusului poate fi necesară pentru a confirma rezultatele testelor cu antigen și pentru a caracteriza în continuare izolatele. Și deși această metodă este una dintre cele mai vechi și consumatoare de timp metode de diagnostic, astăzi izolarea virusului cu identificarea ulterioară folosind una dintre metodele moderne (ELISA cu anticorpi monoclonali sau PCR) este cea mai fiabilă metodă de diagnosticare, așa-numita. "Standarde de aur".

Eficacitatea metodelor de diagnosticare a rabiei poate varia în funcție de o serie de factori (stadiul bolii, momentul prelevării materialelor, calitatea probelor obținute, condițiile de depozitare, experiența personalului, calitatea reactivilor etc.). Dacă un rezultat pozitiv confirmă rabia, atunci un rezultat negativ nu indică întotdeauna absența bolii. Prin urmare, pentru rabie, experții OMS recomandă utilizarea mai multor teste, în special MFA în combinație cu un biotest pe șoareci albi nou-născuți (2-3 zile).

Măsuri de prevenire personală

Toate lucrările cu materiale suspectate că conțin virusul rabiei, precum și cu animale suspectate de rabie, trebuie efectuate cu respectarea măsurilor de siguranță personală. lucrătorii medicali şi medici veterinari ar trebui să lucreze în halate, mănuși, măști.

La sfârșitul lucrării, cutiile sunt tratate cu o soluție de peroxid de hidrogen 3%.

Flacoanele, fiolele și instrumentele, precum și materialele rămase care conțin virusul rabiei și toate ustensilele după muncă sunt dezinfectate prin autoclavare timp de 1 oră la 1,5 atm (mod ucidere).

Echipamentul individual de protecție se dezinfectează prin fierbere sau autoclavare. Suprafața de lucru a mesei și mâinile sunt dezinfectate cu o soluție dezinfectantă (soluție de cloramină 0,5%).

Rabia (R) este o boală acută a animalelor cu sânge cald, caracterizată prin afectarea sistemului nervos central. Animalele domestice și sălbatice de toate felurile, precum și oamenii, sunt susceptibile.

Boala este înregistrată în diferite regiuni ale globului. Nu au existat cazuri de răspândire a bolii în Australia, Marea Britanie, Japonia. Boala se termină aproape întotdeauna cu moartea. Există, de fapt, cazuri documentate de recuperare de la rabie la oameni și câini după infecția experimentală.

Virusul rabiei (virusul rabiei) aparține familiei Rhabdoviridae, genul Lyssavirus. S-a stabilit acum că VB are 4 serotipuri, ceea ce se datorează aparent diferenței de compoziție a proteinelor membranare. Toate variantele de VB sunt legate imunobiologic, dar diferă în virulență. WB are proprietăți GA și GAD. Există o relație liniară între activitatea infecțioasă și cea a GA. Animalele imunizate împotriva rabiei produc anticorpi VNA, KSA, antiHA și litici (distrugând celulele infectate cu virusul în prezența complementului).

Diagnosticul se face pe baza datelor epidemiologice, a simptomelor bolii, a modificărilor patologice (au o importanță mai mică) și, în principal, a rezultatelor analizelor de laborator.

Diagnosticul de laborator constă în studiul creierului animalelor pentru a detecta AG viral în IF, RDP, detectarea corpurilor Babes-Negri și un biotest pe șoareci albi.

În Federația Rusă, producția de truse pentru diagnosticarea B în IF și RDP este organizată în prezent la VNITIBP și KazNIVI.

Izolarea virusului. Cadavrele proaspete ale animalelor mici sunt trimise la laborator pentru cercetare, de la animale mari - cap sau creier. În unele cazuri, este permisă conservarea creierului în glicerină 50%. Cadavrul sau capul trebuie ambalate cu grijă într-o pungă de plastic, creierul - într-un borcan cu un dop de sticlă sau cauciuc măcinat, umplut cu parafină. Materialul este ambalat într-un recipient rezistent la umiditate. Doar creierele neconservate sunt potrivite pentru studii virologice. Trebuie amintit că autopsia, extragerea creierului și alte operații cu material patologic trebuie efectuate în condiții de sterilitate și respectarea strictă a măsurilor personale de prevenire: fixați ferm capul animalului, protejați mâinile cu 2 perechi de mănuși ( chirurgical și anatomic), puneți ochelari pentru a proteja ochii, iar pe nas și gură - un bandaj de tifon cu 6 straturi.

Cercetare de laborator de materiale rabia se desfășoară fără rând; rezultatele se raportează imediat medicului fermă și medicului șef al raionului (orașului).

Ordinea cercetării: din fiecare parte a creierului din partea stângă și dreaptă (cornul lui Ammon, cerebelul, cortexul cerebral și oblongata), sunt pregătite 4 amprente de frotiu pentru FI și detectarea corpurilor Babesh-Negri; cu țesut cerebral pune RDP; cu rezultate negative se face un biotest.

Detectarea corpurilor de incluziune specifice. Frotiurile de amprentă sunt colorate conform Vânzătorilor, Muromtsev sau alte metode. După colorare, preparatele sunt privite la microscop cu lumină cu sistem de imersie. Un rezultat pozitiv este prezența unor corpuri specifice Babesh-Negri (atunci când sunt colorate conform Vânzătorilor - formațiuni granulare ovale sau alungite clar definite de culoare roz-roșu în protoplasmă, atunci când sunt colorate conform Muromtsev - violet deschis cu incluziuni albastru închis de Babesh- Corpii Negri, mai des sunt localizați în afara celulelor nervoase.

Cea mai caracteristică trăsătură a corpurilor lui Babesh - Negri este structura lor internă, care le permite să fie absolut exact diferențiate. Boabele mici sunt vizibile în interior - boabe bazofile de culoare albastru închis, chiar negru, cu dimensiunea de 0,2-0,5 microni.

Valoarea diagnostică a detectării corpurilor de incluziune pentru dovezi ale infecției cu WB este în general recunoscută. Cu toate acestea, la animalele sănătoase, în special la pisici și șoareci albi, există formațiuni, a căror prezență poate provoca dificultăți de diagnostic. În unele cazuri, în creierul pisicii, este posibil să se diferențieze cu încredere astfel de incluziuni de corpurile Babes-Negri, iar aici se recomandă utilizarea metodelor de identificare, în special IF. În mod similar, la câinii care au murit ca urmare a otrăvirii cu venin de șarpe sau șoc electric, se pot găsi corpuri de incluziune asemănătoare cu corpurile Babes-Negri. Corpurile Babesh-Negri sunt detectate doar în 65-85% din cazurile de rabie, deci absența lor nu este un răspuns negativ, iar materialul este examinat în alte teste (IF, RDP, biotest).

DACĂ. Unul dintre principalele teste în diagnosticul B. Cu performanță înalt calificată, se obține o coincidență de 99-100% cu metoda biotestului. De obicei, în practica de diagnosticare, se utilizează metoda directă a IF, care se realizează folosind Ig fluorescente antirabică. Fixarea preparatelor în acetonă răcită (8-10°C) se efectuează timp de cel puțin 4 ore.Sunt utilizate ca martor negativ frotiurile-amprente ale creierului de șoareci albi sănătoși. Rezultatele sunt luate în considerare vizual într-un microscop fluorescent pe baza evaluării intensității strălucirii complexului AG-AT. AH VB este detectat ca granule galben-verzui sau verzi strălucitoare de diferite forme și dimensiuni în celule (mai des în afara celulelor). Diagnosticul se consideră stabilit dacă în mai multe câmpuri vizuale se găsesc un număr suficient (cel puțin 10) de granule tipice cu o strălucire verde strălucitoare sau o mulțime de puncte minuscule.În control nu ar trebui să existe o astfel de strălucire.

Pentru a demonstra specificitatea fluorescenței complexului AG-AT se folosește metoda de suprimare a IF, care constă în capacitatea AG rabie asociat cu AT nefluorescente de a nu se recombina cu AT specific fluorescent. Pentru a face acest lucru, preparatele fixe preparate din creierul studiat sunt acoperite cu 5% Ig antirabică nefluorescente, incubate timp de 30 de minute la 37°C într-o cameră umedă, spălate cu soluție salină și apoi colorate cu antirabic fluorescent. Ig prin metoda directă convențională. Nu ar trebui să existe fluorescență în preparatele tratate în acest mod.

Metoda IF face posibilă detectarea WB în celulele corneei ochilor și efectuarea unui diagnostic preliminar in vivo: în timpul bolii animalelor, precum și cu 1-2 zile sau mai mult înainte de manifestarea sa clinică. Metoda poate fi folosită pentru a studia animalele suspectate de boala B, precum și câinii și pisicile sănătoase clinic care au mușcat oameni și animale. Pentru a face acest lucru, pregătiți amprente din cornee, respectând toate regulile de siguranță personală, deschideți fisura palpebrală a animalului cu degetul mare și arătător și pe o zonă ușor proeminentă. globul ocular apăsați suprafața lamei de sticlă, retrocedând cu 0,5 cm de la capăt. Este necesar să se asigure că animalul nu clipește cu a treia pleoapă, deoarece celulele epiteliale sunt îndepărtate din sticlă și se obține un frotiu de proastă calitate. Din fiecare ochi se fac cel puțin 2 preparate care conțin 2 imprimeuri. Pentru control, amprentele corneene de la animale sănătoase sunt preparate într-un mod similar. Ele pot fi gătite la fermă. Printurile se usucă la aer, se fixează în acetonă timp de 4 ore la 4°C, se ambalează și se trimit la laborator. Preparate de colorare, ca la IF, conform metodei general acceptate.

În preparatele obținute de la animale bolnave sau cele aflate la sfârșitul perioadei de incubație a bolii, în citoplasma multor celule epiteliale se observă granule strălucitoare de diferite dimensiuni, de diferite forme - de la puncte asemănătoare prafului până la 2 microni sau mai mult. Pentru a obține rezultate fiabile, în fiecare preparat sunt examinate 50-100 de celule și cel puțin 200-400 de celule de la animal în total. Rezultatele microscopiei sunt considerate pozitive dacă 11% sau mai multe celule cu focare caracteristice de luminescență sunt găsite în amprentele corneei animalului. Trebuie avut în vedere că în preparatele de la animale sănătoase (martor), datorită autofluorescenței, pot exista celule unice cu focare similare ca formă și luminiscență.

Este important de reținut că IF face posibilă accelerarea răspunsului la diagnosticul final prin biotest, deoarece diagnosticul de B poate fi stabilit numai în a 4-a-8-a zi după infectarea șoarecilor cu materialul de testat și perioada de incubație a boala la soareci poate ajunge la 20 de zile. IF poate detecta WB în țesuturile glandei salivare submandibulare. Frotiurile sunt pregătite din glandele salivare submandibulare, preluând material din cel puțin 6 părți diferite ale glandei, deoarece distribuția virusului în ea este neuniformă. Adesea, pentru a obține o amprentă, trebuie să aplicați o presiune puternică, deoarece din cauza abundenței mucinei, pe sticlă rămâne puțin material.

S-a arătat posibilitatea identificării VB în piele prin metoda IF.În acest scop se prelevează mostre de scalp, precum și foliculi de păr senzitivi și tactili ai botului sau papilele senzoriale laterale (pe obrazul câinelui). Probele sunt depozitate la -20 sau -70°C. Din ele se fac criosecții, care sunt tratate cu globulină fluorescentă. Rezultatele analizei IF obținute în urma identificării VB în piele se corelează într-un grad ridicat cu datele obținute din studiul creierului aceluiași animal. S-a demonstrat o corelație strânsă între detectarea virusului AH în probele de creier și țesuturile buzelor prin metoda IF.

RDP. Este folosit pentru a detecta AH VB în creierul neconservat al animalelor care au murit din cauza rabiei stradale sau al șoarecilor utilizați într-un biotest. RDP este plasat prin micrometoda pe lame de sticlă folosind un gel de agar 1-1,5% conform metodei general acceptate. Cel mai mare procent de rezultate pozitive este dezvăluit atunci când se utilizează următorul stencil: A - corn de amoniu (partea dreaptă); B - scoarța cerebrală (partea dreaptă); C - cerebel (partea dreaptă); D - medulla oblongata (partea dreaptă); + (plus) - control pozitiv; - (minus) - control negativ; 1, 2, 3, 4 - godeuri cu diluarea imunoglobulinei specifice 1:2, 1:4, 1:8, respectiv 1:16

Cu ajutorul unei pensete, din fiecare parte a creierului se prepară o masă omogenă asemănătoare unei paste, care este plasată în godeurile corespunzătoare. De la șoareci, întregul creier este examinat. Din regiunile creierului din partea stângă, AG se prepară într-un mod similar (pentru fiecare examinare sunt necesare un total de 4 lame de sticlă cu gel de agar). Reacția se ia în considerare după 6, 24, 48 de ore Dacă există 1 sau 2-3 linii de precipitare între godeurile care conțin AG și imunoglobulină, reacția este considerată pozitivă.

RDP este simplu de realizat și specific, dar procentul de detectare a AG viral în materialul de testat este de 45-70. În studiul creierului șoarecilor obținut cu un biotest pozitiv, RDP dezvăluie până la 100% din cazuri. Absența corpurilor Babesh-Negri, fluorescența specifică și RDP negativ în materialul de testat nu oferă motive pentru a exclude prezența virusului. În acest caz, diagnosticul final se bazează pe rezultatele unui biotest pe șoareci albi, urmat de identificarea virusului.

Biotest. Este în general acceptat că o analiză biologică este mai mult metoda eficienta decât detectarea corpurilor Babesh-Negri, IF etc. Cu toate acestea, în unele cazuri s-a dovedit a fi și negativ, în ciuda confirmării diagnosticului de B prin detectarea corpurilor de incluziune și IF. Procentul de rezultate negative ale testelor biologice a variat între 1,3 și 12.

Informațiile despre eficiența diferită a unui biotest poate fi explicată printr-o serie de factori: alegerea unui animal de experiment, numărul acestora în experiment, metoda de infectare, metoda și perioada de depozitare a materialului înainte de intrarea în laborator. Fenomenul de interferență a particulelor infecțioase cu particulele inactive poate juca, de asemenea, un rol în cazul în care materialul insuficient diluat este utilizat pentru inoculare.

În creierul și glandele salivare ale vulpilor și sconcilor care au murit din cauza rabiei, s-a găsit o substanță care inhibă infectivitatea virusului, ceea ce face imposibilă diagnosticarea bolii la aceste animale prin infecția intracerebrală a șoarecilor. Prezența unei substanțe inhibitoare în materialul de testat nu împiedică detectarea AG viral prin metoda IF; pentru scocuri și vulpi, aceasta este cea mai sensibilă metodă de diagnosticare.

Dintre animalele de toate speciile (iepuri, cobai, șoareci albi adulți și hamsteri) utilizate pentru biotest, șoarecii care alăptează sunt preferați de mulți deoarece sunt mai sensibili la diferite tulpini de VB și mai puțin periculoși pentru a lucra. Hamsterii sirieni nu sunt inferiori soarecilor ca sensibilitate, dar sunt mai putin accesibili.

RSK. Detectarea AH specifică în RSK în diagnosticul rabiei este utilizată mai rar decât alte metode. AG este pregătit din creierul trimis pentru cercetare. Pentru a face acest lucru, țesutul cerebral (în special bogat în AG de legare a complementului, bucăți de talamus și trunchi cerebral) este triturat în tampon veronal într-un raport de 1:10 și lăsat la temperatura camerei timp de 1 oră, după care suspensia este inactivată la 56 ° C timp de 5 ore.Un astfel de tratament ucide virusul și înlătură anticomplementaritatea țesutului cerebral fără a deteriora antigenul specific. Suspensia este centrifugată timp de 15 minute la 3500 min-1 din supernatant, care este un material pentru testarea prezenței AG, se prepară diluții crescătoare de 2 ori de la 1:2 la 1:64 și se utilizează pentru cercetare în CSC. .

ELISA.În ELISA, colorarea specifică a AG în celulele creierului animalelor care au murit din cauza rabie este detectată atât în proaspăt luate, depozitate în glicerol, cât și în probe păstrate fără glicerină la 20 ° C timp de 8-18 ore.Acest test este potrivit pentru diagnosticul de rutină al rabiei la animale, pentru a detecta AG WB în secțiuni de parafină tisulară în timpul fixării preparatelor cu soluție de formol 10% cu pH 5,3 și tratarea ulterioară a preparatelor înglobate în parafină cu pepsină.

Spre deosebire de ROP la șoareci și în cultura celulară, ELISA poate detecta AT la animale în câteva ore, ELISA este cea mai promițătoare metodă de laborator pentru detectarea AT și indicarea virusului în sine. O metodă expresă de diagnosticare a rabiei este tehnica de captare și metoda IF pentru depistarea AH BB. S-a dovedit că metoda de detectare a AH VB în secțiuni parafinate prin metoda peroxidază-antiperoxidază este semnificativ superioară metodei ELISA. În 1987, a fost creat un kit de imunodiagnostic rapid enzimatic al rabiei (RREID), potrivit pentru studii epidemiologice și de laborator.

Identificarea variantei folosind mAT. Cu ajutorul mAb-urilor la glicoproteinele WB, au fost selectate variante AG, dintre care au fost identificate variante termolabile (avirulente) fenotipic. Când se utilizează 2 grupe de mAb, s-a demonstrat că tulpinile de diluare diferă de buc. Fixe (Pasteur), CVS, Flury HEP, ERA și tulpini „duck” pentru determinanții AH. Studiul a 7 tulpini izolate de la pacienți cu persoane B care utilizează mAb a făcut posibilă identificarea anumitor diferențe între acestea și tulpina vaccinului în raport cu determinanții AH.

Este în general acceptat că diferențele AT între tulpinile sălbatice pot fi detectate utilizând mAb împotriva nucleocapside AT N, care reacţionează cu incluziunile citoplasmatice ale celulelor infectate cu virus; antiglicoproteina (G AG), care reacţionează cu membranele celulelor infectate, lizează aceste celule în prezenţa complementului şi neutralizează virusul. În legătură cu posibila variabilitate AH a glicoproteinei de suprafață WB din diferite zone geografice, a fost utilizată ca AG protector o ribonucleoproteină caracterizată prin conservatorismul structurii AG. Astfel, nu numai proteina G, ci și RNP VB au activitate protectoare.

. Aceste metode nu sunt tipice pentru rabie, deoarece sunt utilizate numai în scopul testării imunității post-vaccinare. Pentru detectarea și titrarea anticorpilor post-vaccinare se utilizează pH-ul, care este stabilit prin metoda general acceptată. Un WB fix este folosit ca AG. RN pe celulele BHK-21 a fost mai sensibil decât IF indirect în detectarea AT în serurile vulpilor vaccinate. În plus, au fost propuse RTGA și ELISA.

RTGA. Nu am găsit încă aplicare largăîn practica diagnosticului, din cauza prezenței inhibitorilor nespecifici în serurile sanguine, la care WB este foarte sensibil, și cel mai important, GA AG, care nu au fost supuși unei purificări suficiente, au avut sensibilitate scăzută. Pentru prepararea HA AG WB se propune utilizarea buc. Moscova a crescut în cultură de celule VNK-21 după tratament cu saponină urmată de purificare și concentrare. HA este separat de alte componente ale virionului prin ultracentrifugare. Preparatul rezultat a avut un grad de purificare de 99,92%, a avut activitate GA ridicată (1:128), bine conservat timp de 1 lună la pH 5-9.

Înainte de a stabili RTGA, trebuie efectuată o tripsinizare moderată de două ori a eritrocitelor de gâscă pentru sensibilizarea acestora. Când se utilizează o suspensie de 0,25% de eritrocite tripsinizate (de preferință 107 celule la 1 ml), sensibilitatea RTGA crește de 4 ori. Pentru a dilua AG și serurile, se folosește o soluție de borat-sare (pH 9) cu adăugarea de 0,4% albumină serică bovină. Se prepară o suspensie de eritrocite într-o soluție salină cu pH acid, astfel încât, după combinarea cu un amestec de virus și ser, al cărui pH este 9, pH-ul final să fie stabilit în 6,2. După adăugarea suspensiei de eritrocite în godeuri, panoul este agitat, etanșat cu o peliculă transparentă și plasat pe gheață. Rezultatele RTHA sunt luate în considerare după 40-50 de minute, iar cu eritrocite de găini de 2 zile sau maimuțe rhesus - după 1-1,5 ore.

A fost dezvoltat un radioimunotest bazat pe capacitatea AT de a se lega la 125 1-AG WB marcat. IgG marcată izolată din serul hiperimun antirabic poate fi utilizată pentru a detecta WB AG cu RIA în fază solidă. Cele mai bune rezultate au fost obținute folosind o soluție de fosfat-sare (pH 6,0) cu o tărie ionică de 0,01 M și marcată IgG cu o activitate de 200-250 mii impulsuri / min.

RIA competitivă în fază solidă este aplicabilă pentru detectarea anticorpilor de rabie în supernatanții de ser și hibridom.

Diagnostic diferentiat. Este necesar să se excludă boala Aujeszky, în care animalele bolnave nu sunt agresive, nu există perversiune a apetitului. La câini, forma nervoasă a ciumei este exclusă. Rabia este suspectată în encefalomielita infecțioasă ecvină. Un complex de teste de laborator vă permite să faceți un diagnostic precis al rabiei. A fost propusă o nouă metodă de diferențiere a diferitelor tulpini de VB bazată pe scindarea restrictazei a produselor de amplificare în PCR a segmentului genei N.

Diagnosticul de laborator al rinotraheitei infecțioase bovine

Rinotraheita infecțioasă (IRT, erupție cu vezicule, vulvovaginită infecțioasă, rinotraheită infecțioasă necrotică, rinită infecțioasă, „nas roșu”, bronhopneumonie contagioasă, catar infecțios al căilor respiratorii superioare) este o boală contagioasă acută, caracterizată în principal de bovine, cataralizată prin lescrone. tractului respirator, febră, depresie generală și conjunctivită, precum și dezvoltarea vulvovaginitei pustuloase atunci când virusul pătrunde în organele genitale ale animalului și avort. Boala este omniprezentă.

Virusul rinotraheitei infecțioase bovine (IRT) aparține familiei Herpesviridae, subfamilia Alphaherpesvirinae, genul Varicellavirus.

Antigenic, virusul RTI bovin nu este omogen, există variante. Există o relație AG între virusurile RTI bovine și virusurile AD. La animale, virusul provoacă formarea VNA, KSA. Virusul are proprietăți GA în raport cu eritrocitele de șoarece.

Diagnosticul de laborator include: 1) izolarea virusului din materialul patologic din cultura celulară și identificarea acestuia în RN sau RIF; 2) detectarea antigenului virusului RTI în materialul patologic RIF; 3) detectarea anticorpilor în serul sanguin al animalelor bolnave și recuperate (diagnostic retrospectiv) în RN sau RNHA. Pentru diagnosticul de laborator al IRT, se utilizează un set de diagnostice pentru rinotraheita infecțioasă a bovinelor și un set de diagnostice eritrocitare pentru serodiagnosticul IRT la bovine în RNGA.

Diagnosticul rinotraheitei infecțioase se realizează în paralel cu studiul materialului pentru paragripa (PG-3), adenovirus (1 și 11), infecții respiratorii sincițiale și diaree virală. Schema de diagnosticare de laborator a IRT este similară cu cea utilizată în diagnosticul infecției cu adenovirus.

Un diagnostic preliminar al rinotraheitei infecțioase bovine se face pe baza rezultatelor pozitive ale detectării antigenului în materialul patologic al RIF, luând în considerare datele epizootologice și clinice, precum și modificările patologice.

Diagnosticul final se face pe baza coincidentei rezultatelor RIF cu izolarea si identificarea virusului; coincidența rezultatelor RIF cu detectarea anticorpilor în 30% sau mai mult din probele secundare de ser în titruri nu mai mici de 1:2 în RN și 1:16 în RNGA și detectarea unei creșteri de 4 ori sau mai mult a titrului de anticorpi în probe de ser pereche. Un diagnostic preliminar se face în laboratoarele veterinare în 2-3 zile, cel final - în 15-30 de zile.

Izolarea virusului. Colectarea si pregatirea materialului. Materialul patologic prelevat în primele 2-3 zile de boală este trimis la laborator cu un tablou clinic pronunțat al bolii sau în scop de diagnostic direct la sacrificare de la animalele cu stadiu acut al bolii.

Se prelevează 15-20 de probe de la animale bolnave: tampoane din membrana mucoasă a cavității nazale, ochi, vagin, prepuț, probe de spermă. Pentru spalaturi se folosesc tampoane sterile din tifon de bumbac; tampoanele din cavitatea prepuțială și materialul seminal sunt prelevate în conformitate cu Ghidurile pentru prelevarea, transportul și pregătirea pentru examinarea virologică a materialului seminal și tampoane din cavitatea prepuțială a taurilor; probe de sange, nu mai putin de 5 ml, se obtin in primele 3 zile de boala si dupa 3 saptamani de la aceleasi animale in eprubete sterile. Tampoanele cu materialul sunt plasate în flacoane sterile cu penicilină sau eprubete cu 2-3 ml de soluție salină sterilă sau soluție Hank care conține 500 până la 1000 UI/ml de antibiotice (kanamicină, monomicină, neomicină, penicilină, streptomicina etc.).

După coagularea sângelui, se drenează steril 2-3 ml de ser iar acesta din urmă este livrat la laborator.

De la animale ucise în scopuri de diagnostic, bucăți de plămâni cu o bronhie (la granița zonelor afectate și sănătoase), spline, ganglioni limfatici mediastinali, bronșici și mezenterici, amigdale, zone afectate ale membranelor mucoase ale cavităților nazale și bucale, traheea, tractul gastro-intestinal, precum și o probă de sânge, de la fetuși avortați - bucăți de organe parenchimatoase. Bucățile de material cu o greutate de până la 20 g se pun într-un recipient steril.

Conservarea materialului patologic, livrarea la laborator și pregătirea acestuia pentru examinare sunt aceleași ca și în diagnosticul infecției cu adenovirus.

Probele de material seminal pot fi păstrate la minus 20 °C timp de cel mult 5 zile înainte de testare. Spermatozoizii sunt examinați în 24 de ore după decongelare. Se diluează 1:10 cu un mediu nutritiv pentru cultura celulară cu adaos de antibiotice adecvate (500 UI la 1 ml), se îngheață de 2-3 ori la minus 30 ° C, se dezgheță la 37 ° C, se centrifugă la 2000 rpm timp de 10 minute . Supernatantul este utilizat pentru a infecta cultura celulară. Infecția culturilor celulare. Tehnica sa este similară cu cea din diagnosticul infecției cu adenovirus. Un izolat este considerat izolat dacă provoacă un efect citopatogen stabil de același tip în cel puțin trei pasaje consecutive. În acest caz, identificarea sa ulterioară în vehiculul de lansare este posibilă. Efectul citopatogenic al virusului IRT în cultura celulară se caracterizează prin formarea de ferestre în monostrat, rotunjirea celulelor, acumularea lor sub formă de „clusters” cu exfolierea lor ulterioară de pe suprafața sticlei.

Infecția animalelor. Se fac foarte rar pentru a identifica virusul rinotraheitei infecțioase. La vițeii de 6-8 luni, material patologic este injectat intranazal în vagin, sub piele și aplicat pe conjunctivă. Dacă în materialul de testat există un virus, animalele infectate dezvoltă rinotraheită cu conjunctivită. De la vițeii bolnavi, virusul este izolat în principal din traheea și laringele afectate. Animalele infectate dezvoltă simptome similare cu cele observate în cursul natural al bolii. Primele semne clinice ale bolii apar la 20 de ore de la infectare si se inregistreaza la 7-10 zile. Vițeii infectați se recuperează de obicei și rămân purtători de virus.

Este posibil să izolați virusul din cavitatea nazală, vagin și conjunctivă din a 5-a până în a 10-a zi și a anticorpilor neutralizanți - din a 5-a până la a 8-a zi după infectare. Un titru de anticorpi mai mare este observat după 35 de zile, apoi începe un declin lent.

S-a stabilit că cantitatea maximă de virus este eliberată în timpul creșterii temperaturii corpului în a 4-7-a zi de boală și durează până la 10-14 zile.

Indicarea și identificarea virusului. Detectarea corpurilor de incluziune specifice. În nucleele celulelor epiteliale ale membranelor mucoase afectate ale cavității nazale, vulvei, vaginului și conjunctivei se găsesc corpi de incluziune specifici. La 18-20 de ore de la infectare, acestea pot fi detectate și în celulele unei culturi de țesuturi infectate colorate cu hematoxilin-eozină. Biotest.

Identificarea serologică

RECIF. Tehnica de stabilire a acestuia este aceeași ca și în diagnosticul infecției cu adenovirus la bovine. Acordați atenție strălucirii antigenului în citoplasmă și zona perinucleară a celulelor intacte. Fluorescența verde strălucitor sub formă de granule sau luminiscența difuză a citoplasmei în cel puțin 10% din celule ne permite să evaluăm medicamentul ca pozitiv. Un diagnostic preliminar se face în prezența a cel puțin 30% dintre medicamentele pozitive din numărul total de probe examinate. În frotiurile din vagin și conjunctivă s-a observat fluorescența specifică după 24 de ore, din prepuț - după 48 de ore, din nas și trahee - la 72 de ore după infectare. Prezența unui antigen specific poate fi confirmată prin infectarea unei culturi de celule de rinichi de vițel, în care este detectată o fluorescență citoplasmatică perinucleară și difuză specifică caracteristică infecției cu rinotraheită. Utilizarea unei culturi de celule de rinichi de iepure vă permite să scăpați de luminescența nespecifică.

Acordul dintre rezultatele RIF și modificările histopatologice este de 87%, iar cel al studiilor de imunofluorescență și virologice este de 44%. Într-un studiu paralel al serurilor din RN și RIGA, rezultatele au coincis în 94% din cazuri.

În teren, RIF-ul s-a dovedit a fi pozitiv în 18,5%, iar metoda de izolare a virusului - în 15,9% din cazuri.

Astfel, RIF poate fi utilizat pentru diagnosticarea rapidă a IRT cu confirmarea ulterioară a diagnosticului prin metode virologice.

RN.În prezența CPE în culturile celulare infectate cu izolatul și cu nmunofluorescență pozitivă, se realizează tiparea finală a virusului în RN. Înainte de fixarea acestuia, serurile specifice și negative sunt diluate într-un raport de 1:10 cu soluție Hank sau cu un mediu nutritiv pentru cultura de celule care conțin angiotice și încălzite într-o baie de apă timp de 30 de minute la 56 °C. pH-ul este stabilit prin metoda convențională în cultura primară de PEC sau linia celulară transplantată MDVK.

Rezultatele RN sunt luate în considerare de CPP-ul virusului, pentru care titrul izolatului tipizat este determinat în prezența serurilor specifice și negative (de control). Titrul este calculat conform metodei Reed și Mench și exprimat în lg TCD 50/ml.

Apoi indicele de neutralizare (I) este calculat folosind formula I \u003d T 1: T 2,

unde T1 este titrul izolatului în prezenţa serului martor; T 2 - titrul izolatului în prezența serului specific.

Apartenența de specie a izolatului este determinată atunci când diferența de titruri de virus este de cel puțin 2 lg. Când indicele de neutralizare este de la 1 lg la 2 lg, reacția este considerată îndoielnică, caz în care se repetă. Un indice de neutralizare mai mic de 1 lg este considerat negativ. Dacă rezultatele pH-ului sunt pozitive, izolatul este considerat pe deplin identificat.

Prepararea serului hiperimun pentru ROP. Serul de neutralizare a virusului hiperimun se prepară după următoarea schemă: 1 ml de virus de cultură cu adjuvant Freund se administrează subcutanat la iepuri, urmat de trei injecții intravenoase ale virusului în volum de 1 ml cu un interval de 7 zile. La 10 zile de la ultima inoculare a virusului, iepurii se sângerează, serul este congelat și păstrat la minus 30 °C.

RTGA. Au pus-o prin metoda micro la 4°C cu o suspensie 0,5 - 1% de eritrocite de șoareci albi, diluantul este soluție tampon Tris cu albumină serică bovină 0,2%. Ca antigen se folosește un lichid vaccinat în cultură, care se concentrează cu PEG-6000 sau prin ultracentrifugare.

După detectarea unui agent hemaglutinant, determinarea titrului său hemaglutinant, se prepară 4 HAU și se identifică în RTGA cu un ser pozitiv de referință.

Identificarea imunoenzimatică a virusului. Metoda imunoperoxidazei poate fi utilizată pentru a studia in vivo frotiuri-amprente nosofaringiene în celulele obținute din plămâni.

În plus, este recomandată o metodă indirectă de imunoperoxidază anticolementară (NAIP) pentru identificarea de laborator a virusului RTI. Tehnica este următoarea: pe lame de acoperire, în eprubete, se prepară o cultură celulară sensibilă la virusul IRT (PEC, TB etc.) după metoda general acceptată. Monostratul este infectat cu virusul de testare. După 48 de ore, lamele cu celule infectate sunt îndepărtate, spălate într-o soluție tampon fosfat cu un pH de 7,2-7,4 și fixate în acetonă răcită timp de 5-10 minute.

Se aplică 1-2 picături dintr-un amestec de ser imun specific și complement de cobai la o diluție de 1:10 pe un monostrat de celule fixe. Înainte de muncă, serurile antivirale sunt adsorbite de virusurile heterologe aflate în studiu, t. primesc monoseruri. La prelucrarea preparatelor de control, pe monostrat se aplică un amestec de complement și ser normal.

Preparatele sunt incubate într-o cameră umedă la 37 °C timp de 40-60 minute, apoi spălate cu apă curentă timp de 5-10 minute, ușor uscate și tratate cu ser anticomplementar marcat cu peroxidază (1-2 picături), diluat în prealabil 1: 20 cu tampon fosfat și plasați din nou medicamentul timp de 40-60 de minute într-o cameră umedă la 37 ° C. Apoi se spală, se usucă, iar pentru detectarea complexului format (antigenan-titel-peroxidază) se aplică un reactiv benzidină (se adaugă după filtrare 50 mg benzidină în 100 ml tampon Tris-HCl cu pH 6,8). la preparat timp de 40-60 min.7 picaturi de peroxid de hidrogen 3% la fiecare 5 ml solutie de lucru). Medicamentul se păstrează într-o cameră umedă, se spală în apă distilată, se usucă, se montează pe o lamă de sticlă și se studiază la microscop cu lumină sub o lentilă de imersie.

Cu microscopia cu lumină, metoda imunoperoxidazei indirecte anticomplementare oferă o detecție clară a antigenului viral în citoplasma celulelor infectate sub formă de colorate în culoarea maro formațiuni care sunt vizibile la o mărire de 140 de ori.

Specificitatea indicatorilor obținuți prin această metodă este confirmată de stabilirea unor controale imunologice speciale. La stabilirea unei reacții imunoperoxidazei încrucișate cu anticorpi heterologi, această reacție are un caracter specific speciei pronunțat: antigenul reacționează numai cu serul omolog. Peroxidaza endogenă nu a fost detectată în cultura de celule PEC și LF.

Metoda imunoperoxidazei indirecte anticomplementare este promițătoare în diagnosticul infecțiilor virale respiratorii acute la bovine.

Când se utilizează metoda imunoperoxidazei pentru a indica virusul RTI în cultura de celule PEC, antigenul este detectat la 18, 22 de ore după infectare. Cele trei metode serologice directe pentru depistarea rapidă a antigenelor virale (RIF, imunoperoxidază și ELISA) sunt la fel de aplicabile pentru detectarea virusului în timpul febrei, dar nu și în stadiile avansate ale bolii.

Antigenul viral este detectat în tampoane nazale prin ELISA din zilele 3 până la 10 după infectare. In spalarile conjunctivale se depista in a 5-a zi.

Identificarevirus RTI prin analiza de restricție a ADN-ului viral. Este descrisă o metodă de donare a fragmentelor genomului virusului RTI și izolarea și caracterizarea unei sonde ADN recombinant, care face posibilă detectarea virusului în probe clinice. Folosind metoda de hibridizare dot-blot, ADN-ul virusului IRT a fost detectat în probe de material seminal obținut de la animale seropozitive, când izolarea virusului în cultura celulară a dat un rezultat negativ. Un rezultat bun a fost obținut și folosind culturi de celule infectate.

Serodiagnostic și diagnostic retrospectiv. Anticorpii împotriva virusului RTI pot fi detectați în serurile de sânge ale animalelor bolnave și recuperate din RN, RNGA etc. Pentru a face un diagnostic retrospectiv, se folosesc probe de ser pereche prelevate la intervale de 3 săptămâni. Rezultatul serodiagnosticului este luat în considerare de creșterea titrului de anticorpi în probele de ser pereche, precum și de numărul de animale seropozitive la un interval specificat. Înainte de studiu, serurile sunt încălzite într-o baie de apă la o temperatură de 56 ° C timp de 30 de minute.

RN. Se stabilește prin metoda de diluare a serurilor de testare cu o doză constantă de virus într-o cultură celulară de „PEK sau TB. Virusul este pretitrat în cultură celulară. Pentru aceasta, virusul RTI uscat din trusa de diagnosticare este diluat steril în volumul indicat pe etichetă, iar din acesta se prepară diluții de zece ori de la 10 - 1 la 10 -6 pe mediu nutritiv (titrul final de virus uscat este indicat pe etichetă).

Se prepară diluția într-un volum total de 5 ml, apoi se infectează 4 eprubete cu cultură celulară spălată în prealabil din mediul de creștere cu fiecare diluție a virusului în volum de 1 ml. Culturile de celule infectate și martor (4-6) sunt incubate la 37°C, CPP-ul virusului este numărat zilnic, în final, în ziua a 5-a-7.

Titrul virusului este considerat inversul celei mai mari diluții, care provoacă CPP în 50% din culturile celulare, care este calculat prin metoda Reed și Mench sau Kerber și exprimat în TCD 50 / ml. Titlurile 1:32, 1:64 sunt rareori găsite. În efectivele nefavorabile pentru această boală, VNA sunt detectate la 12% dintre bovinele clinic sănătoase. Un diagnostic retrospectiv pentru IRG se face cu o creștere de 4 ori sau mai mult a AT în probele de ser ale convalescenților. În prezent, micrometoda pH-ului este utilizată pe scară largă.

RNGA. Industria biologică a țării noastre produce diagnosticul eritrocitar. RNHA este plasat conform instrucțiunilor în micropanouri cu godeuri în formă de U ale truselor de microtitrare Takachi sau Titertek conform metodei general acceptate. Rezultatele RNGA cu serurile utilizate sunt evaluate prin titruri; pozitiv - 1:16 și mai sus, îndoielnic - 1:8, negativ - 1:4, 1:2 și zero. O creștere a titrurilor de anticorpi în serurile pereche de 2-4 ori indică prezența infecției. Folosind RNGA, este posibil să detectați AT în mai multe perioada timpurie infecție decât cu ROP. Corespondența rezultatelor RNGA și RN a fost stabilită în 95% din cazuri. Folosind această reacție, este mai ușor și mai rapid decât RN să efectueze tiparea anticorpilor împotriva virusului RTI. Titrurile AT au fost de 7-10 ori mai mari decât cele detectate în RN.

RDP. Nu și-a găsit aplicație largă în practica diagnosticului, cercetătorii recomandă utilizarea lui pentru serodiagnosticul RTI. Prin prezența PA, se poate prinde o infecție recentă, în timp ce VNA circulă în organism pentru o lungă perioadă de timp, iar boala poate fi prinsă de seruri pereche. Dacă este detectată PA, este mai bine să luați sânge în a 8-a și următoarele zile de boală.

RTGA. Poate fi folosit pentru a detecta și cuantifica virusul AT la RTI. Titrul anti-HA se corelează cu titrul VNA. Un rezultat pozitiv RTGA deja în prima diluție de ser (1:4) indică prezența AT la virusul IRG în această probă de ser. O creștere de 4 ori sau mai mult a titrurilor anti-HA în probele de ser pereche este un indicator al infecției active.

ELISA. Folosit pe scară largă în Țările de Jos, SUA, Marea Britanie, Suedia, țările fostei URSS. S-a dovedit a fi potrivit pentru detectarea virusului AT la IRG în lapte. Pentru a face acest lucru, este suficient să obțineți mostre de lapte amestecat de la 5-10 vaci. AT se determină după concentrarea prealabilă a Ig în ele. Coincidența acestor reacții serologice în probele de ser sanguin și lapte a fost de 92,8%. Folosind această metodă, este posibil să se determine rapid starea imunologică a efectivelor de vaci care alăptează din întreaga regiune, precum și să se efectueze un studiu asupra animalelor exportate și importate. În Germania, metoda TRACHITEST a fost dezvoltată și este utilizată pentru ELISA a probelor de lapte colectat din pori, în scopul de a diagnostica purtătorii latenți de virus.

O metodă indirectă IgM-ELISA a fost propusă pentru a detecta infecția recentă cu RTI. IgM timpuriu AT izolat în a 6-a zi după infecție, până în a 9-a zi a existat o creștere a titrului de AT Ig, iar până în a 13-a zi - VNA. La vițeii vaccinați cu vaccin inactivat, nu a existat un răspuns imun precoce - AT IgM nu au fost detectate, iar IgM și VNA au apărut mai târziu decât după infectare. Cu toate acestea, trebuie avut în vedere faptul că prezența factorului reumatoid în serul bovinelor poate duce la rezultate fals pozitive de diagnostic în IgM-ELISA. În acest caz, pretratarea probelor de ser cu IgM anti-bovine evită rezultatele fals pozitive. Testul IgM-ELISA este de mare valoare în diagnosticul IRT, în special la animalele tinere. În grupul probelor de ser pozitive, corelația dintre ELISA și RNHA a fost de 98,3%, iar EL1SA cu IF a fost de 95,7%.

ELISAfolosind monAT. Bazat pe competiția dintre serul bovin AT și neutralizarea mAbs de șoarece. Pentru implementarea acesteia, godeurile panourilor de microtitrare sunt tratate cu virus RTI purificat, iar după uscare pot fi folosite imediat sau depozitate la -20°C. Ser de testare nediluat, mAb-uri specifici virusului IRT conjugați cu peroxidază, substrat de peroxidază sunt introduse secvenţial în godeurile panourilor tratate cu virus. Rezultatele reacției sunt luate în considerare în spectrofotometrul la A405. În cazul unei reacții pozitive, legarea mAb este inhibată de AT seric. Metoda s-a dovedit a fi mult mai sensibilă și mai specifică decât ROP.

Diagnosticul de laborator infecție cu rotavirus bovine

Infecția cu rotavirus (RVI) a bovinelor (diareea vițeilor nou-născuți) este o boală acută contagioasă a vițeilor nou-născuți, caracterizată prin leziuni ale tractului gastrointestinal. Boala este răspândită în toate regiunile geografice ale globului. Practic a fost înregistrat peste tot unde s-a efectuat cercetarea. S-a dovedit răspândirea largă a rotavirusurilor (RV) la viței printre animale tipuri diferiteși prezența anticorpilor la rozătoare (cobai, șobolani, hamsteri, șoareci).

Pe baza datelor epizootologice, clinice și anatomopatologice se face un diagnostic preliminar, cel final se stabilește numai prin metode de laborator. Acestea din urmă se bazează pe detectarea unui virus sau AG viral în fecalele vițeilor bolnavi, conținutul intestinal și celulele mucoasei. intestinul subtire animale moarte și sacrificate forțat, precum și cu privire la detectarea anticorpilor împotriva RV în serurile de sânge ale vițeilor bolnavi și recuperați și în serurile de sânge și colostrul vacilor mame.

Metode de diagnostic expres. A fost dezvoltat un sistem de testare ELISA bazat pe RV porcină pentru detectarea AH specifică în RV bovină, care are sensibilitate și specificitate ridicate. Este recomandabil să-l folosești în laborator pentru diagnosticare expresă. Deoarece polipeptida VP5 conține un grup încrucișat AG localizat într-un domeniu conservat, care este comun tuturor RV-urilor din grupa A. S-a demonstrat posibilitatea de a indica rota- și coronavirusuri prin metoda sondelor fluorescente și a anticorpilor împotriva acestora. Se bazează pe înregistrarea etapelor incipiente ale interacțiunii virusurilor cu receptorii celulari.

Izolarea virusului. Cel puțin 10 probe de fecale lichide, intestin subțire cu conținut (nu mai târziu de 2-3 ore de la moartea sau sacrificarea forțată a vițeilor), 10-15 probe de seruri pereche de animale bolnave și recuperate, 6-10 probe de ser sanguin de vaci sunt trimise la laborator pentru cercetare si 6-10 probe de colostru. Cu cea mai mare constanță, virusul poate fi detectat în probele de fecale prelevate în primele zile de boală, prin urmare, fecalele prelevate de la viței de 2-14 zile cu semne clinice de diaree în a 1-3 zi de boală sunt potrivite pentru cercetare. Imediat după livrarea la laborator, probele sunt prelucrate sau depozitate la 4°C cel mult o zi, la -20-50°C până la 1 lună. Serurile de sânge se păstrează la 4-10°C cel mult 1 săptămână, la -20°C până la 1 lună; colostru - la 4°C nu mai mult de 2 zile, la -20°C - până la 1 lună. Pentru studii virologice sau microscopice electronice, se prepară o suspensie 10% de fecale în soluția lui Hank. Suspensia este omogenizata si centrifugata timp de 1 ora la 3 mii rpm, supernatantul este transferat intr-un flacon steril, se adauga penicilina si streptomicina (1000 U/ml fiecare), se pastreaza 10-12 ore (peste noapte) la 4°C si examinat.

Izolarea RS în cultura celulară. S-a demonstrat o corelație între boala vițeilor nou-născuți cu diaree și prezența RV AG în fecale. Trebuie avut în vedere faptul că virusul nu este cultivat prin metode convenționale, iar utilizarea unor efecte suplimentare - chimice (tripsină) și fizice (centrifugarea virusului pe un strat de celule) - dă rezultate pozitive la concentrații mari de virus. în fecale, care este verificată prin microscopie electronică. Pentru a face acest lucru, conținutul unui tub după congelare și decongelare și tratamentul cu polietilen glicol este resuspendat în 0,1 ml de apă distilată și examinat în microscop electronic. Într-un caz pozitiv, sunt găsite particule tipice RV și acumulările lor. Natura specifică a particulelor este confirmată de microscopia imunoelectronică.

Indicarea și identificarea virusului. EM și IEM. Metoda de microscopie electronică (EM) a unei suspensii de virus din partea lichidă a fecalelor este cea mai utilizată pentru a diagnostica infecția atunci când concentrația virusului în fecale nu este mai mică de 104-105 particule/ml de lichid. Preparatele se prepară din partea lichidă a fecalelor limpezite prin centrifugare joasă.Totuși, cele mai bune preparate se obțin prin diluarea fecalelor cu apă distilată 1:1-1:10 și limpezirea ulterioară a suspensiei prin centrifugare la 4-10 mii. rpm timp de 15 minute. O metodă simplă de preparare a preparatelor din fecale, care nu este inferioară ca sensibilitate la ultracentrifugare, este următoarea. La 4 ml din partea lichidă a fecalelor limpezite prin centrifugare joasă, se adaugă 60% dintr-o soluție saturată de (NH 4) 2 SO 4, se amestecă, se lasă timp de 1 oră la 4 ° C și apoi se centrifughează timp de 10 minute la 10.000 rpm. Supernatantul se scurge, iar precipitatul este resuspendat în 4 picături de apă distilată și se prepară preparate. Există diverse moduri și modificări de preparare a preparatelor din. Metoda prin picurare este cea mai utilizată. Este mai convenabil să utilizați IEM. Pentru aceasta se pot folosi seruri de la animale de laborator (iepuri, cobai), maimute imunizate cu RV sau seruri de la convalescenti. Conținutul și specificitatea anticorpilor din serurile convalescenților pot fi verificate în reacțiile serologice folosind virusul SA 11. Când o suspensie fecală este tratată cu ser imun, specificitatea acestora este stabilită simultan cu detectarea particulelor tipice de VD, așa cum este indicat de identificarea agregatelor în care particulele RV sunt legate de imunoglobuline specifice. Cel mai des sunt utilizate trei modificări ale microscopiei imunoelectronice.

Cu un rezultat pozitiv, particulele RV sunt detectate în preparate sub formă de acumulări specifice (complexe imune). Specificitatea reacției este evaluată prin numărarea numărului și mărimii unor astfel de clustere, precum și prin gradul de acoperire a virionilor individuali cu AT seric. Severitatea acestui efect cu o anumită abilitate poate fi evaluată pe o scară de unități convenționale de la 0 la 4 plus.

DACĂ. Metodele directe și indirecte au fost utilizate cu succes pentru a detecta AG viral în secțiunile congelate ale intestinului subțire, frotiurile fecale și cultura celulară. În studiul criosecțiilor intestinului și frotiurilor din fecalele vițeilor, cele mai bune rezultate se obțin în 4-6 ore de la detectarea semnelor de diaree. Celulele epiteliale se descuamează rapid de pe suprafața vilozităților intestinale și sunt îndepărtate cu materii fecale. Cel mai adesea, o suspensie fecală infectează o cultură celulară și identifică AG viral în reacția IF. A fost dezvoltată o metodă directă de IF în celulele MDV infectate cu cultură sau material viral fecal. Recomandările metodologice pentru indicarea RV la bovine prin metoda IF indirectă prevăd utilizarea unei truse de diagnostic care include un antigen specific - o suspensie de celule PEC sau MA-104 care conține virusul de cultură; AH normal - suspensie de celule neinfectate PEC sau MA-104; ser specific obţinut prin hiperimunizarea viţeilor, animalelor de laborator; ser normal de la bovine sănătoase, care nu conține anticorpi împotriva RV; ser antispecie împotriva globulinelor bovine conjugate cu FITC (produs de Institutul de Epidemiologie și Microbiologie numit după N.F. Gamaleya). NIF poate fi utilizat pentru a detecta și identifica RV AG în culturi de celule infectate, fecale și intestine ale vițeilor bolnavi și morți pentru a detecta și cuantifica anticorpii împotriva RV.

RDP. Aceasta este o metodă simplă și accesibilă pentru detectarea RV AG în fecalele vițeilor bolnavi, conținutul intestinal și suspensia mucoasei intestinale a vițeilor morți sau sacrificați forțat. Pentru a face acest lucru, o suspensie de 20% de fecale într-o soluție salină tamponată cu fosfat este încălzită într-o baie de apă la 37 ° C timp de 30 de minute, amestecând ocazional. Apoi centrifugați timp de 15 minute la 8000 g. Supernatantul este filtrat printr-un filtru Millipore și filtratul este concentrat de 25 de ori folosind un concentrator de dializă. Ca rezultat al tuturor etapelor de prelucrare, 0,2 ml de concentrat corespunde la 1 g de materie primă fecală. Sursa de anticorpi specifici sunt serurile convalescentelor dupa gastroenterita cu rotavirus, testate anterior in alte teste serologice.

RDP se efectuează într-un gel de agaroză pe plăci de sticlă de 0,9% agaroză într-o soluție tampon care conține 0,1 M NaCI, 0,01 M tris(hidroximetil)-aminometan și 0,001 M etilendiaminotetraacetat. Componentele de reacție sunt plasate în godeuri cu diametrul de 3 mm tăiate în stratul de agaroză, distanțate la 3 mm. Plăcile de gel se păstrează peste noapte la temperatura camerei, după care se iau în considerare rezultatele. Între godeurile cu AG și AT în cazuri pozitive, se formează o linie clară de precipitare. În RDP, se testează AG - partea lichidă a fecalelor sau a supernatantului după centrifugarea unei suspensii de fecale sau intestine, serul de testat de la viței recuperați, colostru și lapte în forma sa naturală (sub formă de zer) după tratament cu cheag.

Reacția de imunoprecipitare cu colorarea precipitatelor cu anticorpi fluorescenți poate fi utilizată pentru detectarea în fecale a RV uman și diareea vițelului RV. Modificarea sa accelerată a fost dezvoltată. Diagnosticul, incluzând AG specific și normal, ser specific, este preparat conform metodei VIEV, iar serul fetal sau serul vițeilor fără viței este utilizat ca ser normal. Reacția este evaluată prin formarea liniilor caracteristice ale precipitatului.

RSK. Pentru a detecta hipertensiunea arterială, este utilizat mai rar decât alte metode. Este mai puțin sensibil decât microscopia electronică și RIF, mai des dă rezultate fals pozitive datorită anticomplementarității multor probe de fecale. Cu toate acestea, atunci când procesează fecale cu complement, ser fetal, freon, purificare PEG 6000 sau ultracentrifugare, RSK nu este inferioară sensibilității la microscopia electronică. Reacția se stabilește printr-o micrometodă cu ser specific sau ser de viței recent recuperați, lipsit de anticorpi împotriva altor virusuri.

WEEF.În timpul acestei reacții, se formează o linie de precipitare între AG care se deplasează spre anod și AT care se deplasează către catod. Calitatea și puritatea agarozei este un factor major în obținerea unor rezultate reproductibile. Majoritatea cercetătorilor cred că acest test este la fel de bun sau chiar superior microscopia electronică.

VIEF a fost propus pentru detectarea RV în fecale și material patologic și pentru detectarea anticorpilor în serurile sanguine. Pentru cercetare, luați partea lichidă a fecalelor. Dacă nu este suficient să studiezi partea lichidă, probele fecale sunt centrifugate timp de 10-15 minute la 4 mii rpm la 4-10°C. Examinați supernatantul. Intestinele se zdrobesc fin, se adauga un volum egal de solutie fiziologica, apoi se omogenizeaza in mojar si sticla, se centrifugheaza 10-15 minute la 2 mii rpm la 4-10°C. Supernatantul este utilizat în reacție. VIEF pune în soluție 0,85% de agaroză, preparată în tampon veronal-medinal 0,5 M (pH 8,6).

ELISDAR. Sensibilitatea este mai mare decât EI, IF, RSK, VIEF. Poate fi folosit în versiuni directe și indirecte, precum și pe latex. Cu ajutorul ELISA, este posibil să se detecteze RS în fecalele vițeilor prin diluarea probei de testat până la 1:5000. Este descrisă un ELISA în fază solidă pentru tiparea și subgruparea RV-urilor umane și animale. Pentru aceasta, se utilizează IgG la o concentrație de 5 μg/ml; diluarea antiserului de iepure la IgG bovină până la 1:400. Durata incubării IgG - 4 ore, reacția antiserului RV cu IgG - 3 ore, reacția antiserului la RV cu complex IgG - RV AG - 16 ore, pentru conectarea cu conjugat - 4 ore, pentru schimbarea culorii substratului (P -nitrofenil fosfat) - 10 min. Înainte de studiu, fecalele vițeilor sunt diluate de 4 ori cu o soluție tampon fosfat, limpezite prin centrifugare și tratate cu un amestec de Tween-20 cu azidă de sodiu. Indicațiile ELISA în 100% din cazuri coincid cu rezultatele microscopiei electronice.

A fost dezvoltat un sistem de testare ELISA bazat pe RV porcină pentru detectarea AH specifică în RV bovină, care are sensibilitate și specificitate ridicate. În Federația Rusă, a fost dezvoltat un diagnostic de imunotest enzimatic, produs de VIEV. Trusa include: RV AG specific liofilizat - o suspensie care contine virus obtinuta pe o cultura de celule MA-104, concentrata cu PEG 6000 si centrifugata la 6000g, AG martor, ser anti-rotavirus specific liofilizat obtinut prin hiperimunizarea vitelilor sau iepurilor cu un virus purificat într-un gradient de densitate a clorurii de rubidiu; imunoglobuline uscate izolate din serul anti-rotavirus hiperimun prin sărare cu soluție saturată (NH4)2S04 urmată de cromatografie cu schimb ionic pe o coloană cu DEAE-celuloză.

Există o serie de alte metode de detectare a RV AG în fecalele vițeilor cu diaree: reacția de hemaglutinare pasivă inversă, metoda imunoagregate GA, testul de aglutinare latex, etc. a fost propus ser de iepure pentru RV vițel. Metoda se bazează pe detectarea stafilococului aglutinant RS într-o suspensie de 10% de probe fecale pe lame de sticlă cu Staphylococcus aureus încărcat cu RS AT. Stafilococii tratați cu ser de iepure non-imun servesc drept control. Aglutinarea este vizibilă la microscop în 2-3 minute după balansarea circulară a sticlei. Pentru a evita reacțiile nespecifice, se efectuează pretratarea probelor fecale prin încălzire, filtrare și N-acetilcisteină. O astfel de prelucrare nu reduce specificul metodei. În comparație cu ELISA, această metodă s-a dovedit a fi mai sensibilă; Avantajele sale sunt viteza, simplitatea și costul redus, ceea ce este foarte important pentru screening-ul unui număr mare de probe de fecale.

Metoda de aglutinare a latexului cu ajutorul trusei comerciale Rotalex pentru detectarea RV în fecalele pacienților este la fel de specifică și sensibilă ca și metodele de microscopie electronică, IF și ELISA. Pentru diferențierea subgrupurilor și serotipurilor izolatelor RV, este descrisă o metodă de hibridizare a acizilor nucleici, electroforeză în PAGE a ARN-ului virion al virusurilor. Metoda de hibridizare punctuală este foarte specifică, detectează 8 ng de ARN viral și este de 10-100 de ori mai sensibilă decât ELISA.

Identificarea variantei folosind mAT. Primit MONAT la buc. RIT4237 (serotip I) bovină RV. Neutralizarea AG a relevat specificitatea variabilă pentru determinanții de grup și subgrup. Utilizarea mAbs împotriva hipertensiunii subgrupelor în ELISA a relevat dominanța serotipului II uman RV în probele de scaun ale copiilor bolnavi. Prezența unor astfel de anticorpi crește sensibilitatea și specificitatea sistemelor de testare.

Serodiagnostic și diagnostic retrospectiv. Testarea serologică a serurilor de sânge de vițel are o valoare foarte limitată. În primele săptămâni de viață, nu este posibil să se detecteze o creștere a AT, în ciuda bolii anterioare. Nivelul anticorpilor umorali la animalele adulte nu permite prezicerea apariției unei epizootii în turmă.

RSK. Pentru diagnosticul RVI, a fost demonstrată posibilitatea de a seta RSC cu seruri pereche ale animalelor recuperate. În primele zile ale bolii, CSA este absent la majoritatea animalelor. Până în a 7-10-a zi, nivelul lor crește, atingând un maxim până în a 21-a zi, apoi are loc o scădere, iar în a 30-35-a zi titrul KSA ajunge la zero. RSC este pus prin metoda general acceptată în micro- și macro-volume.

RTGA. Setat conform metodei standard utilizate de laboratoarele de diagnostic virologic. Utilizați eprubete din sticlă și volume regulate de reactivi sau panouri de plastic de unică folosință cu godeuri și microvolume de reactivi. Pentru a stabili reacția, se folosesc eritrocite umane din grupa O sau eritrocite de cobai. Serurile de testat sunt tratate cu caolin și masă de eritrocite (acesta din urmă când se utilizează eritrocite umane). Toate diluțiile sunt preparate în soluție salină fiziologică cu adăugare de albumină serică bovină 0,04%.

Metoda indirectă IF, RN, radioimunotest stabilite după metode general acceptate.

Diagnostic diferentiat. RVI la vițeii nou-născuți trebuie diferențiat de infecția cu coronavirus, colibaciloză. Este necesar să se excludă dispepsia vițeilor nou-născuți de origine alimentară. Pentru titrarea virusurilor din grupa A s-au dezvoltat metode de hibridizare punct și blot a ARN cu sonde pentru ADN-ul segmentului genomic 4, obținute prin amplificarea PCR a regiunilor hiperdivergente ale genei proteinei VP4 (nucleotidele 211-686) la ADN-ul buc. . IR, IND, NCDV și Cr folosind primeri oligonucleotidici. Sondele 3 sunt specifice de tip (VP4) și nu reacționează încrucișat cu ARN-urile cu 2 catene ale tipurilor P heterologe ale RV.

Diagnosticul de laboratordiaree virală

bovine

Diaree virală - boala mucoaselor (VD-BS) - o boală infecțioasă contagioasă a bovinelor, în principal animale tinere, caracterizată prin inflamație erozivă și ulcerativă a membranelor mucoase ale tractului digestiv, rinită, ganglioni limfatici umflați, febră mare, generală depresie, leucopenie, diaree persistentă sau intermitentă, stomatită erozivă și ulcerativă salivație abundentă, apariția ieșirilor mucopurulente din cavitatea nazală. Vacile pot face avorturi. Pentru prima dată, ca boală independentă, VD-BS a fost identificată în statul New York (SUA) în 1946 în timpul unui focar de boală acută, adesea fatală a bovinelor, caracterizată prin diaree și leziuni erozive ale tractului gastro-intestinal. În prezent, VD-VD este răspândit pe teritoriile multor țări și, împreună cu alte 2 pestivirusuri (virusul MCSF și PBO), infectează 173 de specii de rumegătoare domestice și sălbatice și 11 specii de porci. Există publicații despre detectarea AT și AG a pestivirusului la om, dar posibilitatea infecției este doar presupusă.

Pe baza diferențelor de manifestări clinice, diareea virală și boala mucoasei bovine au fost inițial considerate a fi boli diferite. Mai târziu, pe baza analizei modificărilor patologice, a caracteristicilor epizootologiei și a manifestărilor clinice, aceste două boli au început să fie denumite diaree virală - o boală a membranelor mucoase ale bovinelor. . Deoarece a fost stabilită identitatea agenților cauzali ai acestor boli, aceștia sunt considerați o singură infecție cu manifestări clinice diferite, dezvoltarea predominantă a unui sindrom respirator sau diareic și, prin urmare, boala este mai des numită diaree virală bovină.

Boala a fost înregistrată în toate țările lumii. În unele state din SUA se găsesc până la 70-90% dintre animalele seropozitive.

Diagnosticul se face pe baza datelor clinice, epidemiologice și a metodelor de cercetare de laborator. Cu toate acestea, datele epizootologice, simptomele bolii și natura modificărilor patologice oferă motive doar pentru a suspecta boala. Întrucât VD-BS seamănă cu multe alte boli (ciumă, stomatita ulceroasă infecțioasă, stomatita fungică, PG-3, limbă ovină, paratuberculoză și intoxicații alimentare), testele de laborator în diagnostic sunt cruciale. Atunci când se face un diagnostic de VD-BS, trebuie luate în considerare următoarele: animalele individuale cu vârsta cuprinsă între 3-36 de luni se îmbolnăvesc, modificările clinice tipice se manifestă prin leziuni ale membranelor mucoase sau diaree sângeroasă cu sau fără eroziunea mucoaselor, toate animalele bolnave mor în câteva zile, la pacienți animalele nu au anticorpi specifici în sânge, deși restul animalelor îi au la titruri mari.

Diagnosticul de laborator VD-BS include: 1) detectarea AH în materialul patologic (frotiuri, amprente, secțiuni) obținut de la animalele bolnave din REEF; 2) excluderea agentului patogen din materialul patologic în cultura de celule TB, PEC sau LEC, identificarea în RN sau RIF; 3) detectarea anticorpilor în serul sanguin al animalelor bolnave și recuperate (diagnosticare retrospectivă) în RSK și ROP.

Diagnosticul de laborator al VD-BS se realizează folosind un set de truse de diagnostic produse de industria biologică. Se realizează în paralel cu studiul materialului pentru PG-3, adenovirus (adeno 1 și 2), MS și IRT.

Un diagnostic preliminar al VD-BS la bovine se face pe baza rezultatelor pozitive ale detectării AH în material patologic în IF și PCR, ținând cont de datele epizootologice și clinice, precum și de modificările patoanatomice. Diagnosticul final se face pe baza: coincidenta rezultatelor IF cu PCR, izolarea si identificarea virusului; coincidența rezultatelor IF cu detectarea AT în 30% sau mai mult din cele doua probe de seruri pereche în titruri nu mai mici de 1:4 în RSK și 1:16 în RN; detectarea unei creșteri de 4 ori sau mai mult a AT în probele de ser pereche. Un diagnostic preliminar se face în laboratoarele veterinare în 2-3 zile, cel final - până la 30 de zile.

Izolarea virusului. Materialul patologic se trimite la laborator de la animale bolnave prelevate în primele 2-3 zile cu simptome severe ale bolii sau de la animale ucise în scop de diagnostic în stadiul acut al bolii. Se prelevează 15-20 de probe din următorul material de la animalele bolnave: tampoane din mucoasa cavității nazale, obținute prin introducerea unui tampon steril din tifon de bumbac sau cauciuc spumos în căile nazale; probe de sânge în primele 3 zile de boală și după 3 săptămâni de la aceleași animale cu respectarea regulilor de asepsie în eprubete sterile de 8-10 ml; răzuire din zonele ulcerate sau erodate ale mucoaselor cavității bucale și oglinzii nazale, luate cu tampoane dure din tifon de bumbac sau cu un bisturiu. Tampoanele cu material rezidual sunt plasate în flacoane sterile de penicilină sau eprubete cu 2-3 ml de soluție fiziologică sterilă sau soluție Hanks care conține 500-1000 UI/ml de antibiotic (kanamicină, monomicină, neomicină, penicilină, streptomicina etc.). După coagulare, 3-4 ml de ser se drenează steril din sânge și se livrează în laborator.

De la animale ucise în scopuri de diagnostic, luați în conformitate cu regulile de asepsie bucăți de plămâni cu o bronhie (la limita zonelor afectate și sănătoase), spline, ganglioni limfatici mediastinali, bronșici și mezenterici, amigdale, zone afectate ale mucoaselor cavităților nazale și bucale, trahee, tract gastrointestinal, precum precum și o probă de sânge. Bucățile de material cu o greutate de până la 20 g se pun într-un recipient steril, bine închis. Este mai ușor să izolați virusul la debutul bolii și în timpul perioadei de exacerbare din sânge, plămâni, diferite părți ale intestinului subțire (în special din celulele membranei mucoase a duodenului, ganglionii limfatici și splina. În cursul cronic al bolii, poate fi izolat în mod regulat din diferite părți ale intestinului, dar nu și din sânge. Studiul tampoanelor nazale și a fecalelor în aceste cazuri dă și rezultate negative, deși în unele cazuri virusul a fost izolat din materiile fecale chiar si la 5 luni de la boala.sodiu sau gelrina si le punem intr-un termos cu gheata.Virusul a fost izolat din sangele animalelor infectate experimental din a 1-14-a zi dupa infectare.A fost izolat si din tesuturile avortate sau fetuși născuți morți, placentă și lichid amniotic.

Infecția culturilor celulare. Virusul este izolat în subculturi primare de celule embrionare bovine (PEK, LEK, SEK) sau TB. Un izolat este considerat izolat dacă determină o CPP stabilă de același tip în cel puțin 2 treceri consecutive. În acest caz, identificarea lui în RN este posibilă. În culturile primare de celule renale embrionare bovine, primele CPI sunt detectate la 2-5 zile după inoculare. Ele se exprimă în apariția unei infiltrații cu granulație fină în celule de tip fibroblastoid. Pe măsură ce infecția progresează, celulele sunt îndepărtate treptat de pe suprafața sticlei, dar unele rămân mult timp, formând insulițe de celule de tip epitelioid. În cele din urmă, pe sticlă rămâne doar o rețea de material granular.

Atunci când se folosesc culturi de celule secundare, modificările citopatice apar aproape simultan în toate celulele monostratului și devin alungite, unghiulare și par împletite. În preparatele colorate ale monostratului celular, în prezența modificărilor citopatice, se detectează vacuolizarea protoplasmei și modificări ale nucleelor, exprimate în contracția membranei, picnoză și cariorexie. În unele cazuri, vacuolizarea este atât de pronunțată încât se observă la microscopie a preparatelor necolorate. Dezvoltarea CPI nu corespunde cu creșterea titrului virusului. La 72-96 ore de la inoculare, când titrurile de virus ating un maxim (10 5,5 -10 6,5 TCD 50), se notează doar începutul CPE. În absența CPE în 3 pasaje consecutive de celule, al 4-lea pasaj este efectuat cu o încercare de a detecta virusul într-o cultură monostrat pe lamele de acoperire în IF. Cu o reacție negativă, cercetările ulterioare sunt oprite. Cu toate acestea, un rezultat negativ în acest caz nu dă dreptul de a face un diagnostic. Pentru a identifica astfel de tulpini, cercetătorii japonezi propun să utilizeze fenomenul de exaltare a virusului ND în prezența agentului patogen VD-BS. Esența metodei se reduce la apariția CPI în timpul cultivării în comun a acestor agenți în culturi celulare de țesut testicular de bovine. Metodologia cercetării este următoarea. Celulele dispersate de tripsină ale țesutului testicular al bovinelor sunt suspendate la o concentrație de 2106 celule per 1 ml în soluție 0,5% de GLAH cu ser de bovine testat pentru absența VNA la agentul patogen VD-BS. Suspensia este distribuită în eprubete de 0,5 ml. Fiecare dintre ele este inoculat cu 0,5 ml de material viral (diluat ID) și incubat la 37°C într-o poziție staționară înclinată. Ca martor, culturile neinoculate sunt incluse în fiecare experiment. După 4 zile de incubare, lichidul este îndepărtat și culturile sunt infectate cu virusul ND (106 PFU în 0,5 ml de mediu). După o incubare suplimentară de 3 zile la 37°C, culturile sunt examinate pentru prezenţa CPE. În culturile infectate inițial cu o tulpină necitopatogenă de VD, CPI clar exprimat apare după infectarea cu virusul ND. În culturile martor, virusul ND singur nu cauzează de obicei CPI. Culturile neinfectate care nu au fost injectate cu niciunul dintre agenții virali ar trebui să rămână normale.

Pentru trecerea tulpinilor necitopatogene, culturile inoculate cu virusul diareei din fiecare pasaj sunt incubate timp de 3 zile la 37°C, după care se colectează lichidul de cultură, care este folosit pentru treceri ulterioare, iar culturile sunt infectate cu ND. virus și în plus incubat pentru a indica VD folosind fenomenul de exaltare.

Infecția vițeilor. Un biotest pe viței se face în cazurile în care încercările de a izola un anumit virus au eșuat sau există îndoieli cu privire la prezența acestuia din cauza faptului că nu există CPI în culturile de celule infectate. Utilizați viței în vârstă de 2-6 luni, testați pentru absența VNA la VD, sau viței în vârstă de 4-6 zile, obținuți dintr-o fermă prosperă. Ca material pentru infecție, se folosește un lichid de cultură cu 3-5 pasaje, din care 5-10 ml se administrează intravenos. Dacă în materialul de testat există un virus al diareei, în a 4-7-a zi de la infectare, vițeii observă creșterea temperaturii, leucopenie, apariția secrețiilor mucoase din cavitatea nazală și diaree; unele animale pot avea tenesmus. În cazul unui rezultat pozitiv la animalele infectate, virusul poate fi izolat relativ ușor din sânge. În concentrația cea mai mare (10 3 -10 5 ID 50 /ml) virusul este depistat la 4 zile de la infectare, deși prezența lui în sânge este confirmată timp de 15 zile.

Identificarea serologică.

DACĂ. Similar cu cel din diagnosticul infecției cu adenovirus. Prin această metodă, VD AG este detectat în celulele membranei mucoase a rectului, splinei, plămânilor și ganglionilor limfatici ale animalelor infectate experimental. A fost studiată distribuția AH-VD-BS în țesuturile animalelor în cursul acut și cronic al bolii. În țesuturile limfoide, AG este localizat în celulele sistemului mononuclear fagocitar. Între detectarea inițială a hipertensiunii în mucoasa intestinală, epiteliul keratinizat divizii superioare sistemul digestiv și pielea și progresia semnelor patologice, există o perioadă latentă.

IF-ul materialului de biopsie al membranelor mucoase ale cavității bucale și nazale este potrivit pentru diagnosticarea timpurie a virusului diareei. IF pentru detectarea virusului antigen în celule din tampoane nazofaringiene - de încredere și drumul rapid detectarea animalelor infectate persistent cu virusul. În studiul preparatelor, se acordă atenție luminiscenței AG în citoplasma celulelor nedistruse. Fluorescența verde strălucitor sub formă de granule sau fluorescența difuză a citoplasmei în cel puțin 10% din celule ne permite să evaluăm medicamentul ca pozitiv. Un diagnostic preliminar se face în prezența a cel puțin 30% dintre medicamentele pozitive din numărul total de probe examinate. Metoda indirectă de IF folosind fragmente Pab conjugate de AB din serul porcin hiperimun împotriva VD-BS bovină s-a dovedit a fi convenabilă. Fluorescența specifică a AG viral în cultura de macrofage bovine a fost găsită în citoplasma celulelor. Pentru identificarea izolatelor necitopatogene, metoda IF este practic singura. În prezența CPE în culturile celulare infectate cu izolatul și fluorescența pozitivă, se realizează tiparea finală a virusului în RN.

RN. Aceasta este metoda principală de identificare a virusului. Noi izolate ale agentului patogen VB-BS, care nu au activitate citopatogenă, pot fi identificate folosind ser hiperimun la virusul diareei prin suprimarea fenomenului de exaltare a virusului ND, care este utilizat pentru a indica astfel de tulpini.

RDP. Oferă un diagnostic rapid și precis, totuși, până în prezent, sensibilitatea metodei este scăzută și ar trebui utilizată în combinație cu alte metode de diagnosticare de laborator și de identificare a agentului patogen. Pregătirea testului AG și procedura de înființare a RDP au fost descrise anterior. Antiserul pentru RDP este preparat pentru bovine. Pentru imunizarea animalelor se folosește sânge nitrat, prelevat aseptic de la animale infectate experimental în perioada de creștere a temperaturii. Sângele se administrează intravenos (unelor animale li se administrează mai multe astfel de injecții). Sângele se ia la 60-90 de zile după inoculare.

Detectarea virusului PCR. Această metodă este recomandată pentru diagnosticarea rapidă a VD-BS. După un ciclu de transcripție inversă, mostre de țesut dintr-o cultură de celule infectate. supuse amplificării folosind primeri care asigură replicarea unui segment specific al genei proteinei gp48 VD. Pentru a detecta secvențele amplificate, se utilizează electroforeza în PAAG și hibridizarea cu o sondă ADN biotinilat pe secvența genomului virusului leucemiei. La identificarea efectivelor de vaci de lapte infectate cu virusul bovin VD-BS, a fost propusă și o metodă PCR pentru lucrul cu mostre de lapte. ADN-ul viral este izolat din celulele somatice ale laptelui integral prin extracție cu izotiocianat de guanidină și fenol-cloroform. În infecția acută, ARN-ul viral a fost detectat la 6-10 zile după infecție, iar în infecția cronică, folosind ambii primeri (regiunea 5'-netranslated (S'-HT) și regiunea p80) până când laptele a fost diluat 1:640. PCR a fost de 14,6 ori mai sensibilă decât alte metode de izolare a virusului. Cel puțin 580 de celule somatice sunt necesare pentru a determina ARN-ul VD prin PCR, în timp ce cel puțin 8500 de celule sunt necesare pentru a izola virusul. Sensibilitatea și specificitatea PCR confirmate de hibridizarea Souzeren . Sensibilitatea metodei depășește de 10 2 -10 4 ori sensibilitatea izolării virusului în cultura celulară. A fost demonstrată posibilitatea detectării infecției persistente cu VD-BS bovine prin hibridizare ADN și PCR.

Sondele de ADNc biotinilat sunt deja utilizate pe scară largă pentru detectarea pestivirusurilor (CSV, VD-BS bovină și PBO). În Belgia, a fost dezvoltată o metodă pentru detectarea anticorpilor specifici la VD folosind ELISA efectuată cu AG recombinant și mAb. ELISA cu mAb este convenabil pentru detectarea viremiei la animale; a fost folosit pentru a detecta 2 proteine nestructurale înrudite (p80K și p120-130K) în leucocite. Viral AG a fost găsit în limfocitele B și T, monocite. În plus față de metoda ELISA convențională, a fost propus un test imunosorbant legat de enzime pentru capturarea antigenelor VD bovine în limfocitele din sângele periferic bovin. În reacția de captare a AG, mAb-urile sunt utilizate pentru domeniul AG conservat al proteinei nestructurale (p125/p80) a VD.

În plus față de ELISA, a fost dezvoltată și propusă o metodă pentru interacțiunea unui antiser specific cu antigenul viral VD în limfocitele animalelor infectate folosind citometria în flux. Metoda se caracterizează prin sensibilitate și specificitate ridicate. Pentru a crește sensibilitatea reacției, limfocitele sunt fixate, membranele lor celulare sunt solubilizate și AG viral este detectat folosind Ig biotinilată din antiserul de porc urmată de incubare cu FITC conjugat cu avidină.

ELISA. ELISA facilitează identificarea culturilor celulare infectate cu VD. Identificarea folosind mAbs nu a fost dezvoltată în aplicații practice de diagnosticare. Cu toate acestea, s-au obținut 5 mAb (XI A9, AEZE2, AM2G5, VT48, VT6G9) împotriva VD-BSV bovină cu activitate VL, ceea ce a făcut posibilă împărțirea izolatelor VD în 4 grupuri. A fost obținut și studiat un panou de mAb împotriva izolatului Singer, cu ajutorul căruia polipeptide de mol.m. 56-58 kD și se dovedește că glicoproteina este localizată pe suprafața virionilor și este un purtător al epitopilor neutralizanți. Analiza cu un panou mAb a arătat eterogenitatea AH între izolatele acestui virus.

Serodiagnosticul bolii este dificil deoarece curs cronic Infecțiile AT sunt detectate intermitent și apar la titruri mici. Diagnosticul unei infecții anterioare, precum și al unui purtător de virus latent, se face de obicei folosind pH-ul în cultura celulară, determinând titrurile de anticorpi din serul convalescenților. Pentru a face acest lucru, este mai bine să examinați serurile pereche luate la intervale de 3-4 săptămâni. La diagnosticarea cursului latent al infecției, se folosesc mai des serurile de sânge de la bovine sacrificate, care vin cu o clinică de infecție nediagnosticată a tractului intestinal și respirator. De obicei, în astfel de cazuri, procentul de seruri pozitive (titruri de la 1:16 la 1:128) variază foarte mult și poate ajunge la 30-50 (uneori până la 80). La animalele clinic sănătoase, procentul de probe pozitive poate varia de la 6-8 până la 20-30. Dinamica apariției și dispariției titrurilor VNA nu este bine înțeleasă. Înainte de studiu, serurile sunt încălzite într-o baie de apă la o temperatură de 57-58°C timp de 30 de minute.

În SUA, a fost dezvoltată o metodă cantitativă rapidă pentru titrarea VD a bovinelor. Constă în microtitrare folosind izolate de virus citopatogene și necitopatogene și o linie continuă de celule renale bovine - MDVA. Pentru a face acest lucru, în godeurile plăcilor Terasaki se toarnă diluții în serie ale lichidului care conține virus și o suspensie celulară la o concentrație de 1-10 5 într-un mediu cu 2% ser din sânge de cal și se efectuează microtitrarea în NIF, care se ia în considerare la fundul godeurilor plăcilor folosind un obiectiv de microscop cu imersie în apă. Virusul este, de asemenea, titrat prin formarea plăcii. Fluorescența specifică în celule a fost observată încă de la 12 ore după infectare, rezultatele finale au fost luate în considerare după 72 de ore de incubare. Rezultatele titrarii virusului in placi si in microtitrari au coincis. Microtitrarea virusului prin IF are o serie de avantaje față de metoda standard de titrare pe plăci: necesită mai puțin timp și materiale și este indispensabilă în special pentru titrarea izolatelor VD necitopatogene.

RN. Se stabilește prin diluarea serurilor de testare cu o doză constantă de virus standard în cultura de celule PEC sau TB. Serurile cu un titru AT de 1:16 și mai mare sunt considerate pozitive, în seruri pereche - o creștere a titrului AT în a doua probă cu un factor sau mai mult. În timpul infecției experimentale la toți vițeii după 15-61 de zile, VNA a fost găsit la un titru de 1:64 - 1:1024. Reacția, a cărei esență este de a suprima formarea plăcilor AT în serul de testare, s-a dovedit a fi potrivită pentru studiile serologice în VD-BS. După obținerea unui strat omogen de celule, cultura este spălată 1 dată cu o soluție tampon fosfat și infectată cu 15 ml de suspensie de virus într-o astfel de diluție încât 1 ml să conțină aproximativ 20 PFU. După adsorbția virusului la 37°C timp de 30 de minute, sushi-ul este aspirat și aplicat pe cultură cu 15 ml de agar. După ce agarul s-a solidificat, pe suprafața sa sunt așezate cercuri de hârtie de filtru saturate cu ser de testare nediluat. După 4 zile de incubare la 37°C se iau în considerare rezultatele. Dovada că serul studiat conține AT este absența deteriorării stratului celular din jurul cercului de hârtie de filtru saturată cu acesta, care se găsește sub formă vena celulelor.

RSK. Ele sunt puse prin micrometoda folosind un microtitru Takachi sau Titertek. În absența acestora, este posibil să se instaleze RSC în eprubete într-un volum total de 0,5 ml.

RDP. Nu și-a găsit aplicație largă în practica de diagnostic veterinar la detectarea anticorpilor în serurile animale. PA apare relativ târziu (3-4 săptămâni) după infecție și poate persista timp de 4 luni (titruri AT până la 1:16).

ELISDAR. De 500 de ori mai sensibil decât pH-ul, consumă mai puțin timp și este mai rapid de finalizat. Ca AG, a fost utilizat un virus concentrat cu PEG și purificat prin echilibru gradient prin ultracentrifugare. Concentrația optimă de AG a fost de 1 μg per godeu.

Diagnostic diferentiat. Atunci când se pune un diagnostic de VD-PS, este necesar să se excludă RTI, infecția cu adenovirus, PG-3, febră catarrală malignă, febra aftoasă, paratuberculoză etc. Datorită faptului că VD-PS se poate manifesta în diverse forme (de la acute la latente), se asociaza adesea cu infectii precum PG-3, adenoinfectie, chlamydia etc., pentru diagnosticul final sunt necesare analize de laborator. Numai ca o suspiciune de VD-BS ar trebui să se ia în considerare răspândirea rapidă a bolii în turmă, însoțită de febră, diaree, eroziuni în cavitatea bucală și leucopenie precoce.

Diagnosticul de laborator al parainfluenza -3 la bovine

Parainfluenza-3 (PG-3) a bovinelor (febra transportului bovinelor, parainfluenza-3) este o boală virală acută contagioasă, în principal la viței, caracterizată prin afectarea sistemului respirator.

În prezent, PG-3 este înregistrat în toate țările lumii cu creșterea animalelor dezvoltată.

Diagnosticul de laborator include: a) depistarea AG în material patologic (frotiuri, amprente, secțiuni) obținut de la animalele bolnave din REEF; b) izolarea agentului patogen din materialul patologic din cultura de celule de rinichi embrionar de bovine (ECK) sau de plămân fetal bovin (LEK) și identificarea acestuia în RTHA, RIF etc.; c) detectarea anticorpilor în serul sanguin al animalelor bolnave și recuperate (diagnosticare retrospectivă) în RTGA. Diagnosticarea de laborator a PG-3 este efectuată folosind un set de truse de diagnostic produse de industria biologică. De obicei, se realizează în paralel cu studiul materialului pentru infecții cu adenovirus și RS, IRT și VD-BS la bovine. Schema de realizare a cercetării asupra PG 3 este similară cu schema de diagnosticare a infecției adenovirale la bovine. Diagnosticul preliminar: PG-3 este diagnosticat în 2-3 zile pe baza rezultatelor pozitive ale depistarii hipertensiunii în materialul patologic din RIF, ținând cont de datele epizootologice și clinice, și de asemenea modificări patologice, iar finalul - în 10-30 de zile pe baza coincidenței rezultatelor RIF cu izolarea și identificarea virusului. În prezent, PCR poate fi utilizată pentru indicarea rapidă a virusului PG-3; d) detectarea unei creșteri de 4 ori sau mai mult a AT în probele de ser pereche.

Izolarea virusului. Datorită rezistenței scăzute a virusului parainfluenza, se recomandă plasarea materialului de testat în recipiente cu gheață obișnuită, livrarea imediată la laborator și utilizarea imediată pentru infectarea culturii celulare. Dacă acest lucru nu este posibil, materialul trebuie congelat într-un amestec de gheață carbonică și alcool și păstrat la -20-60°C până la examinare.

HSV-3 este izolat în subculturi de celule primare de PEC, LEC, PT, TB etc., care sunt preparate conform metodei general acceptate. Pentru virusurile paragripale este caracteristică natura difuză a RAd, care se manifestă mai devreme decât CPE-ul virusului.

Primul CPI al unei culturi infectate poate fi observat uneori la 48 de ore după inoculare. Ele constau în apariția unor celule rotunjite care refractează lumina mai puternic, mai târziu se formează sincitiul și degenerarea celulară. Dacă rezultatul este negativ în primul pasaj, se efectuează un al doilea pasaj pe același tip de cultură celulară. În paralel cu culturile în eprubetă, este cultivat și pe lamele pentru IF. În total, sunt recomandate cel puțin 4 pasaje „oarbe”. Un izolat este considerat izolat dacă induce CPP stabil de același tip și GAD pozitiv. În acest caz, poate fi identificat în RTGAd, RN, RTGA și alte reacții. Metoda de izolare a virusului pe embrioni este mai puțin sensibilă decât infecția culturilor celulare și este folosită relativ rar.

Infecția animalelor susceptibile în mod natural. Aplicați rar din cauza; cost ridicat și dificultate mare în selectarea vițeilor susceptibili la PG-3 care nu au anticorpi specifici. Infectarea animalelor susceptibile cu virusul PG-3 se aplică cel mai bine pe membrana mucoasă a cavității nazale și a traheei. De la vițeii infectați experimental, virusul poate fi izolat din exudatul cavității nazale în timpul creșterii temperaturii sau din sânge în a 4-a zi după intranazală și în a 2-a zi după infecția intravenoasă. Odată cu expirația nazală, virusul este de obicei eliminat din a 2-a până în a 10-a zi.

Indicație și virus. În celulele HeLa și KB, virusul se înmulțește mai puțin activ decât în celulele rinichilor de vițel. În cultura acestor celule, precum și a celulelor de rinichi de maimuță, pe lângă sincițiu, virusul provoacă formarea de incluziuni citoplasmatice și uneori intranucleare. Ele se găsesc și în celulele epiteliale ale bronhiilor și bronhiolelor.

Pentru indicarea accelerată a virusurilor RTI, stafilococii PG-3 sunt tratați cu ser imun. Se prepară un frotiu pe care se aplică materialul care conține virusul testat, se tratează cu ser antiviral imun și imunoglobulină specifică virusului marcată cu FITC. În funcție de strălucirea specifică de pe suprafața stafilococului, virusul este indicat. Când se utilizează metoda accelerată de indicare, timpul de indicare este redus la 3-4 ore.

Identificarea serologică

RECIF. Practic, AG este localizat în citoplasma celulelor, cu toate acestea, în stadiile incipiente ale infecției, se observă simultan luminiscența nucleolilor. Hipertensiunea paragripală este detectată în primele zile de boală și până la 10-14 zile. În formele complicate ale bolii, hipertensiunea este detectată mai mult timp. În unele cazuri, poate fi depistat chiar și în perioada de incubație, cu 1-2 zile înainte de apariția simptomelor clinice. Specificitatea IF este de 94% în comparație cu rezultatele unui studiu serologic. Există o opinie fără echivoc despre sensibilitatea mai mare a FI comparativ cu RGAD în indicarea virusurilor paragripale, ceea ce îl face promițător pentru diagnosticarea rapidă.

RTGAd. Este o metodă rapidă de identificare a virusului izolat. Pentru aceasta se folosesc seruri imune de iepuri sau cobai. RTGAd este stabilit prin metoda general acceptată cu eritrocite de cobai. Virusul investigat este considerat identificat dacă serul imun la PG-3 blochează hemadsorbția.

RNGAad. Sunt utilizate 100 GAd de unități de virus. Conform reacției de hemadsorbție, virusul PG-3 poate fi titrat în cultura de țesut folosind diluții în serie de 10 ori pentru a infecta cultura. După 3 zile de incubație, RHAd este plasat cu conținutul tuturor tuburilor și se înregistrează prezența hemadsorbției. O unitate GAd este luată ca diluție finală a virusului care a cauzat hemadsorbția. RGAd pozitiv în tuburile de control, absența reacției în tuburi cu un amestec de virus și ser indică identitatea virusului izolat cu acest tip de ser.

RTGA. Este utilizat pentru tipizarea virusului izolat în prezența hemaglutininei în fracția lichidă a culturilor de celule infectate într-un titru suficient pentru a selecta 4 HAU. Trebuie avut în vedere faptul că virusul parainfluenza crescut într-o cultură de celule renale bovine aglutinează eritrocitele gâștelor, curcanilor și cobaiilor, spre deosebire de eritrocitele de găină și rațe. Aglutinarea se dezvoltă în următorii termeni: eritrocite de gâște în 1-3 minute, curcani în 2-5 minute, cobai în 60-90 de minute. Titrurile cele mai mari și mai stabile sunt detectate cu eritrocitele de curcan și la valori ale pH-ului: eritrocitele de gâște la 5,7; curcan 5,7-7,2; cobai 6,8-7,2. Serurile imune utilizate în RTGA trebuie să fie eliberate de inhibitori termolabili și termostabili; pentru aceasta, serurile sunt încălzite la 56 ° C timp de 30 de minute și tratate cu caolin sau filtrat Vibrio cholerae. RTGA este stabilit prin metoda general acceptată.

Identificare ELISA. Angajații VNITIBP au dezvoltat o metodă de identificare a virusului PG-3 în ELISA.

Imunodifuzia (ID) poate fi utilizată cu succes pentru a diagnostica infecția PG-3. ID a evidențiat 2 linii de precipitații, care corespund celui de-al doilea AG PG-3.

Serodiagnostic și diagnostic retrospectiv.În diagnosticul serologic al PG-3 la bovine, serurile pereche de viței sau animale adulte sunt examinate pentru a detecta o creștere a anticorpilor. Intervalul dintre prelevare este de 2-3 săptămâni. RGA, RN, RZGAd și RSK dau rezultate în general identice în studiul anticorpilor în timpul dezvoltării bolii și convalescenței. Cu toate acestea, RTGA este cel mai sensibil și cel mai simplu. Pe lângă studiul serurilor de sânge pereche, în serodiagnosticul PG-3 se recomandă o metodă de depistare a anticorpilor secretori în RTHA. Pentru a face acest lucru, prelevați mostre pereche de secreții nazale de la 8-10 animale care au prezentat semne clinice ale bolii (febră, scurgere din cavitatea nazală etc.) și repetați studiul după 6-8 zile.

Înainte de RTGA, probele sunt dezghețate, centrifugate timp de 10 minute la 2.000 min-1, apoi tratate după cum urmează: 0,2 ml dintr-o suspensie 20% de eritrocite de cobai se adaugă la 0,2 ml de supernatant, se agită și se incubează timp de 30 minute la 4°C, 10 min centrifugare la 1500 min-1; supernatantul într-un volum de 0,3 ml se amestecă cu o suspensie 25% de caolin într-o soluție fiziologică, se agită 25 minute, se centrifuge 15 minute la 2000 min-1. După aceea, supernatantul este utilizat în RTGA.

Un rezultat pozitiv al studiului asupra PG-3 este considerat în cazul detectării AT în a 2-a probă de secreții nazale la un titru de 1:16 și mai sus (în absența titrurilor de AT în prima probă) sau un 4 -creștere de ori sau mai mult a titrului de AT la a 2-a probă de secreții nazale comparativ cu a 1-a.

Dacă RNGAd este pozitiv în controalele virusului (tuburi cu cultură celulară, unde virusul a fost introdus într-o diluție de lucru cu un volum egal de mediu nutritiv), absența acestuia în eprubete, în care un amestec de una sau alta diluție de a fost turnat ser și virus, se ia în considerare. Diagnosticul este o creștere de nu mai puțin de 4 ori a anticorpilor neutralizanți de hemadsorbție în serul convalescent în comparație cu serul administrat la debutul bolii. RSK nu a găsit o aplicare largă în practica de diagnostic veterinar.

Perioada maximă de detectare a anticorpilor în serul sanguin al vițeilor după infectarea cu virusul PG-3 nu a fost stabilită cu precizie. O serie de cercetători cred că anticorpii persistă timp de 4-6 luni. Nivelul de formare a VNA și anti-HA a atins un vârf de 1:320 și mai mare la 14-21 de zile după infecție. ELISA este utilizat pe scară largă în străinătate pentru indicarea și titrarea anticorpilor. Este de 4-64 de ori mai sensibil decât RTGA.

Diagnostic diferentiat. Când se face un diagnostic de PG-3, este necesar să se excludă infecțiile RTI, VD-BS, adeno- și RS, care au date epizootologice, clinice și patologice foarte asemănătoare. Prin urmare, materialul primit cu suspiciune de PG-3 este examinat în laborator în paralel pentru toate infecțiile de mai sus.

laborator diagnosticul de leucemie

Leucemia bovină este o boală infecțioasă cronică de natură tumorală, al cărei simptom principal este o proliferare malignă a celulelor organelor hematopoietice cu o încălcare a maturizării acestora, ducând la infiltrarea difuză a organelor de către aceste celule sau apar tumori.

Leucemiile animale sunt diagnosticate în aproape toate țările lumii. Acestea sunt cel mai larg răspândite în Statele Unite, o serie de țări din Europa Centrală, Danemarca, Suedia și țările din Orientul Mijlociu.

În țara noastră, apariția leucemiei este asociată cu importul de reproducție în anii 1940, 1945-1947. din Germania până la fermele din Siberia de Vest, Moscova, Leningrad, regiunile Kaliningrad, precum și Ucraina, Letonia și Lituania. Ulterior, leucemia s-a răspândit în regiunile Tadjikistan, Pskov, Novgorod.

În condiții naturale, VLKRS este comună printre bovine, oi, zebu și bivoli.

Virusul leucemiei bovine (BLV) aparține familiei Retroviridae, un gen de retrovirusuri ale leucemiei bovine și ale leucemiei cu celule T umane. VLKRS are o activitate antigenică pronunțată și induce sinteza VNA și KSA. Proprietăți GA. VLKRS aglutinează numai eritrocitele de șoarece

Diagnosticul de leucemie se face pe baza datelor epidemiologice, a semnelor clinice, a modificărilor patologice și a rezultatelor de laborator, care includ studii hematologice și histologice, precum și serologice.

Principalele caracteristici ale unor retrovirusuri

Toate formele de leucemie se caracterizează printr-o creștere în diferite grade a ganglionilor limfatici. În cazul leucemiei limfocitare, acestea sunt mărite uniform, nu se contopesc cu țesuturile înconjurătoare, capsula se îndepărtează cu ușurință, pe tăietură, nodurile sunt gri-alb, suculenți și grasi. Ganglionii limfatici cu limfogranulomatoză, limfosarcom și sarcom histiocitar sunt tuberoși, capsula este fuzionată cu parenchimul, hemoragii și necroze se găsesc adesea pe tăietură; în organele cavităților abdominale, pelvine, pe membranele seroase, se observă creșteri tumorale ale nodurilor sub formă de conglomerate gri-alb, galben-gri. Splina este mărită în leucemia limfoidă și mieloidă. În primele 2 forme, este de culoare maro-roșu cu o pulpă distinctă roșie și albă din cauza hiperplaziei foliculare. Într-o etapă ulterioară a bolii, granița dintre pulpa albă și roșie este ștearsă. Cu leucemia mieloidă, splina este de culoare roșie-purie, foliculii sunt slab vizibili, iar în unele zone sunt absenți, țesutul este lax în consistență cu hemoragii. În limforeticulosarcom, splina nu este mărită. În toate formele de leucemie, în ficat, rinichi, mușchi mai gros al inimii, organe digestive, uter, mușchi scheletici, diafragmă și alte organe, sunt observate creșteri focale sau difuze de culoare gri-alb sau gri-roz.

Preluarea și pregătirea materialului. Pentru examinarea hematologică, sângele este prelevat dintr-o venă temporară în eprubete cu un anticoagulant - soluție 10% de sare disodică a acidului etilendiaminotetraacetic (EDTA, Trilon B) la o rată de 0,02 ml de soluție la 1 ml de sânge. Nu este permisă prelevarea de sânge de la animale cu 15 zile înainte de fătare și cu 15 zile după aceasta. Pentru testarea serologică se prelevează sânge de la animale cu vârsta de 6 luni și mai mult. 5-6 ml de ser se trimit la laborator intr-un termos cu gheata. Pentru examinarea histologică, bucăți din organele afectate (splină, ganglioni limfatici, stern, ficat, rinichi, plămâni, inima și auriculul drept al mușchiului inimii, peretele abomasului, uterul și mușchii scheletici) sunt trimise proaspete într-un termos cu gheață sau în 10% r -re formol.